柱前熒光標記法結(jié)合HPLC-FLD 測定石榴中四種三萜酸

袁恩光，李國梁，*，吳宏亮，劉書成，夏 蓮，尤進茂，，索有瑞

1 曲阜師范大學生命有機分析重點實驗室，曲阜 273165;2 中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810001;3廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，湛江 524088

三萜酸總體可以分為羽扁豆烷型、齊墩果烷型、熊果烷型等結(jié)構(gòu)類型(常見的三萜酸結(jié)構(gòu)式見圖1)。通過對三萜酸類化合物的生物活性及毒性研究，發(fā)現(xiàn)其具有溶血、抗炎、抗菌、抗病毒、降低膽固醇、殺軟體動物等活性［1］。近期許多研究也表明三萜酸具有抗腫瘤和抗HIV 病毒的活性［2］。目前三萜酸類化合物中齊墩果酸和熊果酸的研究最為廣泛，其在預防癌癥、保肝護肝等方面有特殊的功效，并且還具有強心、降壓、降脂、降糖等方面生理功能［3］。在許多中藥中三萜酸類化合物能表現(xiàn)出特殊的生理活性，例如枇杷葉中的三萜酸具有鎮(zhèn)咳［4］、降血糖［5］、調(diào)節(jié)免疫力［6］抗抑郁［7］的功能;山楂中的三萜酸具有預防動脈粥樣硬化［8］和降血脂［9］的功能。三萜酸因其結(jié)構(gòu)復雜人工合成困難，目前主要從天然植物中提取獲得，因此尋找富含三萜酸類化合物的植物來源越來越引起人們的廣泛關(guān)注和重視。

在天然藥物中，自身具有較大共軛體系的化合物如黃酮類、蒽醌類等可以在紫外檢測器或者熒光檢測器下進行準確的測定。但是三萜酸類分子本身并沒有共軛體系并且紫外吸收也比較低，所以很難采用一般的分光光度法對其含量進行準確的測定。近年來所采用的氣相色譜、HPLC-UV［10］、HPLCMS［11］、毛細管電泳［12］等在選擇性、靈敏性、準確性和效率方面都沒有太大的進步或者存在諸多的缺點和不足。本實驗采用HPLC-FLD-MS 技術(shù)，2-(7H-二苯并［a，g］咔唑)乙基對甲苯磺酸酯(DBCETS)作為熒光標記試劑，建立了高靈敏、高選擇性的三萜酸檢測方法，該方法可在45min 內(nèi)實現(xiàn)4 種三萜酸的基線分離，檢測限(S/N=3)可達1.10～1.48 ng/mL，這種方法與常規(guī)方法相比具有快速、高效、靈敏等優(yōu)點。

石榴是一種具有較高營養(yǎng)價值和保健功能的藥食兩用資源，有“全身是寶”的美稱。目前我國已成為是世界上第一大石榴種植國。從石榴皮中鑒定出來的化合物主要有黃酮類、生物堿類、鞣質(zhì)類、有機酸類等［13］，石榴中三萜酸成分的報道較少，只有關(guān)于齊墩果酸與熊果酸的報道［14］。本實驗將利用新建立的方法首次對石榴不同部位中科羅索酸、山楂酸、齊墩果酸及熊果酸進行分析測定。

圖1 山楂酸(a)、科羅索酸(b)、熊果酸(c)、齊墩果酸(d)的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of maslinic acid(a)，corosolic acid(b)，ursolic acid(c)and oleanolic acid(d)

1 材料與方法

1.1 實驗藥品

三萜酸標準對照品，包括山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸均購自Sigma 公司(圣路易斯，密蘇里州，美國);HPLC 級乙腈(CH3CN)購自禹城化學試劑有限公司(山東省，中國);2-(7H-二苯并［a，g］咔唑)乙基對甲苯磺酸酯(DBCETS)為實驗室自制;娃哈哈純凈水、碳酸鉀和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等其它試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備與條件

Agilent 1100 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 公司，美國)，配備四元梯度泵(G1311A)、在線真空脫氣機(G1322A)、熒光檢測器(G1321A)和自動進樣器(G1316A);質(zhì)譜系統(tǒng):Esquire-LC NT software;高效液相系統(tǒng)軟件:HP ChemStation;色譜條件:Hypersil BDS C18柱(200×4.6 mm，5 μm，依利特公司，大連，中國)，流速為1.0 mL/min，進樣量10 μL，柱溫25 ℃，熒光激發(fā)和發(fā)射波長分別為300 nm 和395 nm;流動相為乙腈/水(5∶95，v/v)(A)和乙腈(B);梯度洗脫程序:0～5 min，65%B;5～15min，65%～90%B;15～38 min，90%～92%B;38～40 min，92%～93%B;40～45 min，93%～100%B。所用流動相經(jīng)過0.2(m 的尼龍膜過濾。質(zhì)譜條件:大氣壓化學電離源(APCI)，正離子模式，噴霧壓力60 psi，干燥氣流量為5 L/min，干燥氣溫度350 ℃，Vap 溫度450 ℃，毛細管電壓3500 V，電暈電流4000 μA(Pos)。KQ-100DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 石榴樣品

石榴(Punica granatum)采自中國山東棗莊地區(qū)，將石榴樣品的果皮、石榴花、石榴籽各部分分開，在50 ℃條件下干燥至恒重，用不銹鋼碾碎器碾成粉末后過篩(60 目)，儲存在冰箱中備用。稱取10 g粉末樣品，于三頸燒瓶中加入100 mL 90%乙醇，超聲萃取10 min，取部分提取液進行抽濾，取所得濾液2 mL 氮氣吹干，殘余物用200 μL 乙腈重新溶解備用。

1.4 標準溶液的配制

準確稱取23.25 mg DBCETS 用DMF 定容至10 mL，相應低濃度的溶液用DMF 稀釋而成。稱取三萜酸標品，用乙腈/DMF(9∶1，v/v)配制成濃度為1×10-2mol/L 標液，相應低濃度的三萜酸標品用乙腈/DMF(9∶1，v/v)稀釋而成，放置于冰箱中于4 ℃下保存。

1.5 熒光標記條件優(yōu)化

響應面法在較少的時間次數(shù)和較短的時間內(nèi)對所進行的實驗進行全面研究與分析。在熒光標記條件優(yōu)化實驗中選取標記時間(min)、標記溫度(°C)及標記試劑用量進行組合。以-1、0、1 代表自變量水平，按方程xi=(Xi-X0)∕ΔX 對自變量進行編碼。其中，xi為自變量的編碼值;Xi為自變量的真實值;X0為實驗中心點處自變量的真實值;ΔX 為自變量的變化步長。實驗因素見表1。

采用Design Expert(Trial Version 7.0.3，Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN，USA)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，擬合二次多項式方程可以表達為:

式中:Y 為預測響應值(衍生化效率);Xi和Xj為自變量編碼水平;β0為常數(shù)項;βi為線性回歸系數(shù);βii為二次項回歸系數(shù);βij為交互項回歸系數(shù)。多項式模型方程擬合可靠性由R2表達，其統(tǒng)計學上的顯著性由F 值檢驗。

1.6 三萜酸熒光標記

向2 mL 安瓿瓶中依次加入200 μL 衍生試劑，30 μL 三萜酸混合標品或樣品提取溶液(100 μL)，10 mg K2CO3和125 μL DMF，密封后于90 ℃水浴中振蕩反應30 min，完畢后放置冷卻，向衍生液中加入500 μL 乙腈/DMF(1∶1，v/v)稀釋后直接進樣10 μL。三萜酸的熒光標記概況圖見圖2。

圖2 三萜酸熒光標記示意圖Fig.2 The derivatization of DBCETS with betulinic acid

2 結(jié)果與討論

2.1 三萜酸標記條件優(yōu)化

本研究采用三因素三水平BBD 設(shè)計優(yōu)化標記試劑用量、標記時間及標記溫度，實驗結(jié)果列于表1中。方差分析表明，模型具有較高的顯著性(P＜0.001)，溫度對衍生反應影響不顯著。R2＞0.96 表明，實驗數(shù)據(jù)與模型預測值相吻合。失擬項的F 值不顯著，意味著模型對于預測反應精確性很高。變異系數(shù)(C.V.%)小于9.76%表示該模型具有很好重復性。通過對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得多元二次回歸模型:

通過響應面圖可直觀地反映各因素的交互作用對響應值的影響，從而確定最佳衍生條件。圖3a 為標記試劑用量與標記時間對標記效率的影響，如圖所示隨著衍生試劑量的增加，衍生效率增加，當標記試劑量達到一定值時，隨著標記試劑量的增加衍生效率略有降低;標記時間從25 min 提高到35 min 過程中，隨著時間的延長，標記效率先升高到最大值，然后趨于穩(wěn)定。另外圖3b 為標記時間與標記溫度對衍生化效率的影響;圖3c 為標記溫度與標記試劑用量對標記效率的影響。通過軟件Design-Expert求解回歸方程，得到三萜酸熒光標記的最佳標記條件:標記試劑與三萜酸摩爾比為7，標記溫度為90 °C，標記時間為30 min，模型預測值為1325，在此條件下進行3 次平行實驗，測定得峰面積為1390，與預測值基本吻合，偏差較小，證明該模型用于優(yōu)化三萜酸的標記條件是可行的。

表1 響應面實驗因素與水平、實驗設(shè)計及結(jié)果(峰面積)Table 1 Factors，levels and response values(peak area)of response surface analysis

注:X1:時間;X2:溫度;X3:試劑與標準品摩爾比。Note:X1:labeling time;X2:reaction temperature;X3:molar ratio of labeling reagent to standard.

圖3 因素交互作用對三萜酸標記效率影響的響應面圖Fig.3 The 3D response surface plots of peak area affected by labeling conditions

2.2 色譜分離與質(zhì)譜鑒定

本研究對不同色譜柱包括Hypersil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil BDS C8(200 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil BDS C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)、Spherisorb C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)進行了評估，結(jié)果表明Hypersil BDS C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)分離效果最好。同時我們還對不同的流動相進行了考察，結(jié)果表明最佳流動相為A:乙腈/水(5∶95，v/v)，流動相B:100%乙腈?；旌蠘藴势返纳V圖見圖4。實驗中通過標準對照品保留時間及在線質(zhì)譜對各色譜峰進行定性。三萜酸衍生物產(chǎn)給出強烈的分子離子峰，分子離子碰撞誘導解離后產(chǎn)生多個特征碎片離子峰。代表性的熊果酸衍生物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)見圖5，如圖所示熊果酸衍生物在質(zhì)譜條件下產(chǎn)生分子離子峰m/z 747.8(MS)，特征碎片峰m/z 294.4、m/z 409.3 和m/z 730(MS/MS)。

2.3 線性回歸方程、檢出限重現(xiàn)性和回收實驗

圖4 混合標準品色譜圖:過量熒光標記試劑(a)、山楂酸(b)、科羅索酸(c)、齊墩果酸(d)、熊果酸(e)Fig.4 HPLC-FLD chromatogram of the mixed standard:excessive fluorescent labeling reagent(a)，maslinic acid(b)，corosolic acid(c)，oleanolic acid(d)and ursolic acid(e)

本實驗采用建立的色譜方法，進樣量在0.025～6.0 μg/mL 范圍內(nèi)，依據(jù)峰面積和進樣量，對所測定的三萜酸類化合物進行線性回歸，所得各衍生物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限(信噪比按S/N=3計算)見表2。方法的檢測限為1.10～1.48 ng/mL。對三萜酸衍生物平行六次分析，保留時間和峰面積的相對標準偏差在0.01%～0.05% 和1.28%～1.85%范圍內(nèi)。

圖5 熊果酸衍生物的質(zhì)譜裂解模式圖Fig.5 MS and MS/MS spectra of representative ursolic acid derivative and the cleavage mode of protonated molecular ion

為了評估實驗的準確性，稱取一定量的石榴樣品，精確加入一定量的三萜酸對照品進行提取分析，并計算回收率?；厥章矢鶕?jù)公式(測量值-內(nèi)源性值)/添加值×100% 計算，結(jié)果見表2，三萜酸的回收率在92.9%～100.4%之間。

表2 線性方程、檢測限、精密度和準確度Table 2 Linear equations，detection limits，precision and accuracy of the developed HPLC-FLD method

2.4 新建立的方法與已報道方法對比

將建立的新方法與已報道的三萜酸測定方法進行比較，對比結(jié)果見表3。在大多數(shù)情況下，三萜酸利用HPLC 結(jié)合各種檢測器直接測定，沒有采用衍生化的方法。但是三萜酸沒有生色基團，最常用的檢測波長是205 nm 附近，這會導致檢測限偏高和基線波動，不能實現(xiàn)三萜酸的準確定量分析。HPLC結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)，質(zhì)譜(MS)和核磁共振(NMR)也有報道，得到的檢測限在pmol/μL 水平(見表3)。本方法給出的檢測限為1.10～1.48 ng/mL，明顯低于表3 中已報道的方法(HPLC-MS、GC、CE 等)，表明該方法比已報道的方法具有更高的檢測靈敏度。此外HPLC-MS 儀器設(shè)備昂貴，且普及率低，而HPLC-FLD 設(shè)備價格相對便宜，一般常規(guī)實驗室均有配備。

表3 新建立的方法與已報道方法對比Table 3 Comparison of the developed method with traditional methods

2.5 石榴樣品中三萜酸分析

我們將新建立的方法應用于石榴中不同部位(包括果石榴皮、石榴花、石榴籽)的三萜酸分析。石榴中的不同部位色譜圖見圖6。其中有四種三萜酸被檢測到，包括山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸。四種三萜酸的含量見表4。石榴中不同部位三萜酸含量有差異。例如:石榴花中的齊墩果酸和熊果酸含量明顯比山楂酸和科羅索酸高，而石榴皮和石榴籽中的四種三萜酸的含量差距相對比較小。石榴花中的齊墩果酸和熊果酸含量很高可達201.5 mg/g 和206.3 mg/g。石榴籽中的科羅索酸含量最高。石榴皮中的四種三萜酸含量相對都較少。

圖6 石榴花(A)、石榴皮(B)及石榴籽(C)的HPLC-FLD 色譜圖Fig.6 HPLC-FLD chromatograms of pomegranate flower(A)，pomegranate rind(B)and pomegranate seeds(C)

表4 石榴中不同部位四種三萜酸的含量Table 4 Triterpenic acid content in different parts of pomegranate

3 結(jié)論

本實驗首次采用DBCETS 作為熒光標記試劑，結(jié)合HPLC-FLD-MS 技術(shù)，建立了快速、高靈敏的三萜酸檢測方法。對石榴中三萜酸柱前熒光標記條件進行了系統(tǒng)研究，從而保證了三萜酸的充分提取及熒光標記。該分析方法可在45 min 內(nèi)實現(xiàn)4 種三萜酸的基線分離，檢測限(S/n=3)可達1.10～1.48 ng/mL，與已報道方法相比具有檢測靈敏度高、選擇性強、分析時間短等優(yōu)勢。將建立的方法對石榴中的不同部位包括石榴皮、石榴花、石榴籽中的三萜酸組分進行了準確定量分析。該研究為三萜酸的檢測方法研究提供了新思路，建立的方法可廣泛應用于其它植物樣品中三萜酸快速、高靈敏檢測分析。同時該研究得到的石榴中不同部位的三萜酸含量信息，為石榴資源的綜合利用及深層次產(chǎn)品開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

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