棘托竹蓀菌托抑菌物質(zhì)提取、分離及活性組分

林陳強(qiáng)，林戎斌，陳濟(jì)琛，張 慧，林新堅

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究中心，福州 350013

竹蓀［Dictyophora indusiata(Vent.ex Pers)Fisch］為鬼筆科(Phallaceae)竹蓀屬(Dictyophora)大型食用菌，是一種產(chǎn)于亞洲熱帶地區(qū)的珍稀藥用菌［1］。

竹蓀具有抑菌防腐的作用［2，3］。民間發(fā)現(xiàn)竹蓀與肉共煮，可使肉湯保存較長時間而不致于腐敗變質(zhì)。因此，竹蓀中的抑菌活性物質(zhì)具有開發(fā)成天然防腐劑的潛在價值［4，5］。目前對竹蓀抑菌的研究主要以竹蓀水提物［6-8］和有機(jī)溶劑(如乙醇［5，8，9］、乙酸乙酯［2，3，10］、石油醚［11，12］、正己烷［13］、丙酮［14］等)提取物為抑菌樣液。通過抑菌研究發(fā)現(xiàn)，竹蓀提取物對霉菌、酵母及細(xì)菌具有廣泛的抑菌效果。竹蓀抑菌作用的報道多數(shù)建立在粗提物上，對抑菌成分的化學(xué)基礎(chǔ)研究較少。

竹蓀成熟子實(shí)體可分為菌蓋、菌體、菌托三大部分，對竹蓀的研究集中在其可食用的菌體部分，而對占子實(shí)體鮮重一半以上的菌托研究較少，且主要分析菌托的營養(yǎng)物質(zhì)［15-17］。檀東飛等［18］研究發(fā)現(xiàn)棘托竹蓀菌托揮發(fā)油和石油醚提取物均有抑菌作用，并采用GC-MS 進(jìn)行分析，但未明確抑菌物質(zhì)的具體成分。因此，本文以棘托竹蓀菌托為研究對象，以金色葡萄球菌為指示菌，提取菌托中的抑菌活性物質(zhì)，采用色譜法進(jìn)行分離純化、GC-MS 分析分離得到的活性組分，以期探明菌托抑菌物質(zhì)的主要成分，為利用竹蓀菌托資源，開發(fā)竹蓀天然防腐劑提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

棘托竹蓀(Dictyophora.echinovolvata)，采自福建順昌。

指示菌:金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus，枯草芽孢桿菌Bacillus subilis，大腸桿菌Escherichia coli，蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus，標(biāo)準(zhǔn)摩根氏菌Morganella Fulton，腸炎沙門氏菌Salmonella enteritidis。以上菌種由福建省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2 儀器試劑

1.2.1 主要儀器

N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司);GHP-9080 隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);中壓液相制備色譜系儀(Buchi，Pump Manager C-615，Pump Module C-605，RI DETECTOR，UV Photometer C-635);Agilent HP6890-5973N 氣質(zhì)聯(lián)用儀。

1.2.2 試劑

石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、氯仿等試劑均為分析純，中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 抑菌物質(zhì)的提取

取50 g 棘托竹蓀菌托干樣，破碎，過60 目篩，置于500 mL 具塞三角瓶，分別加入石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇4 種提取試劑各250 mL，超聲波震蕩1 h，靜置過夜后過濾，5000 rpm 離心10 min，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃下真空濃縮至恒重，稱量(m)，用5 mL 原提取劑溶解，獲得粗提物，檢測抑菌活性，選擇最佳試劑的粗提物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

提取率(%)=m/50×100

2.2 棘托竹蓀菌托粗提物抑菌活性測定

棘托竹蓀菌托乙酸乙酯提取物(Ethyl acetate extract，EAE)用少量甲醇溶解后，定量吸取梯度體積，110 ℃完全烘干，稱量，確定濃度并稀釋至20 mg/mL，以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、標(biāo)準(zhǔn)摩根氏菌為指示菌，濾紙片法(d=5 mm)和打孔法(d=8 mm)比較各處理液的抑菌活性，以pH4.0，濃度為20 mg/mL 的山梨酸鉀溶液作為陽性對照，甲醇溶液為空白對照。

2.3 抑菌物質(zhì)粗提物理化性質(zhì)

2.3.1 抑菌物質(zhì)耐熱性能測定

棘托竹蓀菌托乙酸乙酯提取物用少量的甲醇溶解后稀釋至5 mg/mL，等量裝入小試管，然后分別在100 ℃水浴中分別加熱10、20、30、40、50、60、70 min，自然冷卻后，以甲醇為對照，打孔法(d=8 mm)每孔加樣0.3 mL，比較各處理液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性。

2.3.2 抑菌物質(zhì)抗紫外輻射耐性測定

棘托竹蓀菌托乙酸乙酯提取物用少量的甲醇溶解后稀釋至5 mg/mL，等量裝入培養(yǎng)皿中，在無菌間15 W 紫外燈下，距離25 cm，照射15、30、45、60、75min，以甲醇為對照，打孔法(d=8 mm)每孔加樣0.3 mL，比較各處理液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性。

2.4 棘托竹蓀菌托抑菌物質(zhì)的提取、分離

2.4.1 棘托竹蓀菌托乙酸乙酯提取物制備

1000 g 棘托竹蓀菌托干品剪碎，過60 目篩，加4000 mL 乙酸乙酯，置室溫下(25～30 ℃)浸提48 h(不時搖動)。400 目過濾，濾液低溫4 ℃、5000 rpm離心5 min，收集提取液。濾渣再加乙酸乙酯2000 mL 搖勻浸提24 h，過濾、離心(條件同上)。合并兩次提取液，50 ℃減壓薄膜濃縮至恒重，-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 棘托竹蓀菌托抑菌物質(zhì)的分離

2.4.2.1 硅膠柱層析

固定相按提取物(g)∶硅膠(g)=1∶50 稱取硅膠(200～300 目)，根據(jù)硅膠量選擇適當(dāng)?shù)膶游鲋?流動相選擇氯仿-甲醇洗脫體系或石油醚-乙酸乙酯洗脫體系。每2 倍保留體積收集于三角瓶中，每個梯度洗脫10 倍保留體積。50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮干，用甲醇或氯仿溶解后移至小燒杯中。薄層層析(TLC)法檢測合并相同組分。

2.4.2.2 反相中壓液相制備色譜分離層析

固定相為YMC-GEL，流動相選擇不同比例的甲醇-水梯度洗脫，流速5 mL/min，最大壓力為3 MPa;餾分收集器為1 管/5 min，每梯度收集10 管，50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮干，用甲醇或氯仿溶解后移至小燒杯中。薄層層析(TLC)法檢測合并相同組分。

2.5 抑菌活性成分GC-MS 分析

氣相色譜條件:進(jìn)樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為280 ℃。柱溫采用程序升溫方式:70 ℃3 min，3 ℃/min 至100 ℃，100 ℃6 min，5 ℃/min 至150℃，150 ℃6 min，10 ℃/min 至250 ℃，250 ℃15min，分流比30∶1，柱流量1.2 mL/min，柱頭壓5.5psi。進(jìn)樣量1.0 μL。

質(zhì)譜條件:用70 eV 的EI 源230 ℃，四級桿150℃，溶劑延遲時間為3 min 分子量范圍為25～500 amu。

通過計算機(jī)檢索與NIST 質(zhì)譜庫和Wiley 質(zhì)譜庫提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行對照，并參照已發(fā)表的質(zhì)譜圖，從而鑒定;同時將相對百分含量按峰面積歸一化法計算，根據(jù)色譜圖保留峰面積計算各成分的相對百分含量。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件，one-way ANOVA 進(jìn)行方差分析，均值比較用LSD 和Duncan法。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同試劑對抑菌物質(zhì)提取效果

從圖1 和表1 可以看出，5 種試劑提取物抑菌能力依次為甲醇＞乙酸乙酯＞丙酮＞正丁醇＞石油醚。從表1 可以看出甲醇提取時的得率最高，為7.81%，用5 mL 原提取試劑重新溶解后甲醇提取物濃度是乙酸乙酯提取物7.8 倍左右，但抑菌能力的增加并不明顯，說明用甲醇提取時雜質(zhì)相對較多，不利于分離抑菌活性物質(zhì)，從分離效率的角度考慮選用乙酸乙酯作為提取試劑。

圖1 不同試劑提取物抑菌效果(指示菌:金黃色葡萄球菌)Fig.1 The antibacterial ability of different extracts(indicator bacteria:Staphylococcus aureus)

表1 不同試劑提取物抑菌效果Table 1 The antibacterial ability of different extracts

3.2 粗提物抑菌活性測定

菌托乙酸乙酯提取物抗菌活性測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。提取物對6 種常見的細(xì)菌均有抑制作用，其抑菌效果依次為金黃色葡萄球菌＞標(biāo)準(zhǔn)摩根氏菌＞枯草芽孢桿菌＞蠟樣芽孢桿和＞大腸桿菌＞腸炎沙門氏菌。提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最佳，因此選擇金黃色葡萄球菌作為下一步分離實(shí)驗(yàn)中檢測分離組分抑菌活性的指示菌。

圖2 乙酸乙酯提取物抑菌試驗(yàn)Fig.2 The antibacterial ability of ethyl acetate extract against different indicator bacteria

3.3 提取物中抑菌成分的理化性質(zhì)研究

3.3.1 抑菌成分熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

菌托乙酸乙酯提取物100 ℃沸水浴中處理不同時間后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，以甲醇作為對照，結(jié)果如圖3所示，可以看出提取物在100 ℃沸水浴70 min 過程中，其抑菌能力并未有較大的改變，說明提取物中的抑菌成分具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖3 不同熱處理時間對提取物抑菌能力的影響Fig.3 Effect of heat treatment on antibacterial activity of the ethyl acetate extract

3.3.2 UV 對抑菌成分穩(wěn)定性的影響

菌托乙酸乙酯提取物經(jīng)紫外線照射后的抑菌活性如圖4 所示，實(shí)驗(yàn)表明抑菌活性物質(zhì)在紫外燈照射15～75 min 過程中抑菌能力變化不明顯，說明菌托乙酸乙酯提取物中的抑菌活性物質(zhì)不受紫外照射的影響或者影響很小。

圖4 UV 對提取物抑菌能力的影響Fig.4 Effect of UV on antibacterial activity of the ethyl acetate extract

3.4 棘托竹蓀菌托抑菌物質(zhì)分離、純化

3.4.1 乙酸乙酯提取物初次分離結(jié)果(氯仿-甲醇洗脫)

乙酸乙酯提取物初次分離共獲得40 個組分(編號CM1-CM40)，其中洗脫組分CM15-CM18、CM34-CM37 對大腸桿菌有抑制作用。洗脫組分CM14-CM24、CM26-CM29、CM31-CM37 對金黃色葡萄球菌均有抑菌作用。根據(jù)TLC 結(jié)果將CM14-CM24 合并為組分DEV①，CM26-CM29 合并為DEV②，CM31-CM37 合并為DEV③。

表2 洗脫組分的抑菌效果Table 2 Antibacterial activity of different components after preliminary purification

從表2 可以看出，菌托乙酸乙酯提取物經(jīng)過硅膠柱層析后分離得到的3 個具有抑菌作用的組分DEV①、DEV②、DEV③，其中DEV①與DEV③對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，且抑菌效果較強(qiáng);而DEV②只對金黃色葡萄球菌有較弱抑制作用。3 個組分是以不同極性洗脫相洗脫出來，其中DEV①和DEV③洗脫極性相差較大，說明DEV①和DEV③是含不同抑菌化合物的組分，由此可以推測竹蓀菌托抑菌成分中至少含有兩個以上具有抑菌活性的化合物。

3.4.2 DEV①硅膠柱分離層析結(jié)果

稱取300 mg 分離下來的組分DEV①進(jìn)行層析柱(石油醚-乙酸乙酯洗脫)，獲得組分經(jīng)TLC 分析后合并為DEV①-1～DEV①-11。從圖5 可以看出，組分DEV①-5～DEV①-10 均有抑菌作用，隨著洗脫劑極性增加抑菌作用減弱;將抑菌組分DEV①-5～DEV①-9 合并，待揮發(fā)干后繼續(xù)進(jìn)行柱層析(氯仿-甲醇洗脫)，通過薄層層析結(jié)果將各個組分合并為10 個組分(1 號-10 號)，測定抑菌作用，如圖6 所示7 號和8 號有抑菌活性，合并為DEVⅠ。

圖5 DEV①分離組分抑菌檢測(石油醚-乙酸乙酯洗脫)(1-11:DEV①-1-DEV①-11)Fig.5 Antibacterial activity of different components separated from DEV①(Eluent:petroleum ether-ethyl acetate;1-11:DEV①-1-DEV①-11)

圖6 DEV①二次分離組分抑菌檢測(氯仿-甲醇洗脫)(1-10:1 號-10 號)Fig.6 Antibacterial activity of different components further separatd from DEV①(Eluent:chloroform-methanol;1-10:No.1-No.10)

3.4.3 抑菌組分DEV③中抑菌成分的分離純化

稱取500 mg 分離下來的組分DEV③進(jìn)行反相中壓液相制備色譜分離層析，獲得組分經(jīng)TLC 分析后合并為DEV③-1～DEV③-30。從圖7 可以看出，組分DEV③-1 和DEV③-4～DEV③-8 均有抑菌作用。將抑菌組分DEV③-4～ DEV③-8 合并為DEVⅡ。

圖7 DEV③分離組分抑菌檢測Fig.7 Antibacterial activity of different components separated from DEV③

3.5 抑菌活性成分GC-MS 分析

3.5.1 DEV I 化學(xué)成分分析

對DEV I GC-MS 分析結(jié)果共鑒定出57 種成分，其中相對含量在1%以上共20 個，如表3 所示。其中脂類12 種，醇類1 種，酸類4 種，其他3 種。20種成分相對含量共占總體的82.07%。

表3 DEVⅠ中相對含量1%以上的化學(xué)成分Table 3 The components with relative content more than 1% of total in DEV I

3.5.2 DEVⅡ化學(xué)成分分析

對DEVⅡGC-MS 分析結(jié)果共鑒定出24 種成分，其中相對含量在1%以上共6 個，如表4 所示。6 種成分相對含量共占總體的86.2%，其中相對含量較高的為肉桂酸和2-呋喃甲酸，二者均為已知具有抑菌作用的物質(zhì)，因此推測為DEVⅡ具有抑菌作用的主要功能成分。

表4 DEVⅡ中相對含量1%以上的化學(xué)成分Table 4 The components with relative content more than 1% of total in DEVⅡ

4 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)竹蓀菌托提取物具有抑菌作用，且具有較廣的抑菌菌譜、熱穩(wěn)定、耐紫外照射的特點(diǎn)。菌托作為竹蓀生產(chǎn)過程產(chǎn)生的廢棄物，開發(fā)成本低，從菌托中開發(fā)獲得天然防腐劑具有巨大的潛在價值。

竹蓀被發(fā)現(xiàn)具有抑菌作用已有較多報道。長裙竹蓀提取液對細(xì)菌、病原菌具有廣泛的抑制作用，在中性至堿性條件下可發(fā)揮抑菌作用，對高溫、高壓穩(wěn)定，但對酵母菌、霉菌沒有明顯的抑制作用［5，9，18］;棘托竹蓀揮發(fā)油對霉菌、酵母及細(xì)菌都有抑菌效果［10-14，19］，水提物對常見有害菌具有一定的抑菌效果，對高溫有一定的穩(wěn)定性［7］，可見竹蓀中的抑菌成分與竹蓀種類及提取方法有關(guān)，這也說明了竹蓀中具有多種的抑菌成分，如有報道竹蓀多糖具有抑菌活性［20-21］。

檀東飛等［19］采用非極性至極性的5 種溶劑浸提棘托竹蓀中的抑菌物質(zhì)，結(jié)果表明隨著溶劑極性的增強(qiáng)，提取得率增大;同時對不同溶劑提取物分別做了抑菌試驗(yàn)，提取物的抑菌效果是:乙酸乙酯提取物＞正己烷提取物＞丙酮提取物＞乙醇提取物＞水提取物，這與本文對棘托竹蓀菌托的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。本文通過活性追蹤法分離純化棘托竹蓀菌托乙酸乙酯提取物的抑菌成分，雖然未能得到單一抑菌成分，但是極性較大的抑菌組分DEVⅡ中肉桂酸及2-呋喃甲酸的相對含量接近80%，而二者均為已知具有抑菌活性的化學(xué)物質(zhì)［22-24］，因此可以推測棘托竹蓀菌托乙酸乙酯提取物起抑菌作用的主要物質(zhì)為肉桂酸及2-呋喃甲酸。分別采用液相色譜法和氣象色譜法測得竹蓀菌托乙酸乙酯粗提物中肉桂酸含量為0.0153%，2-呋喃甲酸含量為0.0086%。分離獲得的極性較小的組分DEVⅠ中相對含量超過1% 的占82.07%，而相對含量超過3% 的占59.52%，但這些已知物質(zhì)中未見報道具有明顯的抑菌作用成分，由此認(rèn)為DEVⅠ抑菌作用可能是多種小極性化合物協(xié)同作用的結(jié)果。Huang MQ 等［25］從長裙竹蓀子實(shí)體揮發(fā)性成分中分離鑒定一種抗生素Albaflavenone，并通過定量分析出長裙竹蓀中Albaflavenone 含量為0.0063%，推測該化合物是長裙竹蓀具有抑菌活性的主要活性成分;黃明泉同時也在棘托竹蓀子實(shí)體和棘托竹蓀蛋的揮發(fā)性成分中檢測發(fā)現(xiàn)Albaflavenone［26］，棘托竹蓀菌托中是否含有該成分，以及其他相關(guān)的抑菌活性物質(zhì)和不同化學(xué)組分的比列對抑菌活性的影響還有待進(jìn)一步研究。

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