巨細胞病毒嵌合癌胚抗原介導單純皰疹病毒胸苷激酶聯(lián)合丙氧鳥苷自殺基因體系靶向性治療結腸癌的效果

王成興 曾山崎 楊 平 張 通 魏建昌 陳華翠 曹 杰

廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院胃腸外科，廣東廣州510180

巨細胞病毒嵌合癌胚抗原介導單純皰疹病毒胸苷激酶聯(lián)合丙氧鳥苷自殺基因體系靶向性治療結腸癌的效果

王成興 曾山崎 楊 平 張 通 魏建昌 陳華翠 曹 杰▲

廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院胃腸外科，廣東廣州510180

目的觀察巨細胞病毒（CMV）嵌合以癌胚抗原為啟動子，以腺病毒為載體的單純皰疹病毒胸苷激酶基因重組構建體Ad-CMV-CEA-HSV/TK聯(lián)合丙氧鳥苷（GCV）體內(nèi)抗結腸癌的療效。方法構建人結腸癌裸鼠移植瘤模型，按不同濃度梯度Ad-CMV-CEA-HSV/TK（1.0×109/kg、5.0×109/kg、10.0×109/kg）經(jīng)尾靜脈注射帶瘤小鼠后，腹腔注射相同濃度GCV（50 mg/kg），并設空白對照組及不同濃度的Ad-CEA-HSV/TK/GCV對照（1.0×109/kg、5.0× 109/kg、10.0×109/kg），共設A～G 7組，每組各10只小鼠。觀察腫瘤體積、重量、腫瘤體積-時間曲線、腫瘤抑制率及生存期。結果Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV及Ad-CEA-HSV/TK/GCV對人結腸癌裸鼠移植瘤生長均具有抑制作用，對移植瘤的體積及重量抑制呈作用物濃度依賴性；且Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV抑制能力較Ad-CEAHSV/TK/GCV顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV體系對結腸癌具有明確的實驗性治療作用，為人結腸癌及結腸癌遠處轉移灶的Ⅰ期臨床治療試驗提供科學實驗依據(jù)，具有廣闊的臨床應用前景。

結腸癌曰基因治療曰巨細胞病毒曰重組腺病毒曰癌胚抗原

結腸癌是嚴重危害人類健康的重大疾病之一，在北美、歐洲和澳大利亞，結腸癌發(fā)病率在消化道腫瘤中位居第一位，是腫瘤相關死亡病例中的第二位原因[1]。近20年來我國結腸癌發(fā)病率呈上升趨勢，已經(jīng)發(fā)展成為常見惡性腫瘤中發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤[2]。傳統(tǒng)的結腸癌治療方案主要有手術治療、放療和化療，而這些療法或其聯(lián)合療法均不能達到令人滿意的結果。近年來，單純皰疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鳥苷（herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir，HSV-TK/GCV）自殺基因系統(tǒng)在腫瘤基因治療研究領域成為熱點[3-4]。本研究將驗證嵌合巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）增強子的HSV-TK/GCV對腫瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

PRMI1640培養(yǎng)液、10%滅活胎牛血清、鏈-青霉素抗體均購自美國GIBCO公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自美國Sigma公司；更昔洛韋（ganciclovir，GCV）購自湖北科益藥業(yè)有限公司。人類中分化結腸腺癌SW480細胞株由廣州醫(yī)科大學實驗中心細胞庫提供。癌胚抗原啟動子調(diào)控攜帶單純皰疹病毒胸苷激酶基因的重組腺病毒（herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir controlled by CEA promoter，Ad-CEA-HSV/TK）、CMV增強子嵌入、癌胚抗原啟動子調(diào)控攜帶HSV-TK基因的重組腺病毒（adenoviral mediated herpes simplex virus-thymidine kinase controlled by CMV-CEA promoter，Ad-CMV-CEA-HSV/TK）均由廣州醫(yī)科大學實驗中心提供技術支持構建。按常規(guī)方法對重組腺病毒進行擴增、純化和滴度測定，并置于-80℃保存?zhèn)溆茫?～6周齡BALB/C裸鼠雌雄各35只，體重16～25 g，由中山大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK（粵）2009-0011，動物質量合格證號：0081587]。

1.2 實驗方法

動物移植瘤模型的建立取對數(shù)生長期SW480細胞，用0.25%胰酶及0.20%乙二胺四乙酸消化傳代，置于37℃含50%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，收集并調(diào)整細胞濃度為5×107個/mL的細胞懸液，取0.2 mL接種于裸鼠背部皮下，注射點選擇左前背部皮下，待腫瘤長至直徑約1.0 cm。試驗裸鼠隨機分為7組，每組10只，各組處理見表1。

1.3 療效觀察

觀察3周，每隔1天測量1次腫瘤大小，計算腫瘤體積，腫瘤體積按公式計算：體積=長徑×短徑2× 0.5236，比較各組間腫瘤體積變化。腫瘤抑制率=（1-實驗組平均重量/對照組平均重量）×100%，計算腫瘤生長抑制率并繪制生長曲線。實驗結束后將實驗動物寰椎脫離法處死，剝離瘤體，測量體積及瘤重。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 動物移植瘤模型分組及處理方法

2 結果

2.1 各組移植瘤體積比較

各組裸鼠皮下注射SW480細胞2～4 d均可觸及小結節(jié)狀移植瘤病灶，2周后腫瘤大小為1 cm，接種成功率為100%。就腫瘤生長情況而言，治療開始后A組腫瘤持續(xù)快速生長，至實驗結束時生存裸鼠移植瘤平均體積為（675.33±3.25）mm3；B、C、D組及E、F、G組腫瘤生長速度較A組明顯減緩，B、C、D組隨著藥物濃度升高腫瘤體積遞減，E、F、G組也呈相似變化，提示移植瘤體積與藥物濃度呈反比；E、F、G組移植瘤體積較B、C、D組移植瘤體積增長明顯減緩，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖1。

圖1 移植瘤體積生長曲線

2.2動物移植瘤抑制效應

B、C、G組治療對人結腸癌SW480裸鼠移植瘤的生長具有抑制作用，且瘤體體積及重量的抑制均呈濃度依賴性，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；E、F、G組瘤體體積及重量分別較B、C、D組小，抑瘤作用更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；A組裸鼠自實驗開始3 d后出現(xiàn)死亡，實驗結束時存活3只，而B、C、D、E、F、G組分別存活7、7、8、8、7、9只，結果提示B、C、D、E、F、F、G組生存率較A組顯著提高，且E、F、G組生存率最明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 動物移植瘤抑制效應（n=10）

3 討論

惡性腫瘤的基因治療中，為了提高腫瘤組織特異性表達自殺基因TK或CD從而改善腺病毒自殺基因系統(tǒng)特異性或選擇性殺死腫瘤細胞，近年來對腺病毒載體進行了改造，利用腫瘤組織特異性啟動子如癌胚抗原（CEA）啟動子，來驅動自殺基因表達[5-6]。因為CEA啟動子只在CEA蛋白陽性細胞中，如結腸癌細胞，有驅動活性，而在CEA蛋白陰性細胞，如成人正常細胞，沒有驅動活性。在正常情況下，CEA蛋白僅表達于胎兒組織，于成人組織CEA則不表達。然而，CEA蛋白則高表達于各種消化道惡性腫瘤組織中，如結腸癌幾乎100%表達CEA[7]。研究表明，利用CEA啟動子指導自殺基因表達已經(jīng)明顯提高殺傷腫瘤組織的特異性。然而這種CEA啟動子指導的自殺基因表達活性很低，有其顯著局限性[8]。有研究表明，CMV即刻早期基因的啟動子-增強子系統(tǒng)是目前所知的最強的增強子-啟動子系統(tǒng)，因而已廣泛應用于各種真核表達載體中來驅動外源基因表達[9]。本研究將CMV增強子序列克隆至CEA啟動子序列上游以形成一種嵌合型CMV增強子-CEA啟動子，形成Ad-CMV-CEA-HSV/ TK/GCV治療體系，與缺乏增強子的Ad-CMV-CEAHSV/TK/GCV及空白對照的療效相比較，結果提示其不僅能保留CEA啟動子結腸癌組織特異性，又能通過CMV增強子極大地提高CEA啟動子驅動自殺基因表達的活性。

嵌合強效CMV增強子-CEA啟動子-TK基因重組腺病毒聯(lián)合GCV自殺基因治療體系（Ad-CMV-CEAHSV/TK/GCV體系）的主要優(yōu)點包括[10-14]：①腫瘤組織選擇性。由于CEA高效表達于人結腸癌細胞而不表達于正常組織，因而該系統(tǒng)僅殺死CEA陽性的腫瘤細胞。②高效性。利用CMV增強子的高效性，來增強CEA啟動子指導的自殺基因的高效表達，克服傳統(tǒng)的腺病毒載體CEA啟動子活性低的缺陷。③安全性。由于本研究采用復制缺陷型腺病毒載體，因而感染細胞后不會引起腺病毒在體內(nèi)細胞中復制和感染擴散。④“旁觀者”殺傷效應。由于本研究所采用重組腺病毒介導的自殺基因聯(lián)合前藥來治療腫瘤，當部分腫瘤細胞受到感染并被殺傷，臨近未被感染的腫瘤組織也被殺死，從而使該系統(tǒng)殺傷腫瘤細細胞效應得到擴大，稱之為“旁觀者”殺傷效應。

Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV體系克服了目前報道的病毒介導的自殺基因表達水平不高或缺乏腫瘤組織特異性的缺點。為人結腸癌及結腸癌遠處轉移灶的Ⅰ期臨床治療試驗提供科學實驗依據(jù)，具有廣闊的臨床應用前景。

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Therapeutic effect of cytomegalovirus chimeric carcinoembryonic antigen promoter combined with HSV-TK/GCV system for human colon cancer

WANG ChengxinZENG ShanqiYANG PingZHANG TongWEI JianchangCHEN HuacuiCAO Jie▲
Department of Gastrointestinal Surgery,the Affiliated Guangzhou First People's Hospital of Guangzhou Medical University,Guangdong Province,Guangzhou510180,China

Objective To approach the treatment efficiency of replication defective adenovirus carrying HSV/TK gene under control of the cytomegalovirus union carcinoembryonic antigen promoter and ganciclovir(GCV)in nude mice xenografts model of human colon cancer.Methods The model of human colon cancer xenografts in BALB/c nude mouse was builded successfully.After injection of different concentration gradient of Ad-CMV-CEA-HSV/TK(1.0×109/kg, 5.0×109/kg,10.0×109/kg)in caudal vena,the same level of GCV(50 mg/kg)was given by peritoneal injection,and they were divided into the blank control group and Ad-CEA-HSV/TK control group with different concentration(1.0×109/kg, 5.0×109/kg,10.0×109/kg)were set,in total of 7 groups,each group of 10 mice.The anti-tumor efficacy was analyzed by index of tumor volume,tumor weight,relative tumor curative,and tumor growth curve.Results After therapy,growth of human colon cancer xenografts in nude mouse were observably inhibited by Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV and Ad-CEA-HSV/TK/GCV in a dose dependent,and there were no inhibition plateau.Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV showed a stronger inhibition ability than Ad-CEA-HSV/TK/GCV(P＜0.05).Conclusion Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV system is highly experimental effective and safe to inhibit the growth of human colon cancer xenografts,provides scientific basis forⅠperiod experimental of clinical treatment of human colon cancer and colon cancer distant metastases,and has a wide prospect of clinical application.

Colon cancer;Gene therapy;Cytomegalovirus;Recombinant adenovirus;Carcinoembryonic antigen

R735.35

A

1673-7210（2015）06（b）-0013-04

2015-02-05本文編輯：任念）

廣東省科技計劃項目（2009B060700015）；廣東省廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導項目（2009-YB-008）。

▲通訊作者