亞臨床癥狀豬群中PRRSV和PCV2的感染情況

蔡汝健，蔣智勇，張樂宜，宋長緒

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640)

?

亞臨床癥狀豬群中PRRSV和PCV2的感染情況

蔡汝健，蔣智勇，張樂宜，宋長緒*

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640)

[目的] 了解亞臨床癥狀豬群中PRRSV和PCV2的感染情況。[方法] 選擇7個有PRRSV和PCV2感染史且有亞臨床癥狀的豬群，通過ELISA和PCR的相結(jié)合方法檢測其PRRSV和PCV2的感染情況。[結(jié)果] ELISA檢測結(jié)果表明，所有豬場12周齡仔豬PRRSV和PCV2抗體能觀察到血清抗體轉(zhuǎn)化。PCR結(jié)果表明約3/7的豬場8周齡仔豬PRRSV呈陽性，12和20周齡仔豬PRRSV呈陰性；8～20周齡有不同比例仔豬PCV2呈陽性。[結(jié)論] 在亞臨床癥狀豬群中PRRSV的感染主要在8～12周齡，而PCV2在8～20周齡都有感染。

豬群；亞臨床癥狀；PRRSV；PCV2；感染

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是影響世界各地養(yǎng)豬業(yè)的重要病毒[1-2]，并給養(yǎng)豬戶造成巨大的經(jīng)濟損失[3-4]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，豬群中通常存在PRRSV 和PCV2 的混合感染的情況[5]。與單一的病原感染相比，混合感染能引起明顯的臨床癥狀，造成更大的經(jīng)濟損失，但在有感染歷史而現(xiàn)階段為亞臨床癥狀的豬場PRRSV和PCV2的感染情況鮮有報道?；诖耍P者通過ELISA和PCR的相結(jié)合方法研究了亞臨床癥狀豬群當中PRRSV和PCV2的感染情況。

1 材料與方法

1.1 豬場概況從廣東地區(qū)選擇了7個有PRRSV和PCV2感染歷史而現(xiàn)階段表現(xiàn)為亞臨床癥狀規(guī)模大約為800～2 000頭母豬的自繁自養(yǎng)豬場。利用橫斷面方法從每個豬場采取5個年齡組豬群的血清(每個年齡組約6～8份血清樣品)，分別為后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬、8周齡、12周齡和20周齡仔豬。豬場疫苗免疫情況見表1。

1.2 試劑豬圓環(huán)病毒ELISA抗體檢測試劑盒由瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測試劑盒由美國IDEXX公司生產(chǎn)。一步法RT-PCR 試劑盒由TaKaRa 公司生產(chǎn)。

1.3 ELISA檢測方法①PCV2抗體的檢測。按照PCV2抗體診斷試劑盒的說明書檢測血清樣品中PCV2抗體水平，結(jié)果判定：S/P值≥0.25為陽性，0.16

表1 豬場疫苗的免疫情況

豬場PRRSV疫苗免疫情況母豬仔豬PCV2疫苗免疫情況母豬仔豬A3次/年10～14日齡3次/年10～14日齡B3次/年未免未免14日齡C3次/年未免未免14日齡D未免未免產(chǎn)前35d10～14日齡E3次/年10～14日齡未免10～14日齡F3次/年35日齡未免未免G未免未免未免14日齡、26日齡

1.4 RT-PCR方法和熒光定量PCR方法PRRSV RT-PCR采用一步法RT-PCR 試劑盒說明書進行。反應(yīng)體系(25 μl)：PrimeScript 1 step Enzyme Mix 2 μl，Buffer 12.5 μl,上下游引物各0.5 μl,模板 2 μl，RNase Free dH2O 8.5 μl。反應(yīng)程序為：經(jīng)50 ℃ 反應(yīng)30 min，94 ℃預(yù)變性2 min，然后94 ℃ 50 s、54 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。結(jié)果判定以凝膠電泳出現(xiàn)特異性片段為準。PCV2熒光定量PCR方法參照張福良[6]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2的抗體檢測結(jié)果通過橫斷面采樣和ELISA 方法，分別檢測豬場后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬和8、12、20周齡仔豬血清抗體滴度，計算每個組的平均值，以了解豬場的血清學(xué)轉(zhuǎn)化動態(tài)?？梢酝ㄟ^抗體轉(zhuǎn)化時間的分析來了解豬場病毒循環(huán)情況，從而有效指導(dǎo)豬場疫病的防控。

對廣東地區(qū)7個規(guī)?；i場PCV2的抗體進行檢測。從圖1可以看出，除A、D場母豬免疫疫苗外，其余場母豬均未免圓環(huán)病毒疫苗，仔豬一般在10～14日齡免疫圓環(huán)病毒疫苗(除F未免外)。圖中顯示母豬的抗體S/P平均值為1.5～2.5，說明母豬的抗體水平較高。約為71%(5/7)的豬場仔豬在8周齡時抗體降到最低，12周齡能觀察到血清抗體轉(zhuǎn)化。但是，D、E場20周齡才觀察到血清抗體轉(zhuǎn)化。約71%(5/7)的豬場仔豬血清抗體S/P平均值為1.0～2.5，但E、F場仔豬抗體S/P值始終在1.0以下。

2.2 PRRSV的抗體檢測結(jié)果通過橫斷面采樣的方法和ELISA 方法檢測PRRSV抗體滴度。從圖2可以看出，大部分豬場母豬都免疫接種藍耳病疫苗(D、G場除外)。仔豬安排在10～14日齡免疫接種藍耳病疫苗，但B、C、D和G場仔豬未免。圖中顯示母豬的抗體S/P值平均值為1.0～2.5，B和C場S/P值較高。所有豬場仔豬抗體在8周齡時降到最低，12周齡能觀察到血清抗體轉(zhuǎn)化，12周齡后抗體水平持續(xù)升高。從圖3可以看出，約為86%豬場的后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬和12、20周齡的抗體陽性率為100%，但F場除外，可能與F場所用的疫苗毒株有關(guān)。8周齡抗體陽性率約為30%～100%，此階段抗體陽性率和S/P平均值都較低。

2.3 PRRSV和PCV2抗原檢測結(jié)果將采集的血清3或4份合成1份進行抗原檢測，血清中只要有1份以上抗原陽性則標記該階段抗原為陽性。所有豬場母豬PRRSV抗原為陰性，A、C、F和G場PCV2為陰性，B和D場部分母豬PCV2抗原為陽性。由表2可知，約為43%(3/7)的豬場PRRSV在8周齡時為陽性，12、20周齡全為陰性。PCV2在8、12和20周齡豬場陽性率分別為43.0%(3/7)、57.1%(4/7)和57.1%(4/7)(圖3)。

表2 PRRSV 和PCV2 抗原檢測結(jié)果

豬場8周齡PRRSVPCV212周齡PRRSVPCV220周齡PRRSVPCV2A+--+-+B-+-+-+C------D++---+E---+--F++-+-+G------

注：“+”代表陽性，“—”代表陰性。

3 討論

筆者選擇了7個有PRRSV和PCV2感染歷史而現(xiàn)階段表現(xiàn)為亞臨床癥狀的自繁自養(yǎng)的豬場，研究亞臨床癥狀豬群當中PRRSV和PCV2的感染情況。雖然8周前的仔豬也可能存在病毒感染，但由于檢測方法容易受到母源抗體和免疫活苗的干擾，所以該研究中不包括8周前仔豬的調(diào)查[7]。

筆者采用了ELISA 和 PCR 結(jié)合的檢測方法，豬場內(nèi)實際的病毒循環(huán)情況可以通過PCR方法檢測[8-9]，與ELISA方法[10]相比該方法不受母源抗體和疫苗抗體的干擾。ELISA 方法則可以觀察到一段時間內(nèi)的血清學(xué)抗體轉(zhuǎn)化，正好彌補了PCR方法的缺點。

該研究表明，仔豬PRRSV 和PCV2 疫苗大部分豬場在10～14日齡免疫，所以8周齡后生長豬的血清學(xué)轉(zhuǎn)化能反映出仔豬的感染動態(tài)。約86%(6/7)的豬場(除了F場)12周齡PRRSV抗體都有升高，結(jié)合抗原檢測結(jié)果部分豬場8周齡抗原也為陽性，說明8～12周齡豬場有藍耳病毒感染。12周齡以后部分豬場PRRSV抗體逐漸下降，說明這些豬場PRRSV感染逐漸減少，但也有部分豬場PRRSV 抗體水平持續(xù)上升，說明這些豬場持續(xù)受到PRRSV的影響，若這些感染PRRSV的仔豬留作種用將可能長期帶毒，使PRRSV進入新的一輪循環(huán)感染。

該研究表明，生長豬群圓環(huán)病毒抗體在8周齡時降到最低，12周齡能觀察到血清抗體轉(zhuǎn)化，但D、E場20周齡才觀察到血清抗體轉(zhuǎn)化。同時，結(jié)合抗原檢測結(jié)果部分豬場8和12周齡抗原為陽性，說明8周齡開始持續(xù)有PCV2的感染。大部分豬場的PCV2 疫苗都在10～14日齡免疫，但8周齡后仍有病毒的感染，說明10～14日齡免疫圓環(huán)病毒疫苗不足以保護到8周齡后的仔豬，說明豬圓環(huán)病毒疫苗免疫可以推遲或在8周齡之前再安排二免，以便能夠保護8周齡后的仔豬。

該研究表明，部分豬場PRRSV為陽性，12和20周大部分豬場為陰性。這說明PRRSV主要在8～12周齡感染，12周齡以后病毒血癥逐步消失甚至在豬體內(nèi)凈化。豬圓環(huán)病毒從8周齡至20周齡抗原均能檢出陽性，說明豬圓環(huán)病毒可能在豬體內(nèi)持續(xù)感染甚至有可能終生帶毒，所以豬圓環(huán)病毒防控和凈化的難度更大。PRRSV和PCV2在8～12周齡都有感染，說明此階段仔豬存在PRRSV和PCV2的混合感染[11]。

該研究結(jié)果表明，PRRSV感染主要發(fā)生在8～12周齡生長豬，所以要確定亞臨床癥狀豬群內(nèi)是否有PRRSV循環(huán)感染， 8～12周齡豬群是PRRSV檢測和監(jiān)測的理想對象。雖然這次抽樣的豬場并不能代表廣東地區(qū)整體的情況，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCV2從8周齡至20周齡都有感染，說明豬圓環(huán)病毒在豬場中普遍存在[12]并長時間持續(xù)帶毒。

[1] ALLAN G M，MEEHAN B M，TODD D，et al.Novel porcinecircoviruses from pigs with wasting disease syndromes[J].Vet Rec,1998,142(17):467-468.

[2] ALLAN G M，MCNEILLY F，KENNEDY S，et al.Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe[J].J Vet Diagn Invest,1998,10(1):3-10.

[3] NEUMANN E J，KLIEBENSTEIN J B，JOHNSON C D，et al.Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States[J].J Am Vet Med Assoc,2005,227:385-392.

[4] PEJSAK Z，STADEJEK T，MARKOWSKA-DANIEL I.Clinical signs and economic losses caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus in a large breeding farm[J].Vet Microbiol,1997,55:317-322.

[5] ALLAN G M，KENNEDY S，MCNEILLY F，et al.Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus[J].J Comp Pathol,1999:121(1):1-11.

[6] 張福良,宋長緒,楊鳴琦,等.豬圓環(huán)病毒2型熒光定量PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2006，26(3):248-250.

[7] NODELIJK G，NIELEN M，DE JONG M C M，et al.A review of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Dutch breeding herds: population dynamics and clinical relevance[J].Prev Vet Med,2003,60:37-52.

[8] VAN MAANEN C，VON BANNISSEHT-WYSMULLER T E，VAN ESCH E J B，et al.Comparison and validation of selected conventional and real-time PCR methods for the detection and differentiation of European and American-type PRRSV in field samples[C]//Proceedings ESVV Congress Lisbon，2006.

[9] WELLENBERG G J.Review: diagnostic methods for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) infections[J].Tijdschr Diergeneeskd,2006,131(16):566-572.

[10] FANO E，PIJOAN C，DEE S.Infection dynamics of PRRSV in a continuous flow population[J].Vet Rec,2007,161:515-520.

[11] 王旭榮，馬紅艷，祝衛(wèi)國，等.高熱病豬群中PRRSV的調(diào)查及其流行毒株的分離[J].中國獸醫(yī)雜志，2008，44(3)：39-40.

[12] 劉燕玲，王旭榮，黃忠，等.廣東省豬繁殖與呼吸綜合征流行情況的調(diào)查和分析[J].豬業(yè)科學(xué),2007(10):71-73.

Infection of PRRSV and PCV2 in Pig Herds with Subclinical Symptoms

CAI Ru-jian, JIANG Zhi-yong，ZHANG Le-yi, SONG Chang-xu*

(Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangdong Open Laboratory of Veterinary Public Health, Guangdong Provincial Key Laboratory of Livestock and Poultry Disease Prevention and Control, Guangzhou, Guangdong 510640)

[Objective] The research aimed to study the infection situations of PRRSV and PCV2 in pig herds with subclinical symptoms. [Method] Seven pig herds with infection history and subclinical symptoms were chosen to detect the infection situations of PRRSV and PCV2 by using ELISA and PCR. [Result] The results of ELISA showed that sero-transform of PRRSV and PCV2 antibodies in 12 week-old piglets was found in all farms. The results of PCR showed that the detection results of PRRSV in 8 week-old piglets in three sevenths pig farms were positive, and the detection results of PRRSV in 12 week-old and 20 week-old piglets were negative. The detection results of PCV2 in 8～20 week-old piglets were positive. [Conclusion] The infection of PRRSV mainly occurred in 8～12 week-old pig herds, and the infection of PCV2 occurred in 8～20 week-old pig herds.

Pig herds; Subclinical symptoms；PRRSV；PCV2；Infection

廣東省生豬科技創(chuàng)新體系崗位專家專項(粵農(nóng)2009-380)；促進科技服務(wù)業(yè)發(fā)展專項 (2010A040301010)；廣東省國際合作項目(2010B050600010)；廣州市科信局應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(2012J4100064)。

蔡汝健(1979-)，男，海南安定人，副研究員，從事豬場疫病綜合防控工作。*通訊作者，研究員，從事豬場疫病綜合防控工作。

2015-02-11

S 852.65+1

A

0517-6611(2015)09-099-03