急性冷應(yīng)激對(duì)中華鱉幼鱉Vc合成能力和組織Vc含量的影響

龔 勛， 牛翠娟， 錢美亞， 周勇相， 王 丹

(1.貴州理工學(xué)院輕工工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550003； 2.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100875；3.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)工程學(xué)院，貴州畢節(jié) 551700)

?

急性冷應(yīng)激對(duì)中華鱉幼鱉Vc合成能力和組織Vc含量的影響

龔 勛1,2,3， 牛翠娟2*， 錢美亞2， 周勇相3， 王 丹3

(1.貴州理工學(xué)院輕工工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550003； 2.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100875；3.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)工程學(xué)院，貴州畢節(jié) 551700)

以中華鱉幼鱉為研究對(duì)象，研究了急性冷應(yīng)激對(duì)中華鱉幼鱉內(nèi)源Vc合成能力和不同組織Vc含量的影響。在水溫(29±1) ℃條件下，用不添加Vc的基礎(chǔ)飼料對(duì)中華鱉幼鱉(體重(206.31±28.33)g)進(jìn)行投喂，馴化3周后開始急性冷應(yīng)激試驗(yàn)，應(yīng)激條件為(13±0.7) ℃，6 h。結(jié)果表明，幼鱉在急性冷應(yīng)激6 h后GLO活力較冷應(yīng)激前有所升高，但未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。冷應(yīng)激前后肝臟組織Vc含量與腦組織Vc含量均未發(fā)生顯著變化。此外，雌性幼鱉與雄性幼鱉的GLO活力存在較大差異，但由于樣本量偏少，尚不能斷定是否確實(shí)存在這種性別差異。急性冷應(yīng)激對(duì)幼鱉的Vc合成能力具有一定的促進(jìn)作用，對(duì)肝臟組織Vc含量與腦組織Vc含量沒(méi)有顯著影響。

急性冷應(yīng)激；L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶；組織Vc含量；中華鱉

中華鱉(Pelodiscussinensis)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物，具有較高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值。目前，已在中華鱉腎臟中檢測(cè)到L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶(L-gulonolactone oxidase，GLO)活性，表明中華鱉具有內(nèi)源Vc合成能力[1]。研究表明，動(dòng)物在脅迫環(huán)境下內(nèi)源Vc不能滿足正常生命活動(dòng)需要，日糧中添加Vc可以降低糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇或皮質(zhì)酮)分泌，避免因其分泌濃度過(guò)高而產(chǎn)生的免疫抑制作用，從而提高抗應(yīng)激能力[2]。Zhou等在觀測(cè)外源包膜Vc對(duì)中華鱉應(yīng)激反應(yīng)的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激后對(duì)照組皮質(zhì)醇水平顯著升高，而Vc添加組皮質(zhì)醇水平?jīng)]有顯著變化[3]。飼料中添加500 mg/kg的Vc多聚磷酸酯，有助于鱘魚對(duì)LPS造成的應(yīng)激反應(yīng)[4]。大量研究表明，飼料Vc的添加對(duì)動(dòng)物的免疫力和抗應(yīng)激能力的提高具有一定的促進(jìn)作用[2-6]。但如果飼料中不添加外源Vc，僅靠中華鱉自身生產(chǎn)的內(nèi)源Vc是否也能滿足其在應(yīng)激條件下的生理需求則有待研究。研究表明，應(yīng)激會(huì)影響某些動(dòng)物內(nèi)源Vc 的合成能力與組織Vc分布。肉仔雞在熱應(yīng)激狀態(tài)下血漿Vc含量降低，肝臟Vc合成能力下降，據(jù)此推測(cè)在應(yīng)激狀態(tài)下動(dòng)物體的GLO活力會(huì)受到抑制[7]。動(dòng)物在遭受氧化脅迫和饑餓應(yīng)激時(shí)GLO活力均會(huì)受到影響，饑餓應(yīng)激會(huì)顯著抑制仔雞的GLO活力[8]。饑餓應(yīng)激會(huì)顯著降低豚鼠脾臟、肝臟和腎上腺的Vc含量[9]。此外，饑餓應(yīng)激對(duì)GLO活力的影響具有物種特異性。饑餓會(huì)降低大鼠的GLO活力，而對(duì)灰松鼠則無(wú)顯著影響[10]。目前，有關(guān)應(yīng)激對(duì)中華鱉自身Vc合成能力和組織Vc含量的影響的研究甚少。筆者研究了沒(méi)有外源Vc補(bǔ)充的情況下中華鱉幼鱉在急性冷應(yīng)激下其自身內(nèi)源Vc合成能力與組織Vc含量的變化，評(píng)估了急性冷應(yīng)激對(duì)幼鱉Vc需求的影響，從而為龜鱉Vc營(yíng)養(yǎng)生理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)用鱉為2齡幼鱉(前1年孵化)，馴養(yǎng)在80 cm×35 cm×30 cm大小的玻璃缸中。每缸均為2只鱉，水深約15 cm，水溫為(29±1) ℃，養(yǎng)殖用水為曝過(guò)氣的自來(lái)水，pH 7.9，溶氧量大于5 mg/L。動(dòng)物馴化期間投喂不含Vc的基礎(chǔ)料，馴化時(shí)間為3周。馴化結(jié)束，鱉的體重為(206.3±28.3) g。

1.2 試驗(yàn)方法隨機(jī)挑選健康的中華鱉幼鱉，設(shè)8個(gè)平行，每個(gè)平行2只鱉。馴化結(jié)束后將鱉饑餓48 h，開始進(jìn)行急性冷應(yīng)激試驗(yàn)。應(yīng)激前取樣，各組每個(gè)平行取1只鱉。將缸中原有的水迅速泵掉，換上等量提前曝過(guò)氣的自來(lái)水，水溫為(13.0±0.7) ℃，冷應(yīng)激時(shí)間為6 h。應(yīng)激結(jié)束將剩余的幼鱉快速處死并取血，冰上立即解剖，取出肝臟、腎臟和腦組織，用凍存管分裝后放入液氮中，最后轉(zhuǎn)入-80 ℃下冷凍保存?zhèn)錅y(cè)。

1.2.1組織中Vc含量的測(cè)定。采用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測(cè)[3]。稱取一定量組織(肝臟或腦)，迅速將其剪碎，并置于小玻璃勻漿器內(nèi)，加入2 ml 15%的偏磷酸迅速而充分地冰上研磨，4 ℃下20 000 g離心20 min后取上清，0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾，進(jìn)行高效液相色譜分析，液相色譜分析條件如下：色譜柱：KONTRON C18(5 μm，4.6×250 mm)；流動(dòng)相：甲醇∶磷酸溶液體積比為6∶94，pH 2.63；檢測(cè)波長(zhǎng)為243 nm；流速為1 ml/min；進(jìn)樣量為20 μl。采用外標(biāo)法，峰高定量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法同上，只是將待測(cè)樣換成不同濃度梯度的Vc標(biāo)準(zhǔn)品。該試驗(yàn)中測(cè)定的是還原態(tài)和氧化態(tài)抗壞血酸的總和(Total ascorbic acid，TAA )。

1.2.2腎臟GLO活力的測(cè)定。腎臟GLO活性的測(cè)定方法是在Dabrowski等[11]、Maeland等[12]和Ching等[13]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些改進(jìn)。樣品處理：稱取一定量幼鱉腎臟(0.125 g左右)，加入4倍體積冰冷50 mmol/L pH7.4的磷酸緩沖液(含1 mmol/L EDTA，0.2% 脫氧膽酸鈉 Sodium deoxycholate)，迅速置于冰上充分勻漿，4 ℃下15 000 g離心10 min收集上清，取A、B 2支小指管，各加入200 μl上清液、650 μl上述磷酸緩沖液以及50 μl 50 mmol/L谷胱甘肽(Glutathione，購(gòu)自Sigma公司)溶液，A管作為反應(yīng)管，再加入反應(yīng)底物100 μl 100 mmol/L L-古洛糖酸內(nèi)酯(L-gulonolactone，購(gòu)自Sigma公司)；B管作為對(duì)照管，將底物替換成100 μl上述磷酸緩沖液。2管均在25 ℃孵育3 h，加入1 ml 30%偏磷酸終止反應(yīng)，冰上放置5 min，20 000 g離心20 min后，取上清液，然后按照上述測(cè)定Vc的步驟分別測(cè)定A、B管中Vc的含量，以組織中的GLO將底物在單位時(shí)間內(nèi)催化生成的Vc量為GLO活力單位(μg TAA/h.g組織)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± S.E.)表示，使用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS 15對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。先對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)(One-sample Kolmogorov-Smirnov Test)和方差齊性檢驗(yàn)(Test of homogeneity of variances)。在滿足這2個(gè)條件的前提下，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行分析。如果差異顯著，則用LSD(Least significant difference)進(jìn)行兩兩比較。若不滿足這2個(gè)條件，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性冷應(yīng)激對(duì)中華鱉幼鱉Vc合成能力的影響若不考慮性別因素，中華鱉幼鱉在6 h急性冷應(yīng)激前后GLO活力變化如圖1所示。從圖1可以看出，幼鱉在急性冷應(yīng)激后GLO活力有所升高，但未達(dá)到顯著水平(P=0.286)。

若考慮性別因素，中華鱉雌雄幼鱉在6 h急性冷應(yīng)激前后GLO活力變化如表1所示。由表1可知，中華鱉幼鱉在急性冷應(yīng)激前雄性GLO顯著高于雌性(P<0.05)。雌性在急性冷應(yīng)激后GLO顯著的升高(P<0.05)。雄性在急性冷應(yīng)激后GLO有所降低，但不顯著(P>0.05)。

表1 雌雄幼鱉在急性冷應(yīng)激前后的GLO活力變化 μg TAA/h·g

2.2 急性冷應(yīng)激對(duì)中華鱉幼鱉組織Vc含量的影響從圖2～3可以看出，中華鱉幼鱉肝臟組織Vc含量和腦組織Vc含量在6 h急性冷應(yīng)激前后均無(wú)顯著變化。

3 討論

3.1 急性冷應(yīng)激對(duì)中華鱉幼鱉Vc合成能力的影響在經(jīng)歷6 h急性冷應(yīng)激后，中華鱉幼鱉的GLO活力沒(méi)有出現(xiàn)下降，反而略有升高。這與以前的一些應(yīng)激研究結(jié)果有所不同。熱應(yīng)激狀態(tài)下肉仔雞GLO活力會(huì)受到抑制[7]。仔雞在長(zhǎng)時(shí)間的饑餓脅迫下的GLO活力受到顯著抑制[8]，而饑餓對(duì)灰松鼠的GLO活力則無(wú)顯著影響[9]。這可能與研究物種不同、應(yīng)激方式、強(qiáng)度、作用時(shí)間不同有關(guān)。一般而言，急性冷應(yīng)激常呈現(xiàn)免疫抑制，而慢性冷應(yīng)激常引起免疫增強(qiáng)，溫和冷應(yīng)激常引起免疫增強(qiáng)，重度冷應(yīng)激引起免疫下降[14]。錢美亞等研究發(fā)現(xiàn)冬眠影響中華鱉稚鱉的GLO活力，稚鱉在冬眠始末的GLO活力無(wú)顯著變化，但在冬眠4周時(shí)GLO活力出現(xiàn)顯著下降[1]。該研究中應(yīng)激條件為6 h 13 ℃的低溫應(yīng)激，這種短時(shí)間的急性冷應(yīng)激不同于慢性應(yīng)激，能在一定程度上刺激幼鱉體內(nèi)Vc的合成，提高GLO活力。由于Vc可以通過(guò)間接的方式增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)環(huán)境的抗應(yīng)激能力。為了緩解急性冷應(yīng)激對(duì)生理活動(dòng)帶來(lái)的影響，動(dòng)物對(duì)Vc的需求有所增加，而該研究結(jié)果表明短時(shí)間的急性冷應(yīng)激能在一定程度上促進(jìn)體內(nèi)Vc的合成。但是，Vc對(duì)于應(yīng)激后免疫功能的保護(hù)作用應(yīng)與應(yīng)激的強(qiáng)度與類型以及應(yīng)激持續(xù)的時(shí)間有關(guān)，在該試驗(yàn)中可能由于應(yīng)激不是特別強(qiáng)烈，持續(xù)時(shí)間也較短，因此幼鱉冷應(yīng)激前后均未出現(xiàn)顯著差異。應(yīng)激強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間與Vc需求之間的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

有些物種的GLO活力還存在性別上的差異，雌性淡水魟的腎臟GLO活力顯著高于雄性[15]。30周齡的成雞中，母雞的腎臟Vc合成能力顯著高于公雞[16]。Jenness等對(duì)幾種哺乳動(dòng)物的研究表明，在大鼠中雄性個(gè)體GLO活力高于雌性，而在狗與兔中情況正好相反[10]。Kuo等報(bào)道雌雄小鼠肝臟GLO活力與其mRNA表達(dá)量均無(wú)差異[17]。筆者發(fā)現(xiàn)非應(yīng)激狀態(tài)下雄性中華鱉GLO活力顯著高于雌性，但由于樣本量偏少的緣故，尚不能準(zhǔn)確斷定。有關(guān)中華鱉GLO活力是否具有性別差異，還有待進(jìn)一步研究。

3.2 急性冷應(yīng)激對(duì)中華鱉幼鱉組織Vc含量的影響大量研究表明，應(yīng)激過(guò)程對(duì)于動(dòng)物組織中Vc的含量有影響。經(jīng)歷3 h淺水應(yīng)激的菱羊鯛肝臟中Vc含量有顯著下降[18]。在饑餓脅迫下，豚鼠肝臟、脾臟和腎上腺的Vc含量均會(huì)顯著降低[19]。長(zhǎng)時(shí)間的熱應(yīng)激會(huì)引起肉仔雞的血漿Vc含量降低[7]。在該研究中，中華鱉幼鱉在6 h急性冷應(yīng)激前后肝臟組織Vc含量和腦組織Vc含量均未發(fā)生顯著變化。這可能與應(yīng)激類型、強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，也可能是動(dòng)物本身代謝機(jī)制的差異所造成的。該研究結(jié)果表明，在急性冷應(yīng)激6 h后，幼鱉肝臟中Vc含量有所上升，但差異不顯著。這說(shuō)明6 h的低溫應(yīng)激對(duì)幼鱉肝臟組織Vc含量沒(méi)有顯著影響，由于時(shí)間較短幼鱉在應(yīng)激過(guò)程中消耗的Vc較少，這部分消耗的Vc可以直接從血漿中獲取，對(duì)肝臟中Vc含量并無(wú)顯著影響。Zhou等研究表明24 h的酸應(yīng)激對(duì)中華鱉肝臟Vc含量沒(méi)有明顯影響[3]，應(yīng)激對(duì)肝臟組織Vc含量的影響可能與應(yīng)激類型強(qiáng)度，應(yīng)激持續(xù)時(shí)間及本身的Vc貯存能力有關(guān)。

研究表明，Vc在加速神經(jīng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)方面有重要作用[20]。腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的組成部位，幼鱉在受到急性冷應(yīng)激時(shí)優(yōu)先保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。該研究表明，6 h急性冷應(yīng)激前后幼鱉的腦組織Vc含量無(wú)顯著變化，說(shuō)明短時(shí)間的低溫應(yīng)激還沒(méi)有對(duì)幼鱉的腦組織Vc含量產(chǎn)生明顯的影響，推測(cè)幼鱉在受到急性冷應(yīng)激后消耗的Vc優(yōu)先從機(jī)體其他部位(血漿或肝臟中)獲取，因此腦中Vc含量在應(yīng)激以后并沒(méi)有明顯變化。綜上所述，冷應(yīng)激對(duì)于幼鱉組織中Vc的含量的影響與應(yīng)激類型、應(yīng)激強(qiáng)度、應(yīng)激時(shí)間及能力有關(guān)。有關(guān)中華鱉幼鱉應(yīng)激前后Vc在機(jī)體組織中分布的規(guī)律及轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

[1] 錢美亞，牛翠娟，井潤(rùn)貞，等.外源維生素C及冬眠對(duì)中華鱉(Pelodiscussinensis)稚鱉生長(zhǎng)，維生素C合成和肝臟維生素C含量的影響[J].動(dòng)物學(xué)報(bào)，2008，54(2)：309-316.

[2] MAHMOUD K Z，EDENS F W，EISEN E J，et al.Ascorbic acid decreases heat shock protein 70 and plasma corticosterone response in broilers (Gallusgallusdomesticus) subjected to cyclic heat stress[J].Comparative Biochemistry Physiology B，2004，137(1)：35-42.

[3] ZHOU X，XIE M，NIU C，et al.The effects of dietary vitamin C on growth，liver vitamin C and serum cortisol in stressed and unstressed juvenile soft-shelled turtles (Pelodiscussinensis)[J].Comparative Biochemistry Physiology A，2003，135(2)：263-270.

[4] XIE Z，NIU C，ZHANG Z，et al.Dietary ascorbic acid for enhancing the immune response in Siberian sturgeon (Acipenserbaerri)，a species capable of ascorbic acid biosynthesis[J].Comparative Biochemistry Physiology A，2006，145：152-157.

[5] 邵慶均，張莉紅，劉建新，等.飼料中Vc水平對(duì)中華鱉幼鱉生長(zhǎng)及其組織中含量的影響[J].水生生物學(xué)報(bào)，2004，28(3)：269-274.

[6] 高曉莉，龍?zhí)烊A，齊風(fēng)生，等.飼料中維生素C 水平對(duì)稚鱉生長(zhǎng)的影響[J].淡水漁業(yè)，2002，32(3)：26-27.

[7] 文杰，林濟(jì)華.Vc對(duì)熱應(yīng)激狀態(tài)下肉仔雞生產(chǎn)性能及Vc合成能力的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，31(6)：497-502.

[8] HOOPER C，MAURICE D，LIGHTSEY F，et al.Factors affecting ascorbic acid biosynthesis in chickens.I.Adaptation of an assay and the effect of age，sex and food deprivation[J].Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition，2000，84 (1/2)：48-56.

[9] DAVIES J E，HUGHES R E.A note on the effect of food restriction on tissue ascorbic acid in guinea-pigs[J].British Journal of Nutrition，1977，38：299-300.

[10] JENNESS R，BIRNEY E C，AYAZ K L.Variation of L-gulonolactone oxidase activity in placental mammals[J].Comparative Biochemistry and Physiology B，1980，67(2)：195-204.

[11] DABROWSKI K，HINTERLEITHER S.Applications of a simultaneous assay of ascorbic acid，dehydroascorbic acid and ascorbic sulphate in biological materials[J].Analyst，1989，114(1)：83-87.

[12] MAELAND A，WAAGBφ R.Examination of the qualitative ability of some cold water marine teleosts to synthesise ascorbic acid[J].Comparative Biochemistry and Physiology A，1998，121(3)：249-255.

[13] CHING S，MAHAN D C，MOREAU R，et al.Modification of analytical procedures for determining vitamin C enzyme (L-gulonolactone oxidase) activity in swine liver[J].Journal of Nutritional Biochemistry，2003，14(3)：139-146.

[14] 袁學(xué)軍，牛靜華，吳海燕，等.冷應(yīng)激對(duì)伊褐紅公雛雞外周血淋巴細(xì)胞數(shù)目變化的影響[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，14(1)：61-63.

[15] FRACALOSSI D M，ALLEN M E，YUYAMA L K，et al.Ascorbic acid biosynthesis in Amazonian fishes[J].Aquaculture，2001，192(2/4)：321-332.

[16] MAURICE D V，LIGHTSEY S F.Sexual difference in ascorbic acid synthesis，tissue ascorbic acid and plasma total antioxidant capacity in mature chickens[J].British Poultry Science，2007，48(4)：519-523.

[17] KUO S M，TAN C H，DRAGAN M，et al.Endotoxin increases ascorbate recycling and concentration in mouse liver[J].Journal of Nutrition，2005，135(10)：2411-2416.

[18] HENRIQUE M M F，MORRIS P C，DAVIES S J.Vitamin C status and physiological response of the gilthead seabream，SparusaurataL.，to stressors associated with aquaculture[J].Aquaculture Research，1996，27：405-412.

[19] DAVIES J E，HUGHES R E.A note on the effect of food restriction on tissue ascorbic acid in guinea-pigs[J].British Journal of Nutrition，1977，38：299-300.

[20] KOSHIO S，IIDA Y，SAKAKURA Y，et al.The effect of vitamin C intake on growth，survival and schooling behavior of amphi-dromous fish (Plecoglossusaltivelis)[J].Fisheries Science，1997，63：619-624.

Effects of Acute Cold Stress on Biosynthesis of Vc and Tissue Vc Concentration in JuvenilePelodiscussinensis

GONG Xun1, 2, 3, NIU Cui-juan2*, QIAN Mei-ya2et al

(1. School of Light Engineering, Guizhou Institute of Technology, Guiyang, Guizhou 550003; 2. College of Life Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875; 3. School of Ecological Engineering, Guizhou University of Engineering Sciences, Bijie, Guizhou 551700)

The effect of acute cold stress on biosynthesis of Vc and tissue Vc concentration in juvenilePelodiscussinensiswas investigated. The juvenileP.sinensis(206.31 g ± 28.33 g) were fed with basal diet under 29 ℃±1 ℃. After 3 weeks, the acute cold stress was carried out. Stress condition: 13 ℃±0.7 ℃, 6 h. The results showed that GLO activity elevated to some extent, but not significantly(P>0.05). Liver and brain Vc concentration did not change obviously. In addition, there seemed a sexual difference of GLO activity in juvenileP.sinensis, which could not confirmed due to un-enough samples. The acute cold stress on biosynthesis of Vc has a role in promoting in juvenileP.sinensis, but there was no significant effect on the liver and brain tissue Vc concentration.

Acute cold stress; L-gulonolactone oxidase; Tissue Vc concentration;Pelodiscussinensis

貴州省科學(xué)技術(shù)

(黔科合J字[2013]2007)；貴州省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201310668002)。

龔勛(1983- )，女，湖南益陽(yáng)人，副教授，博士，從事分子生理生態(tài)學(xué)研究。*通訊作者，教授，從事動(dòng)物生理生態(tài)學(xué)研究。

2015-02-11

S 947.1

A

0517-6611(2015)09-118-03