小鼠眼眶成纖維細(xì)胞TLR4基因靜默對(duì)甲狀腺眼病的效應(yīng)研究

王文英,周維明,張 意,陳華新

小鼠眼眶成纖維細(xì)胞TLR4基因靜默對(duì)甲狀腺眼病的效應(yīng)研究

王文英1*,周維明2*,張 意2,陳華新3

作者單位:1(201203)中國(guó)上海市,上海海欣生物技術(shù)有限公司;2(200433)中國(guó)上海市,第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室;3(430070)中國(guó)湖北省武漢市,廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院眼科

目的:構(gòu)建小鼠眼眶成纖維細(xì)胞TLR4的shRNA慢病毒干擾載體,研究TL4-/-的成纖維細(xì)胞對(duì)甲狀腺相關(guān)性眼病的治療作用和機(jī)制。

shRNA;toll樣受體4;成纖維細(xì)胞;甲狀腺相關(guān)眼病;負(fù)向免疫調(diào)節(jié)

引用:王文英,周維明,張意,等.小鼠眼眶成纖維細(xì)胞TLR4基因靜默對(duì)甲狀腺眼病的效應(yīng)研究.國(guó)際眼科雜志2015;15 (11):1862-1866

0 引言

甲狀腺相關(guān)性眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)是當(dāng)前我國(guó)發(fā)病率最高的眼眶組織疾病之一,除眼部病變外,還伴隨有甲狀腺損傷與功能紊亂情況。TAO的病程分為活動(dòng)期和非活動(dòng)期(靜止期),其眼部臨床表現(xiàn)為眼淚、眼球運(yùn)動(dòng)障礙眼瞼改變、視神經(jīng)受損。因?yàn)門AO發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,所以目前缺乏對(duì)其有效的診療措施[1-2]。新近的研究發(fā)現(xiàn),TAO是一種自身免疫疾病,是機(jī)體免疫系統(tǒng)在甲狀腺疾病所釋放的甲狀腺球蛋白等自身抗原的刺激下產(chǎn)生自身抗體,繼而激活眼眶成纖維細(xì)胞,使成纖維細(xì)胞釋放出T細(xì)胞趨化因子,最終使眼眶的免疫細(xì)胞相互作用并活化,產(chǎn)生自身免疫反應(yīng),導(dǎo)致眼眶組織廣泛的結(jié)構(gòu)改變和炎癥損傷[3-5]。

成纖維細(xì)胞(Fibroblasts)是一種生長(zhǎng)與裂殖迅速的細(xì)胞種群,是疏松結(jié)締組織的主要組成來(lái)源,被細(xì)菌脂多糖等細(xì)菌產(chǎn)物和細(xì)胞因子激活后可分泌新的細(xì)胞因子,趨引免疫細(xì)胞參與機(jī)體的免疫應(yīng)答[6-7]。研究表明,眼眶成纖維細(xì)胞(orbital fibroblast,OF)表面高表達(dá)的CD40與T細(xì)胞表面的CD40L(CD154)識(shí)別、結(jié)合提供T細(xì)胞的共刺激信號(hào)通路,導(dǎo)致T細(xì)胞的充分活化,促進(jìn)炎癥因子的分泌表達(dá)[8-9]。有研究指出成纖維細(xì)胞中促發(fā)炎癥反應(yīng)的主要信號(hào)分子是TLR4[10],為此我們研究靜默眼眶成纖維細(xì)胞的TLR4基因表達(dá)對(duì)TAO的治療效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 材料293細(xì)胞株購(gòu)自ATCC。小鼠TNF-α、IL-2、IFN-γ的ELISA試劑盒購(gòu)自Sigma公司。miRNA表達(dá)載體pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR、慢病毒質(zhì)粒pLenti6.3/ V5-DEST、包裝病毒系統(tǒng)ViraPowerTMPackaging Mix均購(gòu)自Invitrogen公司。TLR4一抗(兔抗大鼠)、β-actin一抗(小鼠抗大鼠),羊抗兔、羊抗小鼠二抗購(gòu)自Santa Cruz公司。DMEM、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。6～8周齡的SPF級(jí)Balb/c小鼠購(gòu)自上海杰思捷公司。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)構(gòu)建TLR4 siRNA干擾質(zhì)粒利用RT-PCR方法從小鼠眼眶成纖維細(xì)胞中克隆TLR4的基因序列,將基因序列導(dǎo)入到真核載體pEGFP-N1中,構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-TLR4。使用在線RNA設(shè)計(jì)軟件ihome設(shè)計(jì)4種可能具有TLR4基因干擾效力的序列, Bam HⅠ和HindⅢ雙酶切目的基因片段和表達(dá)載體pcDNATM 6.2-GW/EmGFPmiR,以T4DNA連接酶連接載體和目的基因,構(gòu)建眼眶成纖維細(xì)胞TLR4 shRNA重組干擾質(zhì)粒。

1.2.2 最優(yōu)干擾RNA的篩選將得到的4段干擾序列分別命名為sht001,sht002,sht003,sht004(陰性對(duì)照序列為sht NC),將各質(zhì)粒分別與TLR4真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染進(jìn)入293細(xì)胞,48h后收集細(xì)胞,抽提胞內(nèi)蛋白質(zhì)行蛋白質(zhì)免疫印記檢測(cè),篩選最佳干擾效率的RNA。

1.2.3 慢病毒干擾載體的構(gòu)建和病毒包裝測(cè)定將獲得的4段序列中具有最高干擾效率的sht001序列用Gateway技術(shù)重組到慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3中,命名為pLenti6.3-sht001,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后進(jìn)行病毒包裝,將ViraPower TM Packaging Mix和慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞,48h后收集細(xì)胞上清,包裝出的病毒命名為L(zhǎng)vsht001,病毒滴度測(cè)定采用倍比稀釋法感染293細(xì)胞法檢測(cè)。

圖1 pEGFP-N1-TLR4真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 1:pEGFP-N1-TLR4;2:Untransfeced。

1.2.4 小鼠眼眶成纖維細(xì)胞的獲取處死Balb/c小鼠,無(wú)菌摘取眼眶組織,剪碎呈1mm3大小,利用Ⅱ型蛋白酶加胰蛋白酶聯(lián)合消化法分離細(xì)胞,在通過(guò)差速貼壁分離法收集培養(yǎng)小鼠眼眶成纖維細(xì)胞。

1.2.53H-TdR摻入法檢測(cè)TLR4沉默的OF刺激同種異體T細(xì)胞增殖反應(yīng)將分離的OF分為4組并于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),1×106/mL,每孔1mL,分4組,分別為:(1)非刺激OF組(未轉(zhuǎn)染載體);(2)空載體轉(zhuǎn)染OF組(轉(zhuǎn)染空載體Lv-shtNC);(3)sht刺激OF組(轉(zhuǎn)染Lvsht001);(4)LPS刺激OF組(未轉(zhuǎn)染sht+200ng LPS刺激)。分別轉(zhuǎn)染刺激,培養(yǎng)24h后加入同種異體的CD4+T細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h,加入3H,液閃計(jì)數(shù)儀檢測(cè)各組反應(yīng)生物cpm值。收集各組的細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA法檢測(cè)其中TNF-α、IL-2、IFN-γ的表達(dá)水平。

1.2.6 制備小鼠甲狀腺眼病模型和研究重組慢病毒Lvsht001對(duì)小鼠眼眶纖維化進(jìn)程的抑制效應(yīng)參照文獻(xiàn)方法[11]建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,取40只Balb/c雌性小鼠,分2組,每組20只。以重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TSHR多部位注射每只小鼠方法建立小鼠甲狀腺眼病模型。接下來(lái)將疾病小鼠分為生理鹽水組和Lv-sht001重組病毒組2組,每組20只:生理鹽水組,眼眶局部?jī)?nèi)注射0.5mL生理鹽水;Lv-sht001重組病毒組,采用眼眶內(nèi)基因槍注入Lvsht001的重組病毒4×108TU。分別于第7、14、21、28d處死動(dòng)物,每次每組處死5只,磁珠分選出眼眶中的CD4+T細(xì)胞,培養(yǎng)4h后收集培養(yǎng)上清,使用懸浮芯片系統(tǒng)測(cè)定其中TNF-α、IL-2、IFN-γ的表達(dá)含量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理,組間比較選擇t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建pEGFP-N1-TLR4表達(dá)質(zhì)粒和篩選最高干擾效率的shRNA采用TLR4真核基因表達(dá)載體pEGFPN1-TLR4,轉(zhuǎn)染293細(xì)胞48h后,裂解細(xì)胞行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)可見胞內(nèi)有TLR4表達(dá)(圖1)。依據(jù)軟件設(shè)計(jì)的4段shRNA序列(表1),攜帶干擾shRNA的載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞48h后,行TLR4蛋白質(zhì)印記檢測(cè)(圖2),并采用Quantity One 4.0軟件分析各蛋白表達(dá)條帶灰度,各條shRNA的抑制效率分別為sht001(86.8±4.8)%,sht002 (15.9±1.9)%,sht003(75.1±6.3)%,sht004(78.1± 5.9)%,shtNC(6.8%±1.5)%,可見其中sht001抑制TLR4效果最佳。

2.2 慢病毒抑制載體的包裝和病毒滴度測(cè)定用篩選出的抑制效率最佳的sht001序列導(dǎo)入慢病毒載體,包裝后,得到的病毒滴定為1.5×106TU/mL。

表1 設(shè)計(jì)的shRNA序列

圖2 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)篩選最優(yōu)干擾效率的shRNA 1:sht001;2:sht002:3:sht003;4:sht004;5:sht NC。

圖3 各組OF刺激的同種異基因T細(xì)胞增殖。

2.3 感染重組慢病毒Lv-sht001的OF抑制MLR反應(yīng)

我們將Balb/c小鼠來(lái)源的眼眶成纖維細(xì)胞分為未刺激OF組,空載體刺激OF組,sht刺激OF組和LPS刺激OF組等4組,分別加入C57小鼠的同種異基因脾臟T細(xì)胞,行3H攝入檢測(cè)MLR。如圖3所示,結(jié)果表明:與未刺激OF組相比,Lvsht001轉(zhuǎn)染組可以顯著抑制MLR反應(yīng)(P＜0.05),而空載體刺激組和未刺激OF組相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.205),均能促進(jìn)MLR反應(yīng)發(fā)生。

2.4 感染過(guò)Lv-sht001的重組慢病毒修飾的OF對(duì)MLR反應(yīng)中細(xì)胞因子表達(dá)的影響Lv-sht001重組慢病毒感染的OF誘導(dǎo)的MLR反應(yīng)中,如圖4所示,細(xì)胞上清內(nèi)Th1亞群的細(xì)胞因子TNF-α(圖4A)、IL-2(圖4B)、IFN-γ (圖4C)的含量都比未刺激OF組和空載體組Lv-shtNC明顯降低(P＜0.05)。

2.5 TLR4沉默后小鼠甲狀腺眼病模型中CD4+T細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的變化按常規(guī)方法建立TAO感染小鼠動(dòng)物模型,導(dǎo)入TLR4干擾慢病毒Lv-sht001,分別于4個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死小鼠,收集、磁珠分選眼眶部位內(nèi)的CD4+T細(xì)胞,培養(yǎng)4h后,采用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)測(cè)定胞內(nèi)TNF-α、IL-2、IFN-γ的含量,發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-2、IFN-γ含量顯著下降(P＜0.05,表2)。

3 討論

格雷夫斯病(Graves disease,GD)是機(jī)體針對(duì)促甲狀腺激素受體(thyrotropin receptor,TSHR)產(chǎn)生循環(huán)抗體,觸發(fā)甲狀腺功能亢進(jìn)繼而導(dǎo)致出現(xiàn)甲狀腺毒癥的一種自身免疫疾病[12-13],GD在臨床上的常見表現(xiàn)為甲狀腺的腫大、毒癥、炎癥病變,眼眶組織的重塑或者出現(xiàn)其他一些罕見皮膚病[14-15]。若GD侵入眼眶,所引起的眼部病變即稱為甲狀腺相關(guān)性眼病(TAO)。TAO的病程可分為活動(dòng)期與非活動(dòng)的靜止期,活動(dòng)期的病理特征是眼眶內(nèi)和眼眶周圍脂肪和結(jié)締組織的廣泛炎癥,眼外肌肌纖維和眼眶脂肪之間大量的T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞浸潤(rùn),以及偶爾出現(xiàn)的B細(xì)胞?；顒?dòng)期中眼眶組織中的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等合成的促炎性細(xì)胞因子在誘發(fā)自身炎癥反應(yīng)以及形成細(xì)胞外基質(zhì)的進(jìn)程中發(fā)揮了重要的作用;眼眶間質(zhì)中沉積的透明質(zhì)酸的性質(zhì)與數(shù)量不僅決定TAO的病變組織學(xué)特征,還影響著眼眶組織的膨脹損傷程度。穩(wěn)定靜止期的TAO通常表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)減弱消退,并伴有臨床癥狀的改善。TAO的活動(dòng)期以分泌Th1類細(xì)胞因子為主,而靜止期則主要分泌Th2類細(xì)胞因子。TAO在炎癥反應(yīng)過(guò)程中早期出現(xiàn)大量活化的T細(xì)胞浸潤(rùn)眼眶,其產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子反饋?zhàn)饔糜赥細(xì)胞,從而放大免疫炎癥效應(yīng),造成強(qiáng)烈組織損傷,因而有學(xué)者指出控制TAO疾病過(guò)程中T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答可以成為TAO生物治療的關(guān)鍵手段[16-18]。

圖4 各組OF誘導(dǎo)的MLR反應(yīng)體系上清中Th1型細(xì)胞因子表達(dá)水平 A:各組OF誘導(dǎo)的MLR反應(yīng)體系上清中TNF-α細(xì)胞因子表達(dá)水平;B:各組OF誘導(dǎo)的MLR反應(yīng)體系上清中IL-2細(xì)胞因子表達(dá)水平;C:各組OF誘導(dǎo)的MLR反應(yīng)體系上清中IFN-γ細(xì)胞因子表達(dá)水平。

表2 各時(shí)間點(diǎn)甲狀腺眼病模型中小鼠眼眶CD4+T細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子情況(±s,pg/mL,n=3)

表2 各時(shí)間點(diǎn)甲狀腺眼病模型中小鼠眼眶CD4+T細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子情況(±s,pg/mL,n=3)

注:aP＜0.05 vs生理鹽水組同時(shí)間段。

分組時(shí)間點(diǎn)TNF-αIL-2IFN-γ生理鹽水組7d125.26±13.167.58±3.0416.54±3.01 14d158.62±17.516.56±2.9725.48±2.92 21d132.23±14.218.01±1.9821.06±1.92 28d109.13±10.054.72±1.5218.97±1.42 Lv-sht001重組病毒組7d45.37±9.63a6.02±5.10a7.09±1.12a14d68.12±14.62a5.34±3.28a10.41±2.41a21d57.41±12.11a4.72±3.09a9.71±1.59a28d50.54±13.59a3.21±1.67a7.62±1.74a

成纖維細(xì)胞,過(guò)去認(rèn)為僅是局部微環(huán)境中的組織結(jié)構(gòu)成分,作用是合成細(xì)胞外基質(zhì)成分并維持組織的動(dòng)態(tài)平衡。但新近研究發(fā)現(xiàn),成纖維細(xì)胞還是一種能與特定免疫細(xì)胞之間進(jìn)行信號(hào)傳遞通訊的細(xì)胞。成纖維細(xì)胞能通過(guò)增殖、分化為免疫效應(yīng)細(xì)胞來(lái)合成細(xì)胞因子、趨化因子和脂質(zhì)中間體等成分參與炎癥的活化通路[19-20]。眼眶成纖維細(xì)胞(OF)特別是來(lái)源于TAO患者的OF,在與細(xì)胞因子反應(yīng)時(shí)具有獨(dú)特性,OF與IL-1β、CD40L作用時(shí),可產(chǎn)生過(guò)量的前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2),并能促進(jìn)合成細(xì)胞外基質(zhì)透明質(zhì)酸[21-22]。T細(xì)胞通過(guò)膜表面的CD40L與OF表面的CD40作用從而在OF的活化中發(fā)揮重要作用,一旦CD40與T細(xì)胞表面的CD40L結(jié)合,誘發(fā)幼稚T細(xì)胞的大量增殖,提高促炎細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、IL-8等的產(chǎn)生,這些因子會(huì)導(dǎo)致透明質(zhì)酸合成酶以及葡萄糖脫氫酶的表達(dá)升高,增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。受刺激的OF分泌的多種細(xì)胞因子中含有IL-16與趨化因子rantes,可以趨引T細(xì)胞遷徙[23-24]。因而有效阻斷OF的活化或是阻止OF于T細(xì)胞之間的相互信號(hào)作用通路對(duì)于相關(guān)疾病的治療是一個(gè)關(guān)鍵。

TLR4是OF表面的一種重要膜表面受體,其可以識(shí)別細(xì)菌脂多糖后被活化,激活的TLR4經(jīng)過(guò)胞內(nèi)一系列下游信號(hào)啟動(dòng)細(xì)胞因子,從而誘發(fā)一系列的免疫反應(yīng)并導(dǎo)致急慢性炎癥[25],而在炎癥演變的進(jìn)程中,炎癥導(dǎo)致眼眶組織病變。因而阻斷或抑制TLR4信號(hào)傳遞有望成為探索TAO的發(fā)病機(jī)制和生物干預(yù)治療的一種手段。

短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)對(duì)干擾基因表達(dá)具有高效性和特異性,在科研實(shí)踐中已被用于干擾基因表達(dá)的有效載體用[26]。在本實(shí)驗(yàn)中,依據(jù)設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)可能的TLR4 shRNA干擾序列片段,篩選得到最佳干擾TLR4基因表達(dá)的shRNA序列,克隆入慢病毒系統(tǒng),導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)TLR4基因的特異性靜默。慢病毒的轉(zhuǎn)染效率較高且安全性較好,當(dāng)前已經(jīng)成為科研中病毒轉(zhuǎn)染的首選載體[27]。我們從小鼠OF的TLR4序列中篩選了有效干擾靶點(diǎn)序列,并成功構(gòu)建重組慢病毒轉(zhuǎn)染OF,有效抑制了其胞內(nèi)TLR4的表達(dá),體外結(jié)果顯示了LV-sht001能有效抑制OF中TLR4基因的表達(dá),其轉(zhuǎn)染的OF能有效抑制MLR反應(yīng)中T細(xì)胞的增殖,并且降低T細(xì)胞相關(guān)炎性細(xì)胞因子分泌水平。體內(nèi)小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí),導(dǎo)入干擾TLR4基因慢病毒實(shí)驗(yàn)組小鼠,其眼眶內(nèi)T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平顯著下降。這些結(jié)果顯示經(jīng)shRNA沉默的TLR4在抑制TAO的發(fā)展中可能起重要作用,有望成為治療TAO的新型生物靶點(diǎn)。但由于TAO的發(fā)生發(fā)展機(jī)制非常復(fù)雜,對(duì)于探索經(jīng)TLR4干擾OF,調(diào)控眼眶內(nèi)細(xì)胞炎癥反應(yīng)進(jìn)程的效應(yīng)和作用機(jī)制仍需要深入探索和研究。

1 Fatourechi V.Medical management of extrathyroidal manifestation of graves disease.Endocr Pract 2014;20(12):1333-1344

2 Lim HS,Back KO,Kim HJ,et al.Hyaluronic Acid Induces COX-2 Expression via CD44 in Orbital Fibroblasts From Patients With Thyroid-Associated Ophthalmopathy.Invest Ophthalmol Vis Sci 2014;55(11): 7441-7450

3 Antonelli A,Ferrari SM,Corrado A,et al.Extra-ocular muscle cells from patients with Graves'ophthalmopathy secrete α(CXCL10)and β (CCL2)chemokines under the influence of cytokines that are modulated by PPARγ.Autoimmun Rev 2014;13(11):1160-1166

4 Kan E,Kan EK,Ecemis G,et al.Presence of thyroid-associated ophthalmopathy in Hashimoto's thyroiditis.Int J Ophthalmo 2014;7(4): 644-647

5 Salvi M.Immunotherapy for Graves' ophthalmopathy.Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes 2014;21(5):409-414

6 Wu X,Zhang G,Wang X,et al.Endotoxin tolerance induction in human periodontal ligament fibroblasts stimulated with different bacterial lipopolysaccharides.Arch Oral Biol 2014;60(3):463-470

7 Ren A,Moon C,Zhang W,et al.Asymmetrical Macromolecular Complex Formation of Lysophosphatidic Acid Receptor 2(LPA2)Mediates Gradient Sensing in Fibroblasts.J Biol Chem2014;289(52): 35757-35769

8 Chng CL,Lai OF,Chew CS,et al.Hypoxia increases adipogenesis and affects adipocytokine production in orbital fibroblasts-a possible explanation of the link between smoking and Graves' ophthalmopathy.IntJ Ophthalmol 2014;7(3):403-407

9 Martins TM,de Paula AC,Gomes DA,et al.Alkaline phosphatase expression/activity and multilineage differentiation potential are the difference between fibroblasts and orbital fat-derived stem cells--a study in animal serum-free culture conditions.Stem Cell Rev 2014;10(5): 697-711

10 Shan SJ,Douglas RS.The pathophysiology of thyroid eye disease.JNeuroophthalmol 2014;34(2):177-185

11 Costagliola S,Many MC,Denef JF,et al.Genetic immunization of outbred mice with thyrotropin receptor cDNA provides a model of Graves'disease.J Clin Invest2000;105(6):803-811

12 Javadi H,Pashazadeh AM,Mogharrabi M,et al.Comparison of Thyroid Blood Flow and Uptake Indices Using Technetium-99m Pertechnetate in Patients with Graves'Disease and Euthyroid Subjects.Mol Imaging Radionucl Ther2014;23(3):96-100

13 Antonelli A,Ferrari SM,Corrado A,et al.Autoimmune thyroid disorders.Autoimmun Rev 2014;14(2):174-180

14 Samuelsson K,Palmer M,Press R.Sensory ataxia associated with Graves'disease.J Neurol Sci2014;347(1-2):406-407

15 Yin J,Zhu J,Huang D,et al.Unilateral Symptomatic Intracranial Arterial Stenosis and Myopathy in an Adolescent with Graves Disease:A Case Report of an High-resolution Magnetic Resonance Imaging Study.JStroke Cerebrovasc Dis 2015;24(1):e49-52

16 Fatourechi V.Thyroid dermopathy and acropachy.Best Pract Res ClinEndocrinol Metab2012;26(4):553-565

17 Ardley M,McCorquodale T,Laahooti H,et al.Eye findings and immunological markers in probands and their euthyroid relatives from a single family with multiple cases of thyroid autoimmunity.Thyroid Res2012;5(1):4

18 Bartalena L.Prevention of Graves'ophthalmopathy.Best Pract ResClin Endocrinol Metab2012;26(3):371-379

19 Riemann A,Ihling A,Thomas J,et al.Acidic environment activates nflammatory programs in fibroblasts via a cAMP-MAPK pathway.Biochim Biophys Acta2014;1853(2):299-307

20 G?lz L,Bayer S,Keilig L,et al.Possible implications of Ni(II)on oral IL-1β-induced inflammatory processes.Dent Mater2014;30(12): 1325-1335

21 Rhiu S,Chae MK,Lee EJ,et al.Effect of tanshinone II A in an in vitro model of Graves' orbitopathy.Invest Ophthalmol Vis Sci2014;55 (9):5900-5910

22 Virakul S,Dalm VA,Paridaens D,et al.The tyrosine kinase inhibitor dasatinib effectively blocks PDGF-induced orbital fibroblast activation.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol2014;252(7):1101-1109

23 Lee SH,Lim SY,Choi JH,et al.Benzylideneacetophenone derivatives attenuate IFN-γ-induced IP-10/CXCL10 production in orbital fibroblasts of patients with thyroid-associated ophthalmopathy through STAT-1 inhibition.Exp Mol Med 2014;46:e100

24 Lee WM,Paik JS,Cho WK,et al.Rapamycin enhances TNF-αinduced secretion of IL-6 and IL-8 through suppressing PDCD4 degradation in orbital fibroblasts.Curr Eye Res2013;38(6):699-706

25 Pone EJ,Lou Z,Lam T,et al.B cell TLR1/2,TLR4,TLR7 and TLR9 interact in induction of class switch DNA recombination: Modulation by BCR and CD40,and relevance to T-independent antibody responses.Autoimmunity2015;48(1):1-12

26 Moffat J,Sabatini DM.Building mammalian signaling pathways with RNAi screens.Nat Rev Mol Biol2006;7(1):177-187

27 Wiznerowicz M,Szulc J,Trono D.Tuning silence:conditional systems for RNA inerference.Nat Methods 2006;3(9):682-688

Inhibition effect of mouse orbital fibroblasts TLR4 gene silencing on the thyroid-associated ophthalmopathy

Wen-Ying Wang1,Wei-Ming Zhou2,Yi Zhang2, Hua-Xin Chen3

1Shanghai Haixin Biological Technology Co.,Ltd,Shanghai 201203,China;2Department of Immunology,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China;3Department of Ophthalmology,Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command of Chinese PLA,Wuhan 430070,Hubei Province, China

Co-first authors:Wen-Ying Wang and Wei-Ming Zhou

Hua-Xin Chen.Department of Ophthalmology,Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command of Chinese PLA,Wuhan 430070,Hubei Province, China.971213506@qq.com

·AIM:To construct shRNA lentivirus interference vector of mice orbital fibroblasts TLR4 and to research the therapeutic effect and mechanism of TL4-/-fibroblasts on thyroid-associated ophthalmopathy.·METHODS:Optimal shRNA interference expression plasmid of mouse orbital fibroblasts TLR4 gene was designed,built,and screened.Then the best shRNA was introduced into lentiviral expression vector by Gateway method and recombinant lentiviral vector was used to infect mouse orbital fibroblasts.Its capability of negative regulating the immune inflammatory response was researched.At last the method of fibroblast TLR4 gene silencing in the model mice of thyroid-associated ophthalmopathy was used,the in vivo therapeutic effect was observed.·RESULTS:ShRNA sequences with the best effect of gene silencing were selected and introduced into lentiviral vectors(virus titer was 1.5×106TU/m L).Balb/cmice orbital fibroblasts transfected lentivirus could negatively regulate the immune response,inhibit immune inflammatory response.The proceeding of thyroid-associated ophthalmopathy of the mice transfected TLR4-/-recombinant lentivirus was obviously prior to that of the control mice.·CONCLUSION:Mouse fibroblast TLR4-/-siRNA lentiviral vectors are successfully obtained,which has the favourable inhibitory effect on immune inflammatory responses.The recombinant entivirus could protect the proceeding of thyroid-associated ophthalmopathy, therefore the TLR4 expression interference is a novel potential target for thyroid-associated ophthalmopathy.

shRNA;TLR4;fibroblast;thyroidassociated ophthalmopathy;negative regulation to immune responses

王文英,女,碩士,工程師,研究方向:細(xì)胞免疫治療;周維明,男,助理研究員,研究方向:細(xì)胞免疫治療。

陳華新,男,碩士,主治醫(yī)師,研究方向:眼整形、眼眶病.971213506@qq.com

2015-05-25

2015-10-22

:Wang WY,Zhou WM,Zhang Y,et al.Inhibition effect of mouse orbital fibroblasts TLR4 gene silencing on the thyroidassociated ophthalmopathy.Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci)2015; 15(11):1862-1866

10.3980/j.issn.1672-5123.2015.11.06

*:作者王文英和周維明對(duì)本文貢獻(xiàn)一致。

Received:2015-05-25 Accepted:2015-10-22

方法:設(shè)計(jì)、構(gòu)建、篩選小鼠眼眶成纖維細(xì)胞TLR4基因的最優(yōu)干擾shRNA表達(dá)質(zhì)粒,選擇Gateway方法將質(zhì)粒導(dǎo)入慢病毒表達(dá)載體中,使用重組慢病毒載體感染小鼠眼眶成纖維細(xì)胞,研究其對(duì)免疫炎性反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控能力,并在小鼠甲狀腺眼病模型中采用沉默成纖維細(xì)胞TLR4基因的方法,觀察其體內(nèi)治療效果。

結(jié)果:篩選出具有最好基因靜默效果的shRNA序列,導(dǎo)入慢病毒載體,病毒滴度為1.5×106TU/mL。轉(zhuǎn)染慢病毒的Balb/c小鼠眼眶成纖維細(xì)胞能夠負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答,抑制免疫炎癥反應(yīng)。在疾病動(dòng)物模型中轉(zhuǎn)染了干擾病毒載體實(shí)驗(yàn)組小鼠,其眼病發(fā)生發(fā)展情況均優(yōu)于對(duì)照組。

結(jié)論:成功獲得了小鼠成纖維細(xì)胞TLR4-/-shRNA的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染了該載體的小鼠眼眶成纖維細(xì)胞能夠抑制正向免疫應(yīng)答,可以有效地抑制甲狀腺眼病的發(fā)展,揭示干擾TLR4表達(dá)可能成為防治甲狀腺眼病的生物診療措施。