TNIP1基因多態(tài)性與中國北方漢族尋常性銀屑病關聯(lián)性分析

韓建文 白云花 孫志強 阿拉騰楚魯 劉佳 呂新翔 烏日娜

銀屑病是一種以紅斑、鱗屑為主要表現(xiàn)的慢性炎癥性皮膚病，遺傳因素在銀屑病發(fā)病中起到重要作用［1-2］，在中國患病率為 0.47%［3］。近年來遺傳關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)一大批銀屑病相關的易感基因［4-6］。特別是一些易感基因與其他自身免疫病有重疊（例如潰瘍性結腸炎、克隆病、強直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乳糜瀉等）［1］。參與核因子 κB（NF-κB）病理通路的人腫瘤壞死因子α誘導蛋白3（TNFAIP3）相互作用蛋白1（TNIP1）基因在不同人種的多項研究中均有報道，包括中國北方漢族人群［7-8］。為研究TNIP1基因與中國漢族人群相關性，我們選擇位于TNIP1基因區(qū)域的3個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP），利用連接酶檢測反應（ligase detection reaction，LDR）對其進行基因分型，探討其與尋常性銀屑病的相關性。

對象和方法

一、對象

1.研究對象：從內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院收集尋常性銀屑病患者465例，年齡（42.40±17.67）歲，發(fā)病年齡（30.91±14.36）歲；男女比例為294/171。健康對照476例，年齡（38.10±16.00）歲，男女比例為225/251。所有研究對象均為漢族人。經知情同意并簽字后抽取外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有患者經臨床及病理診斷，符合尋常性銀屑病診斷標準。健康對照排除銀屑病及其他自身免疫疾病，排除銀屑病家族史。本研究經過內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，并在實施過程中遵守赫爾辛基宣言。

2.SNP選擇：根據(jù)既往文獻選擇3個SNP（rs17728338、rs3762999和rs999556）進行分型實驗［7-9］。

二、方法

1.基因組DNA提取：利用AxyPrep,AP-MX-BLGDNA-25基因組DNA提取試劑盒提取患者及對照基因組DNA，利用分光光度儀檢測260和280 nm吸光度，計算DNA濃度。并利用凝膠電泳檢測DNA質量，所有DNA樣本均合格。

2.引物及探針的合成：利用Primer 3 online（Version 0.4.0）軟件（http://frodo.wi.mit.edu/）和 Oligo（Version 6.31）（Molecular Biology Insights Inc.,USA）軟件設計特異性引物和LDR探針，針對每個SNP位點設計2條引物，盡量保證所有SNP位點引物的T值相同，PCR引物序列見表1。根據(jù)LDR探針設計原則設計LDR的上下游探針［10-11］，上游探針5′端用磷酸化修飾，LDR探針序列見表2。

3.多重 PCR：PCR 反應體系（20 μl）為：1μl模板 ，2 μl 緩沖液 ，0.6 μl Mg2+，2 μl dNTP，0.2 μl TaqDNA聚合酶，2 μl引物混合液，加水補足。PCR反應條件：95℃預變性2min，94℃30s，56℃退火1.5min，65℃30 s，35個循環(huán)。最后65℃延伸10 min。

4.多重 LDR：LDR 反應體系 （10 μl） 為：1 μl Buffer緩沖液，1 μl探針混合液，0.05 μl Taq DNA 連接酶，4 μl PCR 產物，加水補足 10 μl。探針混合液濃度為2 μmol/L。LDR反應條件：95℃2 min預變性，94℃ 15 s，50℃ 25 s，進行 40個循環(huán)。

表1 針對不同單核苷酸多態(tài)性的PCR引物序列

表2 針對不同單核苷酸多態(tài)性的連接酶檢測反應探針序列

5.測序與基因分型：反應產物經過ABI3730測序儀測序分析，最后用Genemapper軟件進行數(shù)據(jù)分析，判讀各位點上各樣本的基因分型。

6.統(tǒng)計分析：所有SNP分型數(shù)據(jù)質控、統(tǒng)計分析利用PLINK 1.07軟件完成（http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/）［12］。計算 3 個 SNP 的等位基因頻率，在病例組及對照組中分別進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗?？ǚ綑z驗比較病例組及對照組等位基因頻率及基因型頻率，并計算等位基因的相對危險度估計值比值比OR及其95%可信區(qū)間（95%CI）。對3個SNP間進行連鎖不平衡檢驗，計算兩兩間的r2和D′值。根據(jù)患者發(fā)病年齡（早發(fā)型：發(fā)病年齡＜40歲；晚發(fā)型：發(fā)病年齡≥40歲）及有無銀屑病家族史進行分層分析。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側概率檢驗，根據(jù)Bonferroni多重檢驗校正原理，P＜0.0167（0.05/3）為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、樣本及SNP質控

病例組及對照組在性別及年齡分布方面差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。3個SNP在病例及對照中均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。

二、等位基因頻率及基因型頻率比較

rs17728338等位基因頻率在尋常性銀屑病組及各型病例組均顯著高于對照組（P＜0.016 7）。rs3762999和rs999556等位基因頻率在尋常性銀屑病組和對照組間差異未達到Bonferroni校正水平，但是有家族史組顯著高于對照組（P＜0.0167）。見表3、4。

在不同遺傳模式下比較病例組和對照組間基因型頻率，發(fā)現(xiàn)在顯性遺傳模式下，3個SNP的基因型頻率在兩組間差異有統(tǒng)計學意義，而在隱形遺傳模式下差異無統(tǒng)計學意義。分層分析顯示，在顯性遺傳模式下，早發(fā)型、晚發(fā)型、有家族史、無家族史病例組rs17728338基因型頻率與對照組間差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.016 7）。顯性模式下，rs3762999和rs999556基因型頻率在有家族史組與對照組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.016 7）；rs999556基因型頻率在早發(fā)型病例組與對照組間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.01）。見表 5、6。

三、3個SNP間的連鎖不平衡分析

rs3762999與rs999556間存在強連鎖不平衡（r2=0.91，D′=0.98），rs17728338 與 rs3762999 和rs999556之間有中等程度的連鎖不平衡（r2分別為0.37 和 0.35，D′分別為 0.99 和 1.00）。

討 論

最早Nair等［8］在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)TNIP1與銀屑病的相關性，此后在多項研究中得到證實。2010年Sun等［7］首次報道中國人群中TNIP1與銀屑病的相關性，Yang等［9］也得出相同的結果，并且發(fā)現(xiàn)rs17728338與關節(jié)病性銀屑病也具有相關性，其等位基因A的頻率在中國人群（0.089）高于歐洲人群（0.056）［7-9］，但根據(jù)OR值看出其對疾病的影響均為增加患病風險。我們分層分析發(fā)現(xiàn)，rs17728338的基因型頻率在早發(fā)型、晚發(fā)型、有家族史、無家族史尋常性銀屑病組與對照組間差異均有統(tǒng)計學意義，而且均顯示為顯性遺傳模式。Sun等［7］除發(fā)現(xiàn)rs17728338的相關性外，還發(fā)現(xiàn)另外2個位于TNIP1基因區(qū)域的SNP（rs3762999和rs999556）與銀屑病也具有相關性。在本研究結果中，rs3762999和rs9995562等位基因頻率在銀屑病組和健康對照中存在差異，但是經過多重檢驗校正后差異無統(tǒng)計學意義。在不同遺傳模式下統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)在顯性遺傳模式下這2個SNP的基因型頻率在病例組和對照組間差異有統(tǒng)計學意義，并且達到Bonferroni校正水平（P＜0.016 7）。rs3762999和rs9995562基因型頻率在有家族史組與對照組間差異有統(tǒng)計學意義。患者發(fā)病年齡分層分析顯示，只有rs9995562與早發(fā)型相關，未發(fā)現(xiàn)rs3762999的相關性。這些結果提示，家族史陽性是尋常性銀屑病發(fā)病的一個明顯的易感因素，TNIP1基因多態(tài)性對家族史陽性患者發(fā)病風險的影響更大，并且這種影響在顯性遺傳模式下更為顯著。查詢rs3762999及rs999556在既往研究中的等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)本研究中這2個SNP的等位基因頻率與Sun等［7］的報道類似。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，rs17728338與rs3762999及rs999556兩個SNP均具有中等程度的連鎖不平衡。以上結果提示這3個SNP可能代表同一個關聯(lián)信號。

表3 尋常性銀屑病患者rs17728338、rs3762999和rs999556等位基因頻率分析

表4 尋常性銀屑病和對照組中rs17728338、rs3762999和rs999556基因型分布及分層分析

表5 顯性模式下尋常性銀屑病和對照組中rs17728338、rs3762999和rs999556基因型分布及分層分析

表6 隱性模式下尋常性銀屑病和對照組中rs17728338、rs3762999和rs999556基因型分布及分層分析

TNIP1基因位于5q32-q33.1，其信使 RNA（mRNA）廣泛表達于外周白細胞、脾臟、骨骼肌及腎臟。編碼蛋白A20結合NF-κB抑制蛋白1（ABIN1）與其配體A20蛋白結合參與NF-κB的抑制。TNIP1基因過表達可以通過抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）而抑制 NF-κB 活性［13］。TNIP1 還可以不依賴 A20 而抑制 TNF 介導的細胞凋亡［14-15］。此外涉及 NF-κB 病理通路的其他基因的變異也與銀屑病具有關聯(lián)性，例如禽網狀內皮組織增殖病毒癌基因V-Rel同源基因 （REL）［16-17］、核因子 κB 抑制蛋白 α 亞基（NFKB1A）［18-19］及 TNFAIP3［8］。其中 TNIP1 和 TNFAIP3也是多種自免疫相關疾病的易感基因，包括類風濕性關節(jié)炎、乳糜瀉、潰瘍性結腸炎、克隆病、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等［20-21］。這些遺傳學證據(jù)提示，NF-κB病理通路可能是銀屑病發(fā)病過程中一個重要的環(huán)節(jié)。最近研究顯示，TNFAIP3基因多態(tài)性與銀屑病患者對TNF拮抗劑的治療反應相關［22］。是否TNIP1也具有類似作用，還需要進一步研究。

我們通過對TNIP1基因區(qū)域rs17728338與rs3762999和rs999556三個SNP進行分型研究，證實其與中國漢族人尋常性銀屑病的相關性，更進一步提示TNIP1基因在銀屑病發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的作用。但是本研究尚有一些不足之處，第一，本研究基于單個基因的多態(tài)性進行關聯(lián)分析，基因-基因間復雜交互作用未能明確，而龐大的基因網絡中相互作用非常廣泛和復雜，這些遺傳變異與疾病易感性的相關性是否會受到其他基因的影響尚不能確定；第二，這3個多態(tài)性并非影響基因表達的功能變異，TNIP1基因多態(tài)性如何影響其基因功能以及免疫系統(tǒng)功能，仍需要進一步研究。

［1］Tsoi LC,Spain SL,Knight J,et al.Identification of 15 new psoriasis susceptibility loci highlights the role of innate immunity ［J］.Nat Genet,2012,44（12）:1341-1348.

［2］Ellinghaus E,Ellinghaus D,Stuart PE,et al.Genome-wide association study identifies a psoriasis susceptibility locus at TRAF3IP2［J］.Nat Genet,2010,42（11）:991-995.

［3］丁曉嵐,王婷琳,沈佚葳.中國六省市銀屑病流行病學調查［J］.中國皮膚性病學雜志,2010,24（7）:598-601.

［4］Elder JT.Genome-wide association scan yields new insights into the immunopathogenesis of psoriasis［J］.Genes Immun,2009,10（3）:201-209.

［5］Zhang X.Genome-wide association study of skin complex diseases［J］.J Dermatol Sci,2012,66（2）:89-97.

［6］Chandran V.The genetics of psoriasis and psoriatic arthritis［J］.Clin Rev Allergy Immunol,2013,44（2）:149-156.

［7］Sun LD,Cheng H,Wang ZX,et al.Association analyses identify six new psoriasis susceptibility loci in the Chinese population［J］.Nat Genet,2010,42（11）:1005-1009.

［8］Nair RP,Duffin KC,Helms C,et al.Genome-wide scan reveals association of psoriasis with IL-23 and NF-kappaB pathways［J］.Nat Genet,2009,41（2）:199-204.

［9］Yang Q,Liu H,Qu L,et al.Investigation of 20 non-HLA（human leucocyte antigen）psoriasis susceptibility loci in Chinese patients with psoriatic arthritis and psoriasis vulgaris［J］.Br J Dermatol,2013,168（5）:1060-1065.

［10］Thomas G,Sinville R,Sutton S,et al.Capillary and microelectrophoretic separations of ligase detection reaction products produced from low-abundant point mutations in genomic DNA［J］.Electrophoresis,2004,25（10-11）:1668-1677.

［11］Yi P,Chen Z,Yu L,et al.Development of a PCR/LDR/capillary electrophoresis assay with potential for the detection of a betathalassemia fetal mutation in maternal plasma ［J］.J Matern Fetal Neonatal Med,2010,23（8）:920-927.

［12］Purcell S,Neale B,Todd-Brown K,et al.PLINK:a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses［J］.Am J Hum Genet,2007,81（3）:559-575.

［13］Verstrepen L,Carpentier I,Verhelst K,et al.ABINs:A20 binding inhibitors of NF-kappa B and apoptosis signaling ［J］.Biochem Pharmacol,2009,78（2）:105-114.

［14］Oshima S,Turer EE,Callahan JA,et al.ABIN-1 is a ubiquitin sensor that restricts cell death and sustains embryonic development［J］.Nature,2009,457（7231）:906-909.

［15］Verstrepen L,Carpentier I,Beyaert R.The biology of A20-binding inhibitors of NF-kappaB activation （ABINs）［J］.Adv Exp Med Biol，2014,809:13-31.

［16］Ali FR,Barton A,Smith RL,et al.An investigation of rheumatoid arthritis loci in patients with early-onset psoriasis validates association of the REL gene［J］.Br J Dermatol,2013,168（4）:864-866.

［17］Genetic Analysis of Psoriasis Consortium&the Wellcome Trust Case Control Consortium 2,Strange A,Capon F,et al.A genomewide association study identifies new psoriasis susceptibility loci and an interaction between HLA-C and ERAP1 ［J］.Nat Genet,2010,42（11）:985-990.

［18］Stuart PE,Nair RP,Ellinghaus E,et al.Genome-wide association analysis identifies three psoriasis susceptibility loci［J］.Nat Genet,2010,42（11）:1000-1004.

［19］Li Y1,Cheng H,Zuo XB,et al.Association analyses identifying two common susceptibility loci shared by psoriasis and systemic lupus erythematosus in the Chinese Han population ［J］.J Med Genet,2013,50（12）:812-818.

［20］Maxwell JR,Gowers IR,Wilson AG.Complex genetic association of 6q23 with autoimmune rheumatic conditions ［J］.Arthritis Res Ther,2009,11（2）:107.

［21］Ramos PS,Criswell LA,Moser KL,et al.A comprehensive analysis of shared loci between systemic lupus erythematosus （SLE）and sixteen autoimmune diseases reveals limited genetic overlap［J/OL］.PLoS Genet,2011,7（12）:e1002406［2011-12-08］.http://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1002406.

［22］Tejasvi T,Stuart PE,Chandran V,et al.TNFAIP3 gene polymorphisms are associated with response to TNF blockade in psoriasis［J］.J Invest Dermatol,2012,132（3 Pt 1）:593-600.