穿山龍?zhí)崛∥锸硎氃碥諏?duì)糖尿病模型大鼠血清HA和5-HT的影響

冷錦紅 邱 獅 董佳妮 張 蘭 李文金 于世家 侯 平

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng)110032）

穿山龍?zhí)崛∥锸硎氃碥諏?duì)糖尿病模型大鼠血清HA和5-HT的影響

冷錦紅 邱 獅 董佳妮 張 蘭 李文金 于世家 侯 平

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng)110032）

目的：探討中藥穿山龍?zhí)崛∥锸硎氃碥諏?duì)糖尿病大鼠血清組胺（HA）和5-羥色胺（5-HT）的影響，以期為后期痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）的研究奠定理論基礎(chǔ)。方法：以2%鏈脲佐霉素溶液誘發(fā)糖尿病，將造模成功的大鼠，隨機(jī)分為干預(yù)2周、4周、8周的模型組、薯蕷皂苷組和強(qiáng)的松組，另取24只血糖正常的大鼠分為各時(shí)期正常組，分別灌胃相應(yīng)藥物或生理鹽水后用Elisa法觀察不同時(shí)期各組大鼠血清HA和5-HT的蛋白表達(dá)。結(jié)果：模型組治療各時(shí)期血清HA和5-HT表達(dá)均明顯高于正常組（P＜0.01），薯蕷皂苷組和強(qiáng)的松組大鼠治療各時(shí)期上述指標(biāo)明顯低于模型組（P＜0.01），其中薯蕷皂苷組干預(yù)效果明顯高于強(qiáng)的松組（P＜0.01）。結(jié)論：中藥穿山龍?zhí)崛∥锸硎氃碥湛筛纳铺悄虿。―M）大鼠血清致痛物質(zhì)的表達(dá)，療效強(qiáng)于強(qiáng)的松。

糖尿病 穿山龍 植物提取物 薯蕷皂苷 HA 5-HT 大鼠 實(shí)驗(yàn)研究

目前約有四分之一糖尿病患者存在痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN），防治DPN的研究已成為糖尿病臨床研究所面臨的重要課題。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)痛的病理狀態(tài)下，末梢感受器、背根神經(jīng)節(jié)及軸突損傷區(qū)有多種物質(zhì)的變化，致痛物質(zhì)等都有不同程度的上調(diào)或下調(diào)。中藥穿山龍的有效成分主要為甾體皂苷類，包括薯蕷皂苷、纖細(xì)皂苷和水溶性皂苷，其中薯蕷皂苷含量較多[1-3]。研究表明，薯蕷皂苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等作用，其對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的防治作用也日益受到關(guān)注。本研究應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)探討薯蕷皂苷對(duì)糖尿病模型大鼠血清組胺（HA）和5-羥色胺（5-HT）蛋白表達(dá)的影響，以期為后期痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性清潔級(jí)Wistar大鼠120只，體重范圍為200～250g，由遼寧省長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào):SCXK（遼2010-0001）。

1.2 試劑與儀器 鏈脲佐霉素 （美國(guó)sigma公司，批號(hào):S-0130）；薯蕷皂苷（陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，批號(hào):CY140607）；強(qiáng)的松（天津力生制藥股份有限公司，批號(hào):201402005）；酶標(biāo)儀（TECAN中國(guó)有限公司）；穩(wěn)步型血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表方法分為正常組24只和造模組96只。造模組大鼠在造模之前禁食12h，腹腔內(nèi)單次注射2%鏈脲佐霉素溶液53mg/kg（由0.1mol/L的pH4.2枸櫞酸緩沖液配制）誘發(fā)糖尿病模型。72h后通過血糖儀測(cè)定大鼠尾靜脈血的血糖，血糖大于16.7mmol/L者可列入觀察的對(duì)象[4]。正常組24只大鼠禁食12h之后一次性腹腔內(nèi)注射相等容積的0.1mol/L枸櫞酸緩沖液。實(shí)驗(yàn)期間全部大鼠予普通飼料喂養(yǎng)，可自由進(jìn)食和飲水[5]。將正常組24只大鼠隨機(jī)分為3組，分別為2周、4周、8周正常組，每組8只。96只造模組大鼠中，4只造模未成功，2只死亡。將造模成功的90只大鼠隨機(jī)分為2周、4周、8周模型組、薯蕷皂苷組和強(qiáng)的松組，每組10只。

2.2 給藥方法 正常組與模型組予生理鹽水10mL/（kg·d）灌胃；薯蕷皂苷組予36.18mg/（kg·d）薯蕷皂苷溶液灌胃，劑量參照“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人按體表面積等效劑量換算比率表”確定[6]；強(qiáng)的松組予1.35mg/（kg·d）強(qiáng)的松灌胃。各組大鼠均于造模成功后開始給藥，每日給藥1次至各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束（2周、4周、8周）。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 血糖情況 分別于治療后的2周、4周、8周和治療前（0周）尾靜脈取血，用血糖儀測(cè)定血糖。

2.3.2 Elisa方法檢測(cè)各組大鼠血清致痛物質(zhì) 5-HT、HA表達(dá) 各組大鼠治療結(jié)束后腹腔內(nèi)注射20%烏拉坦（0.4mL/100g）麻醉，腹主動(dòng)脈取血約5mL，離心取上清待Elisa檢測(cè)用。Elisa檢測(cè)方法:①包被，②加樣，③配液，④洗滌，⑤加底物液顯色，⑥終止反應(yīng)，⑦判定結(jié)果[在450nm波長(zhǎng)處，檢測(cè)各孔的吸光度（OD值），測(cè)定需在加終止液后的10min以內(nèi)進(jìn)行]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用（±s）表示，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，非正態(tài)的資料可進(jìn)行數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)化。多組間比較用單因素方差分析，方差不齊時(shí)用Dunnett’C進(jìn)行兩兩的組間比較，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠治療各時(shí)期血糖比較 造模之后模型組、各給藥組大鼠血糖水平均明顯高于同時(shí)期正常組（P＜0.01）；各給藥組各時(shí)期血糖水平與同期模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

3.2 各組大鼠血清致痛物質(zhì)5-HT、HA蛋白表達(dá)比較 模型組與各給藥組各時(shí)期5-HT、HA蛋白表達(dá)均明顯高于正常組（P＜0.01），提示痛性DM模型造模成功；薯蕷皂苷組、強(qiáng)的松組給藥各時(shí)期5-HT、HA蛋白表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.01），說明治療有效，而此2組中薯蕷皂苷組各時(shí)期對(duì)2指標(biāo)的改善明顯優(yōu)于強(qiáng)的松組（P＜0.01）。見表2。

4 討論

有評(píng)估顯示，中國(guó)有25年以上病史的糖尿病患者中，有50%會(huì)發(fā)展到神經(jīng)性疼痛。因此，痛性糖尿病神經(jīng)病變已成為臨床頑疾之一，防治本病已成為糖尿病工作者面臨的重要課題。強(qiáng)的松是短效糖皮質(zhì)激素，在抑制免疫、抗炎鎮(zhèn)痛方面在臨床廣泛應(yīng)用，但是其副作用使得患者依從困難。

疼痛與神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子的關(guān)系極為密切。當(dāng)疼痛發(fā)生時(shí)，受損組織便向細(xì)胞外液中釋放內(nèi)源性的化學(xué)物質(zhì)，我們稱之為致痛物質(zhì)，包括HA、5-HT、P物質(zhì)等，其中HA和5-HT是單胺類化合物，是體內(nèi)存在的一種很強(qiáng)的致痛物質(zhì)，在局部血液循環(huán)障礙引起疼痛的情況下，致痛物質(zhì)的表達(dá)明顯上升，同時(shí)會(huì)引起血管活性物質(zhì)功能增強(qiáng)，血管通透性增強(qiáng)。

穿山龍為薯蕷科薯蕷屬植物穿龍薯蕷的根莖，以地下的根狀莖入藥，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有祛風(fēng)止痛、活血舒筋等功效，應(yīng)用歷史悠久，用于治療風(fēng)寒濕痹、跌打損傷、腰腿疼痛和筋骨麻木等。穿山龍的有效成分主要為甾體皂苷類，總皂苷酸水解產(chǎn)生薯蕷皂苷元[7-8]，甾體類藥物對(duì)免疫功能具有廣泛的作用，作為具有類似結(jié)構(gòu)的薯蕷皂苷元，同樣具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)和鎮(zhèn)痛抗炎的作用。

本研究結(jié)果表明，薯蕷皂苷和強(qiáng)的松均可明顯減少糖尿病模型大鼠血清中致痛物質(zhì)的表達(dá)，薯蕷皂苷療效強(qiáng)于強(qiáng)的松，且隨著療程的延長(zhǎng)療效更加明顯。目前單味中藥對(duì)痛性糖尿病神經(jīng)病變的研究尚不多見，本研究揭示了單味中藥穿山龍?zhí)崛∥锸硎氃碥湛捎行p少痛性物質(zhì)表達(dá)，療效確切，副作用少，作用多靶點(diǎn)，可為臨床選擇最佳治療用藥提供深層次的理論基礎(chǔ)。同時(shí)，痛性DM大鼠模型的成功建立，將為痛性DPN模型的成功建立提供依據(jù)。在離子通道功能障礙理論的指導(dǎo)下，我們將進(jìn)一步探討薯蕷皂苷對(duì)痛性DPN大鼠坐骨神經(jīng)離子通道蛋白表達(dá)的影響，為薯蕷皂苷治療痛性DPN提供深層次的理論基礎(chǔ)，同時(shí)完善痛性DPN的發(fā)病機(jī)制研究。

表1 各組大鼠治療各時(shí)期血糖比較（±s） mmol/L

表1 各組大鼠治療各時(shí)期血糖比較（±s） mmol/L

注：與同期正常組比較，▲P＜0.01。

2周0周（治療前）動(dòng)物數(shù)4周8周（只） 血糖 動(dòng)物數(shù)（只）正常組組別動(dòng)物數(shù)（只） 血糖24 5.88±0.58 248 5.99±0.35 30 23.26±5.32▲30 5.7±0.38血糖 動(dòng)物數(shù)（只）16血糖5.86±0.17模型組 24.58±2.94▲20 20.45±2.83▲10 21.59±4.33▲薯蕷皂苷組 30 23.33±4.31▲30 21.72±2.21▲20 19.27±0.68▲10 20.29±2.61▲強(qiáng)的松組 30 22.71±5.09▲30 25.62±4.32▲20 21.7±2.46▲10 20.69±4.13▲

表2 各組大鼠血清5-HT、HA蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠血清5-HT、HA蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與同期正常組比較，▲P＜0.01；與同期模型組比較，★P＜0.01；與同期強(qiáng)的松組比較，△P＜0.01。

組別 時(shí)間 動(dòng)物數(shù)（只）2周組 8 5-HT HA 150.87±3.83 289.18±11.97正常組4周組8周組8 8 154.09±2.29 153.32±4.10 10 10模型組2周組4周組277.07±4.25 276.33±3.74 760.29±20.27▲629.70±32.66▲1430.33±57.68▲1400.28±35.48▲8周組 10 2周組 10 363.19±10.31▲★△847.05±26.56▲★△4周組 10 292.91±14.03▲★△540.45±21.42▲★△薯蕷皂苷組8周組 10 270.53±2.87▲★△500.77±30.10▲★△590.36±42.90▲1432.79±50.19▲強(qiáng)的松組2周組 10 427.35±77.67▲★895.8±49.49▲★4周組 10 365.36±34.82▲★674.27±50.79▲★8周組 10 356.62±11.30▲★645.05±23.65▲★

[1] 都述虎，劉文英，付鐵軍，等.穿龍薯蕷總皂苷中甾體皂苷的分離與鑒定.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37（4）：267

[2] 姚麗，劉樹民.中藥穿山龍新的藥理作用及其有效部位的實(shí)驗(yàn)研究.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（9）：1979

[3] 刁興彬，高文學(xué)，張芳，等.穿山龍?zhí)崛∥镔|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.中國(guó)藥事，2014，28（8）：871

[4] 冷錦紅.不同通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.沈陽(yáng)：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)：2008

[5] Sally.A Price，Sithiporn Agthong，etc.Mitogen-Activated Protein Kinase p38 Mediates Reduced Nerve Conduction Velocity in Experimental Diabetic Neuropathy.Diabetes，2004，7（53）：1851

[6] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：50

[7] 丁小林，李卿.中藥穿山龍的研究進(jìn)展.重慶中草藥研究，2003（2）：55

[8] 李長(zhǎng)輝.益氣活血化瘀法治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病療效機(jī)制的研究.沈陽(yáng)：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2013

R587.1

A

1672-397X（2015）08-0076-03

冷錦紅（1974—），女，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，內(nèi)分泌學(xué)專業(yè)。

侯平，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。1577292550@qq.com

2015-04-30

編輯：吳 寧

遼寧省科技廳科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（2013226012）；沈陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目計(jì)劃項(xiàng)目（F13-221-9-55）