不同外源激素及活性炭的添加對白芨增殖的影響

江勝德，郭 蘭，王鄺佳，楊蘭蘭

(1.江蘇省昆山虹越花卉有限公司，江蘇昆山 215300；2.浙江省杭州虹越花卉有限公司，浙江杭州 310000)

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不同外源激素及活性炭的添加對白芨增殖的影響

江勝德1，郭 蘭2，王鄺佳2，楊蘭蘭1

(1.江蘇省昆山虹越花卉有限公司，江蘇昆山 215300；2.浙江省杭州虹越花卉有限公司，浙江杭州 310000)

[目的] 研究不同外源激素配比以及不同量的活性炭添加對白芨叢生芽增殖的影響，以實現(xiàn)不同外源激素對白芨增殖的配比優(yōu)化。 [方法]以MS為基本培養(yǎng)基，通過細(xì)胞分裂素(6-BA)和生長素(NAA)的不同配比添加，研究其對白芨組培苗增殖的影響。[結(jié)果]當(dāng)6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L時，白芨增殖系數(shù)最高，達(dá)4.00；另外，活性炭添加可防止白芨苗褐化，但當(dāng)添加量為0.20 g/L時，不僅有效地抑制了白芨組培苗的褐化，而且對白芨的生長分化影響最小。 [結(jié)論]適合白芨增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L， 活性炭添加量為0.20 g/L。

白芨；組織培養(yǎng)；叢生芽增殖；活性炭

白芨(Bletillastriata(Thunb.) Reichb.f.)為蘭科(Orchidaceae)植物白芨屬多年生草本植物[1]，主要分布于我國秦嶺以南，以及朝鮮和日本等國[2-3]。白芨不僅鱗莖具有明顯的止血效果[4-5]，而且花色艷麗，是一種很好的觀賞植物，因此，市場對白芨的需求量很大。野生白芨在我國大部分地區(qū)遭到毀滅性采挖，目前野生資源瀕臨枯竭。白芨用途廣泛，人工繁育是提高白芨產(chǎn)量的有力措施。傳統(tǒng)的栽培主要靠分株繁殖[6-9]。但分株繁殖周期長，且繁殖率很低，不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求[10]。雖然也可采用種子繁殖，但種子非常細(xì)小且無胚乳，因此在自然條件下很難萌發(fā)和生長，實生苗的栽培較難成活[6]。鑒于各種營養(yǎng)物質(zhì)可通過白芨的種孔進(jìn)入種子內(nèi)部[11-12]，現(xiàn)已在白芨快速繁殖體系中采用種子進(jìn)行無菌播種，成功取得無菌苗[3]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以在短時間內(nèi)繁殖大量優(yōu)質(zhì)種苗[13]，一定程度上可以滿足生產(chǎn)上對白芨苗的需要。與大多數(shù)蘭科植物相同，培養(yǎng)基中的激素種類和濃度配比，對白芨原球莖誘導(dǎo)及芽分化方面起著決定性作用[14]。另外，原球莖分割采用掰開法最有利于原球莖增殖[15]。但切取芽時的創(chuàng)傷也會使切口處發(fā)生褐變[16]，在培養(yǎng)基中添加活性炭可以吸附有害物質(zhì)，能有效地控制褐化發(fā)生[17]，對形態(tài)發(fā)生和器官形成有良好作用。筆者主要利用組織培養(yǎng)技術(shù)研究不同外源激素配比以及不同量的活性炭添加對白芨叢生芽增殖的影響，以實現(xiàn)不同外源激素對組培白芨增殖的配比優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1試驗材料。采用浙江虹越花卉有限公司提供的白芨無菌組培苗(圖1)。

1.1.2試驗儀器。雙人單面凈化工作臺，型號SW-CJ-2D，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；光照培養(yǎng)架，型號PYJ-5-8，購自上海組培生物科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，型號YXQ-LS，購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PH計，型號PHS-3C，購自上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。1.2 試驗方法

1.2.1培養(yǎng)條件。組培室內(nèi)環(huán)境溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lx，光照12 h/d，培養(yǎng)60 d后對白芨增殖數(shù)進(jìn)行計數(shù)，并進(jìn)行分析。

1.2.2不同外源激素對白芨增殖的影響。 將2～3 cm高的白芨組培苗單株接種在培養(yǎng)基上，6-BA設(shè)計5個濃度水平：1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L，NAA設(shè)計3個濃度水平：0.1、0.2、0.3 mg/L，組合成15種不同濃度配比，添加到MS培養(yǎng)基中組成15種培養(yǎng)基(表1)。每種培養(yǎng)基5瓶，5次重復(fù)，每瓶培養(yǎng)基接種5棵白芨組培苗。

表1 白芨誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基

NAAmg/L6-BA∥mg/LA1(1.0)A2(1.5)A3(2.0)A4(2.5)A5(3.0)B1(0.1)A1B1A2B1A3B1A4B1A5B1B2(0.2)A1B2A2B2A3B2A4B2A5B2B3(0.3)A1B3A2B3A3B3A4B3A5B3

1.2.3活性炭對白芨叢生芽增殖的影響。 以最佳細(xì)胞分裂素(6-BA)和生長素(NAA)的配比添加到MS培養(yǎng)基中， 將2～3 cm高的白芨組培苗單株接種在MS培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)基中添加不同濃度水平的活性炭：0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/L，共5種培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基5瓶，5次重復(fù)，每瓶培養(yǎng)基接種5棵白芨組培苗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外源激素配比對白芨增殖的影響將2～3 cm高的單株白芨組培苗接種到MS培養(yǎng)基上，60 d后， 分別對各處理進(jìn)行增殖系數(shù)平均值計數(shù)并進(jìn)行方差分析。

分別對6-BA和NAA的影響效應(yīng)進(jìn)行檢驗，其零假設(shè)：6-BA或者NAA對白芨叢生芽增殖沒有顯著性差異。但6-BA和NAA的相伴概率P值都接近0，明顯小于顯著水平0.05，所以6-BA和NAA對白芨叢生芽增殖有顯著性影響。對6-BA和NAA的交互作用進(jìn)行檢驗，P值為0.024，小于顯著性水平，表明2種激素的交互作用對白芨叢生芽增殖有顯著影響。

由表2可知，6-BA在0.05水平上與增殖倍數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)；NAA在0.01水平上與增殖倍數(shù)呈極顯著正相關(guān)。研究表明，當(dāng)培養(yǎng)基中只含6-BA一種激素，且當(dāng)6-BA<2.5 mg/L時，隨著6-BA濃度的升高，白芨的增殖系數(shù)越高，最高增殖倍數(shù)為5.0[18]。而6-BA與增殖倍數(shù)的Pearson相關(guān)性為-0.290，表明在添加NAA的培養(yǎng)基中，6-BA對白芨叢生芽的增殖影響減弱。通過F檢驗，NAA的F值為18.198，是影響白芨叢生芽增殖的主導(dǎo)因子。

表2 白芨增殖的Pearson相關(guān)性

6-BA∥mg/LNAA∥mg/L增殖倍數(shù)6-BA∥mg/L1NAA∥mg/L0.0001增殖倍數(shù)-0.290*0.469**1

注：*在 0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；**在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

由表3可知，6-BA和NAA對白芨的增殖有促進(jìn)作用，不同濃度組合的增殖效果表現(xiàn)出一定差異。培養(yǎng)基為A3B2，即MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L 時，白芨增殖系數(shù)最高，為4.00。比袁寧等[2]采用NAA 0.15 mg/L+6-BA 1.0 mg/L組合得到的增殖系數(shù)2.88明顯增高，比彭麗麗等[19]采用NAA1.5 mg/L+6-BA2.5 mg/L組合得到的增殖系數(shù)2.0增加一倍。這一配比保證了在最短時間增殖出更多的組培苗且增殖出的組培苗生長快、壯。

表3 各處理間比較

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2 不同濃度活性炭對白芨叢生芽增殖的影響將2～3 cm高的單株白芨組培苗接種到MS培養(yǎng)基上，60 d后， 分別對各處理進(jìn)行計數(shù)并進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果見表4。

由表4可知，當(dāng)添加活性炭為0.20 g/L時，培養(yǎng)基未出現(xiàn)褐化且對白芨的增殖影響較小，有利于白芨長時間在培養(yǎng)瓶中生長，這是因為活性炭吸附了部分酚類及醌類等有害物質(zhì)[20]，抑制了白芨組培苗的褐化。然而當(dāng)活性炭添加量高于0.20 g/L時出現(xiàn)副作用，即抑制了白芨的生長和分化，這是因為活性炭的添加除吸附植物分泌的酚類及醌類物質(zhì)外，還可能吸附培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和外源激素，從而抑制了白芨的生長增殖。

表4 活性炭濃度對白芨增殖的影響

活性炭濃度∥g/L增殖倍數(shù)褐化程度0.102.46cBC褐化較重生長慢0.153.08bB出現(xiàn)褐化生長緩慢0.204.02aA未褐化0.252.44cBC未褐化0.302.20cC未褐化生長慢

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論

該研究表明，培養(yǎng)基中激素種類和濃度對白芨增殖有很大影響。6-BA和NAA同時影響白芨叢生芽的增殖，NAA對白芨增殖的影響大于6-BA，是白芨叢生芽增殖的主導(dǎo)因子。當(dāng)MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L 時，白芨增殖系數(shù)最高，為4.00，且增殖出來的白芨組培苗生長快、壯。

當(dāng)活性炭的添加量為0.2 g/L時，不僅有效地抑制了白芨組培苗的褐化，而且對白芨的生長分化影響最小。

近年來，在對于蘭科植物的組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，蘭科植物根部共生菌可以加快植物的繁殖速度[21]，所以關(guān)于白芨根部共生菌的研究是一個新的研究方向。

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The Effect of the Addition of Different Exogenous Hormones and Activated Carbon onBletillastriataProliferation

JIANG Sheng-de1, GUO Lan2, WANG Kuang-jia2et al

(1. Kunshan Rainbow the Flower Co. Ltd, Kunshan, Jiangsu 215300;2. Hangzhou Rainbow the Flower Co. Ltd ,Hangzhou, Zhejiang 310000)

[Objective] The aim was to study the effect of the addition of different exogenous hormones and activated carbon onBletillastriataproliferation, in order to achieve proportioning optimization of different exogenous hormones onBletillastriataproliferation. [Method] With MS as the basic culture medium, by adding the different proportion of cytokinin (6-BA) and auxin (NAA) , the effect of the addition of different exogenous hormones and activated carbon onBletillastriataproliferation was studied.[Result]6-BA and NAA in accordance with the "6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L ratio, coefficient ofBletillastriataproliferation was highest with 4.00; In addition, adding activated carbon could preventBletillastriatabrowning, but when the content was 0.20 g/L, it not only effectively suppressBletillastriatabrowning, but also did not affect the growth ofBletillastriata. [Conclusion]Bletillastriataproliferation medium was MS + 6-BA 2.0 mg/L + 0.2 mg/L NAA, and activated carbon content was 0.20 g/L.

Bletillastriata;Tissue culture; Proliferation of cluster buds; Activated carbon

江蘇省農(nóng)業(yè)科技支撐計劃項目 “白芨與野生黃花白芨遠(yuǎn)緣雜交新品種選育及組培苗工廠化生產(chǎn)與示范項目(BE2014323) ；江蘇省昆山市農(nóng)業(yè)科技計劃項目 “藥用觀賞花卉白芨組培苗無菌檢測技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)”(KN1319)；浙江省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目“基于無菌檢測的藥用花卉白芨組培苗的工廠化生產(chǎn)與示范”。

江勝德(1962- )，男，浙江臨安人，高級工程師，從事特種花卉栽培及生物技術(shù)研究。

2015-02-12

S 567.1

A

0517-6611(2015)09-024-02