UPLC-MS 同時(shí)測定赤芍中五個(gè)指標(biāo)成分的含量

胡 杰，李月婷，侯靖宇，王愛民，黃 勇*

1 貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2 貴陽醫(yī)學(xué)院 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴陽 550004

赤芍為毛茛科植物芍藥(Paeoniae lactiflora Pall.)或川赤芍(Paeoniae veitchii Lynch)的干燥根［1］。其味苦、微寒、歸肝經(jīng)，具有清熱涼血、散瘀止痛之功效，是中藥中具有代表性的活血化瘀藥物，在臨床上應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，赤芍具有多方面的作用，如抗血栓形成、抗血小板聚集、抗菌、抗炎、抗病毒等［2］。鑒于赤芍藥效作用廣泛、成分多樣，宜選用多指標(biāo)成分測定的方法，較為全面、綜合地反映和控制赤芍的質(zhì)量［3-5］。文獻(xiàn)報(bào)道，赤芍的主要有效部位為芍藥總苷，其中包括芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等［6］。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS 聯(lián)用技術(shù)對12 批不同產(chǎn)地赤芍藥材中芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷和沒食子酸5 種指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定，為赤芍藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)［7］。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

ACQUITY 系統(tǒng)超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，包括二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、三重四級桿質(zhì)量分析器和Masslynx4.1 質(zhì)譜工作站(美國waters 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

沒食子酸(1)和葛根素(6)對照品(均購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110831-200803、0752-9605，純度≥98%);氧化芍藥苷(2)、芍藥內(nèi)酯苷(3)、芍藥苷(4)、苯甲酰芍藥苷(5)對照品(均購自中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，批號分別為Y10-130912、S37-100126、110736–200934、B14-130912，純度≥98%);乙腈、甲酸為色譜純，甲醇為分析純。

赤芍藥材來源見表1，由貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥用植物學(xué)與生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為毛茛科植物芍藥(P.lactiflora Pall.)或川赤芍(P.veitchii Lynch)的干燥根。

表1 赤芍藥材來源表Table 1 Source of Radix Paeoniae Rubra

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm);流動(dòng)相0.1%甲酸乙腈溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～3.0 min，5%～25%A;3.1～4.0 min，25%～90%A;4.1～5.0 min，90%～5%A);流速0.35 mL/min;柱溫45 ℃;進(jìn)樣量1 μL;分析時(shí)間為5 min。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，毛細(xì)管電壓3 KV，離子源溫度120 ℃，去溶劑氣(氮?dú)?650 L/h，去溶劑氣溫度350 ℃，碰撞氣(氬氣)0.18 mL/min;選擇性離子監(jiān)測(SIR)模式進(jìn)行正負(fù)離子同步監(jiān)測;沒食子酸等六種成分用于定量分析的監(jiān)測離子見表2。

表2 質(zhì)譜分析條件Table 2 MS analysis condition

2.3 溶液配制

2.3.1 對照品溶液

分別精密稱取1～5 對照品10 mg，各置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得1 mg/mL的1～5 對照品儲備液;精密稱取內(nèi)標(biāo)6 對照品10 mg，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，從10 mL 容量瓶中吸取2 mL 溶液置于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容，制得0.02 mg/mL 的6 對照品儲備液。

2.3.2 供試品溶液

精密稱取供試品約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定重量，浸泡4 h，超聲30 min，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，離心(15000 g)10 min，取上清液進(jìn)樣。

2.4 專屬性試驗(yàn)

分別精密稱取1～6 對照品適量，制成1～6 濃度分別為20.0、20.5、20.1、21.4、20.2 和20 μg/mL的混合對照品溶液。精密吸取混合對照品溶液和赤芍藥材溶液各1 μL，分別進(jìn)樣，結(jié)果見圖1。供試品溶液中被測定化合物與6 個(gè)對照品的保留時(shí)間相同。比較被測定成分和對照品的質(zhì)譜圖，兩者一致，表明本法專屬性良好。

2.5 線性試驗(yàn)

分別取“2.3”項(xiàng)下1～5 對照品儲備液適量，制成1～5 濃度分別為31.25、2.78、30.75、75.04、40.36 μg/mL 的混合對照品溶液。依次逐級稀釋，再分別加如一定量的20 μg/mL 的葛根素內(nèi)標(biāo)，制得6個(gè)濃度的系列濃度線性工作液，分別進(jìn)樣測定。以對照品濃度c(X)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值A(chǔ)s/Ai(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸?；貧w方程、定量限(LOQ)和檢測限(LOD)等結(jié)果見表3。

圖1 混合對照品溶液(A)和供試品溶液(B)的UPLC-MS 選擇離子色譜圖Fig.1 UPLC-MS selected ion chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

表3 5 種成分的線性關(guān)系Table 3 Linear relationships of the 5 investigated compounds

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批赤芍藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，計(jì)算1～5 含量的RSD 分別為4.60%、3.71%、4.32%、4.05% 和4.45%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

同批的供試品溶液，連續(xù)測定3 d，每天進(jìn)樣6次，測定峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果1～5 的日內(nèi)和日間RSD(%，n=6)分別為4.80%、4.67%、3.27%、4.37%和2.84%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于處理后0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣分析，1～5 含量的RSD 分別為4.20%、3.83%、4.03%、4.17%和2.61%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

精密稱取9 份已知含量的赤芍樣品適量，平均分為3 組，分別精密吸取125、250 和375 μL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1～5 濃度分別為5.00、1.28、7.53、18.76和2.52 μg/mL)樣品測定，制成低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，室溫?fù)]干，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，結(jié)果見表4。

2.10 樣品測定

按“2.3”項(xiàng)下方法制備12 批樣品的供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，計(jì)算得樣品中1～5 的含量，結(jié)果見表5。

除Y3 和Y4 外，其余批次的藥材皆符合《中國藥典》對赤芍藥材的質(zhì)量要求1。12 批藥材里，Y6中芍藥苷的含量最高，但五個(gè)有效成分綜合含量最高的是Y9。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果(%，n=3)Table 4 Testing results of recovery(%，n=3)

表5 12 批赤芍藥材中5 個(gè)成分的含量(%，n=3)Table 5 Determination of 5 compounds from 12 batches of Radix Paeoniae Rubra samples(%，n=3)

3 討論

目前，大多機(jī)構(gòu)遵循《中國藥典》，通過測定中藥中某一有效成分的含量來評價(jià)該藥材的優(yōu)劣［1，8］。但中藥作為一種多療效多靶點(diǎn)的復(fù)雜天然藥物，單一成分的含量并不能體現(xiàn)其真實(shí)藥效，因此，對中藥有效部位中包含的各成分綜合測定，能夠?qū)崿F(xiàn)對該中藥質(zhì)量較全面地評價(jià)［6，9］。

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS 聯(lián)用技術(shù)，將UPLC 對中藥復(fù)雜成分的高分離度與MS 的高靈敏度、高選擇性以及能夠提供相對分子量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，建立了應(yīng)用UPLC-MS 同時(shí)測定赤芍藥材中5個(gè)指標(biāo)成分的方法［10］。該方法具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，并且分析速度快，僅5 min就能夠完成檢測工作，較大地提高了分析效率，為中藥復(fù)雜樣品檢測分析、質(zhì)量控制提供了一種更高效的方法［11］。

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