毛尖茶葉多糖及其結合物的抗氧化活性研究

曲 偉，王孟君，于海燕，劉 鈺，田旭東，范海濤2，，4*

1 北京聯(lián)合大學，北京 100101;2 軍事醫(yī)學科學院，北京 100850;3 北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院，北京 100029;4 北京大學醫(yī)學部藥學院，北京 100191

茶葉作為歷史悠久的飲品，經(jīng)研究具有降血糖、降血脂、抗氧化、清除自由基、提高免疫力和抗腫瘤等活性［1，2］，羅祖友等［3，4］闡明了藤茶多糖抗氧化和清除自由基與抗腫瘤、提高免疫力的作用關系，為研究和理解植物多糖的藥理活性提供了依據(jù)。諸多研究表明，茶葉中多種化學成分產(chǎn)生抗氧化和清除自由基活性，包括多酚類、氨基酸、兒茶素、多糖等［5，6］，關于茶葉多糖的抗氧化和清除自由基活性研究均是以不同方法處理的茶葉多糖作為活性測試對象［7，8］，多糖結合物對多糖活性貢獻的研究至今未見報道。

多糖屬于多羥基大分子物質(zhì)，可與其他物質(zhì)結合形成多糖復合物，結合物的活性會表現(xiàn)在多糖復合物的活性中，Chen HX 等［9］在綠茶抗氧化活性研究中稱研究對象為多糖結合物(polysaccharide conjugate)。王元鳳等［10］通過實驗證實茶多糖結合金屬離子形成絡合物后清除自由基活性會發(fā)生變化，提示直接將除蛋白后并以多種常規(guī)方法精制的多糖作為研究對象考察多糖的抗氧化和清除自由基活性的結果并不能真實反映多糖本身及其結合物的活性，具有一定的局限性，多糖結合物對多糖活性的貢獻不應被忽視。

本研究采用水提醇沉法提取毛尖茶葉多糖，經(jīng)多步處理后得到精制多糖(MP)，將MP 水解完全使糖苷鍵斷裂結合物得到釋放，水解產(chǎn)物經(jīng)C18柱層析分離后得到多糖水解的單糖及水溶性物質(zhì)部分和極性較小的多糖結合物部分，即水洗脫部分(MPHCW)和甲醇洗脫部分(MP-HCM)，并以DPPH 自由基清除法和普魯士藍法測定其活性，計算各部分的相應活性貢獻值。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CARY 50 全波長紫外掃描儀，瓦里安公司;WZZ-2S 自動旋光儀，上海精密科學儀器有限公司;安捷倫7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，DB-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，質(zhì)譜檢測器，安捷倫科技有限公司;安捷倫1200 高效液相色譜儀，G1352A RID 檢測器，安捷倫科技有限公司;Shodex?KS-805 凝膠色譜柱，9 mm×250 mm;旋轉蒸發(fā)儀，德國Heidolph;電子天平，奧豪斯公司;高速離心機，上海安亭科學儀器廠;冷凍干燥機，天津因賽科技發(fā)展有限公司;紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司;電熱恒溫水浴鍋，北京長安永劍科學儀器有限公司。

1.2 材料

DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)，Sigma 公司;多糖分子量測定用標準品Dextran，Sigma 公司，美國聚合物標準品公司;毛尖茶葉，購于吳裕泰北京北苑店(產(chǎn)地河南信陽);十八烷基鍵合硅膠(C18)，silicycle?C18;透析袋，MYM?，截留分子量2000 Da;苯酚，為重蒸苯酚，購自北京鼎國生物技術有限責任公司;VC，分析純，北京長城化學試劑廠;葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、氯化鈉、三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 MP 的提取與精制

稱取50 g 毛尖茶葉，沸水提取30 min，冷卻后3000 rpm 離心，取上清，50 ℃減壓濃縮至小體積，冷卻至室溫后加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分數(shù)為80%，置于4 ℃冰箱中過夜，次日棄上清，并將沉淀揮干乙醇后以水溶解后再次離心，上清液再次以80%乙醇沉淀，4 ℃冰箱中過夜后棄上清，如此反復處理多次，直至目測多糖溶液無色，將多糖溶液以Sevag 法除蛋白多次，直至其在280 nm 處無明顯紫外吸收峰，除蛋白結束，濃縮水層得粗多糖溶液，冷凍干燥得毛尖茶葉粗多糖。

將毛尖茶葉粗多糖透析處理，并以無水乙醇、丙酮反復洗滌8 次后真空冷凍干燥，即得毛尖茶葉精制多糖(MP)。本實驗室曾對該操作下的黑骨藤精制多糖進行了驗證，可保證多糖溶液中基本不含其他游離型雜質(zhì)［11］。

2.2 MP 的特性分析

2.2.1 旋光度測定

稱取MP 10.0 mg，以水溶解，定容至25 mL，以水為空白，自動旋光儀測量旋光度，經(jīng)計算，得=+62.5°。

2.2.2 分子量分布的測定

以HPLC 對系列多糖標準品和MP 進行測定，Shodex?KS-805 凝膠色譜柱，柱溫30 ℃，純水為流動相，流速0.5 mL/min，RID 檢測。

分別稱取適量的分子量為1×105、5×105、1×106、2×106、3×106Da 的Dextran 標準品，加入去離子水，將其配成濃度約0.5 mg/mL 的對照品溶液，0.22 μm 水系濾膜過濾，之后逐一進行HPLC 檢測，以保留時間(RT)為橫坐標x，分子量的log10值為縱坐標y，得標準曲線y=-0.1797x+9.0456(R=0.9456)。

稱取一定量的MP，按上述方法進行檢測，以MP 保留時間依上述標準曲線公式進行計算，得MP的分子量分布約為1.65×106～2.50×106Da。

2.2.3 單糖組成的測定

稱取MP 10 mg，以3 mL 濃度為2.23 mol/L 的TFA 溶解后置于具塞試管中封管99 ℃水解5 h，按照文獻［12］中多糖糖醇醋酸鹽衍生物的方法對MP的單糖組成和摩爾比進行測定，氣相條件為，色譜柱:DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm);檢測器:質(zhì)譜檢測器;進樣口溫度:250 ℃;檢測器溫度:280℃;氮氣流速:0.6 mL/min;分流比:20∶1;進樣量:1 μL;升溫程序:200 ℃保持2 min，以3 ℃/min 的速率升至245 ℃，再以10 ℃/min 的速率升至270 ℃，保持2 min。測得MP 由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為3.18∶0.78∶1.36∶4.29。

2.3 MP-HCW 和MP-HCM 的制備

稱取MP 50 mg，以15 mL 濃度為2.23 mol/L 的TFA 溶解后置于具塞試管中封管99 ℃水解5 h。水解結束后水解液反復加水減壓蒸至無酸味，以少量水溶解，C18柱層析進行分離，分別以水及甲醇洗脫5個柱體積，兩部分分別減壓蒸干，既得MP-HCW 和MP-HCM 部分。

2.4 MP、MP-HCM 和MP-HCW 的清除自由基活性測定

按照文獻所述方法［13］，對MP、MP-HCW 和MPHCM 進行清除自由基活性測定，以樣品對DPPH 自由基的清除率作為評價指標。

2.4.1 溶液的配制

DPPH 溶液的配制:精密稱取DPPH 8.01 mg，以60%乙醇溶解并定容至200 mL 棕色容量瓶中，得濃度為0.1 mmol/L 的DPPH 溶液，避光保存，備用。

2.4.2 測定方法及結果

取0.5 mg/mL MP 水溶液1.0 mL，置10 mL 比色管中，加入3.0 mL 的DPPH 溶液，水浴30 ℃避光反應30 min，以蒸餾水為空白，于517 nm 波長處測定吸光值。按下列公式計算DPPH 自由基清除率。

DPPH 自由基清除率(%)=［A0-(AS-AC)］/A0×100%

式中，A0—1.0 mL 蒸餾水+3.0 mLDPPH 溶液的吸光度值;AS—1.0 mL 樣品溶液+3.0 mL DPPH溶液的吸光度值;AC—1.0 mL 樣品溶液+3.0 mL無水乙醇的吸光度值。將實驗重復6 次，求得MP、MP-HCM 和MP-HCW 的DPPH 自由基清除率分別為28.99%、13.1%、23.2%，其活性貢獻關系如圖1。MP-HCM 對MP 的DPPH 自由基清除率貢獻為45.19%。

圖1 MP、MP-HCM 和MP-HCW 的DPPH 自由基清除率貢獻關系圖Fig.1 Contribution of DPPH radical scavenging rates of MP，MP-HCM and MP-HCW

2.5 MP、MP-HCM 和MP-HCW 的總還原力活性測定

按照文獻所述方法［14］，對MP、MP-HCW 和MPHCM 進行總還原力活性測定，以還原力指數(shù)作為評價指標。

2.5.1 VC標準曲線的繪制

用蒸餾水配制濃度分別為0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045 mg/mL 的VC溶液。以移液管吸取1 mL VC水溶液到具塞試管中，加入0.2 moL/L 的磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)2.5 mL 和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合溶液于50 ℃水浴保溫20 min，反應結束后30 ℃水浴冷卻5 min，加入2.5 mL10%(w/v)三氯乙酸溶液，3000 rpm 離心10 min，精密吸取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混勻。同時以1 mL 蒸餾水代替VC溶液按照如上方法操作，作為空白對照，在700 nm 處測吸光度AVC。

將配制的梯度濃度的VC標準溶液均按照上述方法測定AVC，結果繪制VC的濃度-還原力標準曲線，得標準曲線方程為AVC=7.057CVC-0.015，R=0.997。

2.5.2 樣品的測定

取0.5 mg/mL(CS)的MP 溶液，按照2.4.1 方法進行操作，重復六次，求得AS的平均值及RSD值。以VC標準曲線求得AS下VC的濃度CVC，以兩濃度的比值作為還原力指數(shù)，以評價樣品的還原力，公式如下:

還原力指數(shù)=CVC/CS

MP-HCM 和MP-HCW 以相當于0.5 mg/mL MP濃度的樣品溶液，按照上述方法進行測定，分別以甲醇和水作為空白試劑，經(jīng)測定，計算得MP、MP-HCM和MP-HCW 的還原力指數(shù)分別為0.044、0.015、0.029，其活性貢獻關系如圖2。MP-HCM 對MP 的總還原力貢獻為34.09%。

圖2 MP、MP-HCM 和MP-HCW 的還原力活性貢獻關系圖Fig.2 Contribution of reducing power of MP，MP-HCM and MP-HCW

3 討論

茶葉在我國資源豐富，飲用歷史悠久，并被認為具有較好的保健功效。現(xiàn)代醫(yī)學藥學研究對茶葉成分及其活性有廣泛研究，尤其對茶多糖的抗氧化、清除自由基等活性的研究多有報道，并有學者通過實驗證實茶多糖及其他植物多糖的抗氧化活性與提高機體免疫力和抗腫瘤等活性的潛在關系，對正確認識茶多糖的藥理作用、開發(fā)新型藥物具有重要意義。

現(xiàn)代植物化學研究范疇認為，多糖是由多個單糖通過糖苷鍵連接形成的大分子物質(zhì)，經(jīng)提取、分離、純化后在生化或體外藥理等活性檢驗中表現(xiàn)出抗氧化、清除自由基、免疫、抗腫瘤等活性。作為多羥基大分子化合物，多糖可形成空間立體結構，并可制成微膠囊與活性藥物分子結合成復合物，作為新的給藥方式［15］，可能與多糖的多羥基立體結構同藥物分子結合成穩(wěn)定復合物有關。特定多糖的空間結構可與小分子物質(zhì)形成復合物，此時多糖表現(xiàn)出的活性包含了其結合物的活性。暨南大學郭凌［16］等將瓊枝麒麟菜和異枝麒麟菜硫酸多糖部分進行了水解，探討了多糖及其水解產(chǎn)物抑菌活性的差異，雖未確證抑菌活性變化的機理，依然提示多糖水解后活性的變化趨向。

本研究以毛尖茶葉多糖為研究對象，采用酸水解的方法使多糖中糖苷鍵斷裂，多糖結合物被釋放，收集水解后的單糖部分和多糖結合物部分，并對各個部分進行活性檢測和比較，證實多糖結合物具有一定的抗氧化和清除自由基活性，并初步計算了其在多糖復合物活性中的貢獻值，對科學認識多糖提供了新的思路和依據(jù)，對天然來源多糖的研究具有重要意義。

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