篤斯越橘新品種“紫水晶”離體培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)研究

田新華, 翁海龍, 李 京, 邢亞娟

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江哈爾濱 150081)

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篤斯越橘新品種“紫水晶”離體培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)研究

田新華, 翁海龍, 李 京, 邢亞娟*

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江哈爾濱 150081)

[目的]探討篤斯越橘新品種“紫水晶”離體培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)。[方法]通過對外植體滅菌方法，取材時期，增殖、壯苗、生根培養(yǎng)的篩選與優(yōu)化，建立適合篤斯越橘新品種“紫水晶”的無性配套繁殖體系。[結(jié)果]外植體滅菌采用0.1% HgCI2消毒3 min；WPM(改良)+6-BA 1.0 mg/L+ZT1.0 mg/L為篤斯越橘新品種“紫水晶”分化增殖培養(yǎng)基；9月份將無根試管苗移栽到混配有機(jī)基質(zhì)鋸末∶樹皮∶草炭=1∶1∶1基質(zhì)中，空氣相對濕度80%～90%，培養(yǎng)溫度為20～25 ℃，50 d后生根率達(dá)72.4%。[結(jié)論]建立了篤斯越橘新品種“紫水晶”離體培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)，為大規(guī)模工廠化育苗提供技術(shù)支持。

篤斯越橘；紫水晶；離體培養(yǎng)；條件優(yōu)化

篤斯越橘新品種“紫水晶”是以野生篤斯越橘為母本，北美藍(lán)莓為父本的雜交品種，2014年12月鑒定的新品種。該品種樹體高大，成年樹高0.5～0.8 m，結(jié)實量1 200 kg/hm2，總狀花序，果實藍(lán)紫色，適合加工，百粒重約60 g。與國外同類品種對比，具有抗旱抗寒優(yōu)勢，定植1年成園，第2年達(dá)到豐產(chǎn)。適宜種植在大興安嶺-黑河-小興安嶺一線，活動積溫在2 300 ℃以下。

目前，國內(nèi)對于篤斯越橘的應(yīng)用與新品種的選育研究較少，而篤斯越橘的離體培養(yǎng)體系尚未建立，組培苗移栽存活率仍較低[1-4]，不利于新品種的規(guī)?；a(chǎn)與推廣應(yīng)用。因此，筆者對新品種“紫水晶”的配套繁育技術(shù)進(jìn)行研究，以期為大規(guī)模工廠化育苗提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料選用“紫水晶”休眠枝條為供試材料，用清水浸泡催芽，每2 d換1次水，水溫控制在18～20 ℃，7 d左右休眠枝條開始萌芽。

1.2 試驗方法

1.2.1外植體滅菌。腋芽萌發(fā)后，剪取長約1.0 cm的帶芽莖段，用清水反復(fù)沖洗。在超凈工作臺上進(jìn)行滅菌處理：①75%乙醇浸泡30 s，0.1%HgCI2浸泡3 min，然后用無菌水沖洗3次；②75%乙醇浸泡30 s，0.1% HgCI2浸泡5 min，用無菌水沖洗3次；③0.1% HgCI2浸泡3 min，之后用無菌水沖洗3次；④0.1% HgCI2浸泡5 min，用無菌水沖洗3次；⑤75%乙醇浸泡30 s，5%次氯酸鈉浸泡5 min，用無菌水沖洗3次；⑥75%乙醇浸泡30 s，5%次氯酸鈉浸泡10 min，用無菌水沖洗3次。以上材料滅菌后取出，用無菌濾紙吸干表面多余水分。每組處理10個莖段，3次重復(fù)，5 d后觀察效果。

1.2.2取材時期及芽苗生長狀況。于4月采集健壯無病的“紫水晶”休眠枝條，采用水培催芽的方式，將突破芽鱗的嫩芽接種于改良WPM[用Ca(NO3)2·4H2O，KNO3代替原WPM培養(yǎng)基中的CaCl2、K2SO4]；7月、10月分別采集當(dāng)年生單芽莖段接種，接種后7、14、21 d分別觀察染菌情況,研究不同接種時間對芽苗長勢的影響。培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g/L，日產(chǎn)瓊脂粉6 g/L，pH調(diào)至5.8，培養(yǎng)溫度白天(25±1)℃，夜間(20±1)℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時間12 h/d。

1.2.3誘導(dǎo)側(cè)芽生長。以改良的WPM培養(yǎng)基[用Ca(NO3)2·4H2O，KNO3代替原WPM培養(yǎng)基中的CaCl2、K2SO4]為基本培養(yǎng)基，在無菌條件下將單芽莖段接種于WPM(改良)+ZT 0.5 mg/L +30 g/L蔗糖+瓊脂粉6 g/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽苗生長。培養(yǎng)條件同“1.2.2”。

1.2.4試管苗分化增殖培養(yǎng)。待莖段腋芽伸長后，分別轉(zhuǎn)接于以改良WPM為基本培養(yǎng)基，以6-芐基腺嘌呤(6-BA)，玉米素(ZT)為2個因素，每因素設(shè)置3個水平。采用L9(34)正交試驗設(shè)計進(jìn)行芽增殖培養(yǎng)基篩選。每個處理2次重復(fù)，每個重復(fù)接種10瓶，35 d后調(diào)查苗高和苗數(shù)。

1.2.5篤斯越橘壯苗培養(yǎng)。篤斯越橘的試管苗相對柔嫩纖細(xì)，需進(jìn)行一段時間的壯苗培養(yǎng)，才能誘導(dǎo)生根。剪取長約1.0 cm的試管苗轉(zhuǎn)接于WPM(改良)+ZT 1.0 mg/L+30 g/L蔗糖液體培養(yǎng)基，分別置于2 000 lx(處理①)、3 000 lx(處理②)的光照條件下培養(yǎng)50 d。每個處理2次重復(fù)，每個重復(fù)接種10瓶，培養(yǎng)50 d后調(diào)查苗高、莖粗、分化增殖倍數(shù)、生長狀況。

1.2.6試管苗瓶外生根培養(yǎng)。

1.2.6.1不同有機(jī)基質(zhì)對篤斯越橘苗瓶外生根的影響。經(jīng)發(fā)酵腐熟處理的有機(jī)基質(zhì)經(jīng)飽和KMnO4溶液消毒30 min后，大量清水沖洗，塑料薄膜覆蓋陽光暴曬24 h以上，通風(fēng)備用。供試基質(zhì)：①草炭+稻殼+樹皮=1∶1∶1;②針葉+樹皮+闊葉=1∶1∶1;③針葉+闊葉+稻殼=1∶1∶1； ④樹皮+闊葉=1∶1;⑤鋸末+樹皮+草炭=1∶1∶1；⑥草腐菌菌糠+樹皮=1∶1。

將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)的芽苗扦插于以下6種有機(jī)基質(zhì)，每個處理扦插20株，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計不同基質(zhì)中篤斯越橘試管苗存活率，篩選出適宜篤斯越橘生根的移栽基質(zhì)。

1.2.6.2不同激素濃度對篤斯越橘組培苗移栽的影響。選用第⑤、⑥號基質(zhì)為栽培基質(zhì)，將無根組培苗分別蘸取ABT 500、1 000 mg/L，速蘸30 s后移栽在基質(zhì)中，50 d后分析不同激素處理對篤斯越橘試管苗瓶外生根的影響。

1.2.6.3不同濕度條件對篤斯越橘瓶外生根的影響。將篤斯越橘移栽培養(yǎng)的溫度控制在白天(20～25)℃，夜間(10～15)℃，針對移栽培養(yǎng)不同濕度進(jìn)行試驗，篩選出適于誘導(dǎo)苗生根的環(huán)境條件。

1.2.6.4不同移栽時間對篤斯越橘試管苗瓶外生根的影響。選用第⑤、⑥號基質(zhì)為栽培基質(zhì)，將組培苗分別蘸取ABT 500、1 000 mg/L，速蘸30 s，分別在5、7、9月進(jìn)行移栽試驗，30 d后統(tǒng)計存活率，分析最適宜篤斯越橘試管苗移栽的時間。

1.3 數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2003統(tǒng)計工具進(jìn)行計算并作圖，DPS 7.05數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性測驗(SSR法)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌方法的滅菌效果由表1可知，處理⑤、⑥滅菌不充分，污染率超過60.0%；處理①、②、④滅菌過度，大部分外植體切口處出現(xiàn)褐化，盡管污染數(shù)少，但苗木褐化較嚴(yán)重，己經(jīng)影響到苗木正常生長；處理③即用0.1%升汞浸泡3 min，之后用無菌水沖洗3次的滅菌方法，污染率為16.7%，褐化率為13.3%，為較適宜的滅菌方法，既能達(dá)到滅菌的目的，又對外植體無損傷。

表1 不同滅菌時間的滅菌效果

2.2 不同取材時期對篤斯越橘芽苗生長的影響分別于第2年3、7、10月進(jìn)行篤斯越橘外植體的接種，于接種后7、14、21 d觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，取材于不同時期的芽，分化率和嫩梢伸長都有所差異。3月接種的嫩芽相對染菌率低，同時由于經(jīng)過冬季休眠，營養(yǎng)的累積，自身調(diào)節(jié)已處于萌動期，春季接種的芽苗生長勢強(qiáng)，生長速度較快，初分化天數(shù)早，在接種的第8天就開始分化。7月接種的芽染菌較嚴(yán)重，向高生長速度快，節(jié)間距離大，葉片大而薄，多汁，易產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象，分化相對較少，苗木較細(xì)弱。10月接種的芽啟動生長速度慢，甚至停滯，從接種的16 d開始有分化跡象。

2.3 篤斯越橘側(cè)芽生長情況篤斯越橘腋芽在改良后的初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d左右開始萌動，培養(yǎng)15 d后節(jié)間伸長、葉片展開，培養(yǎng)25 d后繁殖系數(shù)較高(平均新生芽苗數(shù)4.7個)，葉片較多(平均葉片數(shù)6.0枚)，芽苗生長速度較快(平均新生芽苗高0.67 cm)，平均芽苗高1.54 cm。

2.4 篤斯越橘試管苗增殖培養(yǎng)基的篩選將經(jīng)初代培養(yǎng)的試管苗切成1.0 cm左右的莖段轉(zhuǎn)接入不同激素組合的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過觀察各處理培養(yǎng)35 d后的試管苗可知，因激素種類、濃度的不同，不定芽的生長狀況表現(xiàn)出明顯的不同。篤斯越橘莖段或莖尖的離體增殖率受到培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素的調(diào)控，伸長生長除受細(xì)胞分裂素調(diào)控外，還受生長素的調(diào)控。將試管苗各性狀測量結(jié)果進(jìn)行極差分析。結(jié)果表明，無論苗高還是分化增殖苗數(shù)均是RZT>R6-BA，即玉米素對試管苗的縱向生長、苗的分化增殖都起著決定性調(diào)控作用。但對于苗高性狀而言，ZT的1水平作用效果明顯；對于分化增殖而言，ZT的2水平作用效果明顯。添加6-BA時，外植體也增殖，但增殖效果遠(yuǎn)不如ZT。方差分析表明，無論對于控制篤斯越橘試管苗的苗高還是分化增殖數(shù)，6-BA、ZT兩因素不同水平間差異均極顯著(P<0.01)。按F值分析，F(xiàn)值大的因素對結(jié)果影響較大，結(jié)果也與上述分析一致。由表2可知，處理①培養(yǎng)的試管苗向高生長最快，其次是處理⑧，且與其他處理間差異顯著(P<0.05)；以處理⑧培養(yǎng)的試管苗分化增殖倍數(shù)最多，其次是處理⑤，且與其他處理間差異顯著(P<0.05)。綜上所述，在保證試管苗增殖率的前提下，應(yīng)選擇苗木較高、生長旺盛的處理，即選擇培養(yǎng)基(處理⑧)WPM(改良)+6-BA1.0 mg/L+ZT1.0 mg/L為篤斯越橘的分化增殖培養(yǎng)基。

表2 不同處理篤斯越橘植株性狀比較

注：要求芽苗高度≥0.5 cm；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 篤斯越橘試管壯苗的培養(yǎng)將接種試管苗的培養(yǎng)瓶放置于不同光照條件下，培養(yǎng)50 d，結(jié)果見表3。由表3可知，經(jīng)不同光照處理的試管苗生長狀況也不同。處理①培養(yǎng)的試管苗長勢相對較弱，呈纖細(xì)狀態(tài)，葉片小，葉色嫩綠，莖桿柔嫩、色淺。處理②培養(yǎng)的苗木莖桿相對粗壯，色紅，有一定的韌性，葉片完全展開，葉色濃綠、有光澤。雖然高度低于處理①，但其他性狀均優(yōu)于處理①。因此，在試管苗移栽前進(jìn)行壯苗培養(yǎng)非常必要，使試管苗莖桿增粗，葉片發(fā)紅，幼莖組織充實，提高木質(zhì)化程度。經(jīng)過鍛煉的試管苗，葉片抗蒸騰作用和適應(yīng)能力增強(qiáng)，光合性能顯著提高，適應(yīng)外界環(huán)境的能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)根系萌發(fā)，提高瓶外生根率。

表3 不同光照處理篤斯越橘試管苗生長狀況

2.6 篤斯越橘試管苗瓶外生根技術(shù)研究

2.6.1不同基質(zhì)對篤斯越橘存活率的影響。將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)的試管苗成叢取出，剪去頂端部分保留苗高約2.0 cm，用清水洗凈基部培養(yǎng)基。試管苗基部速蘸0.5%KMnO4消毒，然后浸蘸生根激素ABT 30 s，栽到經(jīng)KMO4消過毒的有機(jī)基質(zhì)中誘導(dǎo)生根。

苗木移栽7 d左右不同基質(zhì)上的試管苗出現(xiàn)不同程度的萎蔫，其中以摻有稻殼成分的基質(zhì)較為嚴(yán)重。移栽后約12 d苗木從靠近基質(zhì)的部位開始返青，移栽后約18 d存活的植株都已經(jīng)返青，并出現(xiàn)不同程度的生長。莖桿增粗，植株挺立，葉片展開，濃綠。萎蔫的苗木則全株枯黃，埋入基質(zhì)部分已經(jīng)腐爛。其中以基質(zhì)⑤、⑥效果最好，存活率分別為63.4%和56.8%(表4)。

表4 不同基質(zhì)中篤斯越橘苗木存活情況 %

2.6.2不同激素濃度對篤斯越橘試管苗生根的影響。從篤斯越橘試管苗移栽的第2周開始，每周噴施一次與移栽時相同濃度的生根激素，保持空氣相對濕度在80%～90%。通過6組試驗得出，在同一移栽基質(zhì)中蘸取生根激素ABT 1 000 mg/L的組培苗生根較早，且生根速度較快。生根最早的是經(jīng)ABT 1 000 mg/L處理的⑤號基質(zhì)，試管苗約在移栽第13天開始生根，第18天根長可達(dá)1.2 cm，且有分支；而蘸取生根激素ABT 500 mg/L的組培苗約在移栽的第21天開始生根，生根速度相對較慢。以基質(zhì)⑤培養(yǎng)的試管苗生根速度較快，根系較多、有分支，且以ABT 1 000 mg/L處理的試管苗平均生根率最高，為72.4%(表5)。

2.6.3不同空氣濕度對篤斯越橘苗木存活率的影響。將苗木移栽到基質(zhì)⑤中，20 d后統(tǒng)計苗木存活狀況。由表6可知，在一定空氣濕度范圍內(nèi)，組培苗存活率與空氣相對濕度呈正相關(guān)，空氣濕度越高，組培苗的存活率越高，其中以處理③最高。可見，組培苗移栽后，在苗床上方搭建小拱棚并覆蓋一層透明塑料布有助于保持空氣濕度，從而提高組培苗的存活率。

2.6.4不同移栽時間對篤斯越橘試管苗存活率的影響。將未切除愈傷組織的組培苗進(jìn)行室外移栽，結(jié)果表明，不同月份移栽的篤斯越橘試管苗存活率差異較大(表7)，5月份棚內(nèi)溫度中午可達(dá)30 ℃，篤斯越橘組培苗成活率較低；7月份氣溫達(dá)到一年中最高值，篤斯越橘組培苗移栽成活率最低；9月份氣溫開始下降，白天氣溫在20～26 ℃，但夜間溫度為5～10 ℃，氣溫轉(zhuǎn)涼后比較適于篤斯越橘這種喜陰涼植物的生長，存活率也大幅提升。

表5 不同激素處理篤斯越橘試管苗生根情況

表6 空氣濕度對篤斯越橘組培苗移栽存活率的影響

表7 不同移栽時間篤斯越橘的存活率 %

3 討論

(1)針對篤斯越橘在試管中難以生根或根系發(fā)育不良，吸收功能極弱，移栽后不易成活的特點，該試驗把生根和馴化相結(jié)合，采用試管苗瓶外生根技術(shù)，有效地縮短了育苗周期，降低生產(chǎn)成本，節(jié)省空間，同時杜絕因煉苗移栽造成死亡的現(xiàn)象，提高了苗木存活率。

(2)試管苗一般在高濕、弱光、恒溫條件下進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)，出瓶后極易失水死亡。因此瓶外生根采取覆膜或噴霧等方法保證空氣相對濕度(80%～90%)，溫度控制在25 ℃左右較為適宜，并及時增加光照，以保證苗基部的正常呼吸，并防止葉片失水萎蔫。瓶外生根后期加強(qiáng)通風(fēng)逐漸降低濕度和溫度，以增強(qiáng)幼苗的自養(yǎng)能力，促進(jìn)葉片保護(hù)功能快速完善，氣孔變小，增強(qiáng)抗性和適應(yīng)外界環(huán)境條件的能力，生根率提高。溫度、光照、基質(zhì)水分和空氣濕度的平衡是獲得較高生根率的保證[6]。

(3)該研究采用經(jīng)發(fā)酵的混合有機(jī)基質(zhì)誘導(dǎo)生根，結(jié)果表明，不同基質(zhì)試管苗生根效果差異較大，其中以處理⑤較適宜誘導(dǎo)生根，且以ABT 1 000 mg/L生根效果較好。該基質(zhì)比無機(jī)基質(zhì)輕，營養(yǎng)豐富，便于攜帶，有效地降低勞動強(qiáng)度。同時利用該基質(zhì)可以有效減少換苗床土造成的苗木死亡率。

4 小結(jié)

(1)篤斯越橘新品種“紫水晶”外植體采用0.1%升汞消毒3 min是較合適的滅菌方法，既達(dá)到滅菌的目的，又對外植體無損傷。

(2)以3月份接種的嫩芽相對染菌率低，生長速度較快，初分化早，在接種的第8天開始分化。7月接種染菌率高，10月接種芽苗生長緩慢。

(3)該研究表明，WPM(改良)+6-BA 1.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L為篤斯越橘“紫水晶”的分化增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)35 d平均苗數(shù)7.1個，平均苗高5.83 cm。

(4)通過增加光照強(qiáng)度(3 000 lx)進(jìn)行試管壯苗培養(yǎng)，使試管苗莖桿增粗，葉片發(fā)紅，幼莖組織充實，木質(zhì)化程度提高，從而增強(qiáng)適應(yīng)外界環(huán)境的能力。

(5)將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)的試管苗速蘸(30 s)ABT 1 000 mg/L于9月份進(jìn)行試管外生根誘導(dǎo)，移栽基質(zhì)為混配有機(jī)基質(zhì)鋸末+樹皮+草炭=1∶1∶1，空氣相對濕度80%～90%，培養(yǎng)溫度為20～25 ℃，移栽50 d后生根率達(dá)72.4%。

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Key Technology of CultureinvitroofVacciniumuliginosum“Zishuijing”

TIAN Xin-hua, WENG Hai-long, LI Jing, XING Ya-juan*

(Heilongjiang Institute of Forestry Sciences, Harbin, Heilongjiang 150081)

[Objective] To discuss cultureinvitrokey technology forVacciniumuliginosum“Zishuijing”. [Method] Through explants sterilization method, sampling time, proliferation, rooting, seedling screening and optimization of culture, asexual matching reproduction system suitable for “Zishuijing” was established. [Result] The experiment shows: the sterilization of explants disinfection using 0.1% HgCl23 min; WPM (improved) +6-BA1.0 mg/L+ZT1.0 mg/L “Zishuijing” differentiation medium; rootless plantlets transplanted to sawdust mixed organic matrix in September: bark peat 1∶1∶1, air relative humidity 80%-90%, culture temperature of 20-25 ℃, the rooting rate reached 72.4%. [Conclusion]invitroculture key technology forVacciniumuliginosum“Zishuijing” was established, which will provide technical support for large-scale seedling.

Vacciniumuliginosum; Zishuijing;invitro; Condition optimization

黑龍江省林業(yè)廳資助項目(201004068-6)；森工總局科技成果轉(zhuǎn)化項目(sgzjT2013005)。

田新華(1976- )，女，黑龍江肇東人，副研究員，碩士，從事森林培育、遺傳育種研究。*通訊作者,研究員,博士，從事森林培育方面研究。

2015-02-09

S 188

A

0517-6611(2015)09-030-03