獵隼腎臟的組織學(xué)觀察及HGF在腎臟中的表達(dá)

王 昱

（隴南師范高等?？茖W(xué)校 生化系，甘肅 成縣 742500）

生物科學(xué)與技術(shù)

獵隼腎臟的組織學(xué)觀察及HGF在腎臟中的表達(dá)

王 昱

（隴南師范高等?？茖W(xué)校 生化系，甘肅 成縣 742500）

應(yīng)用組織學(xué)方法觀察了獵隼腎臟的組織結(jié)構(gòu)，利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）在腎臟中的表達(dá)。結(jié)果表明：與大多數(shù)鳥類的腎臟結(jié)構(gòu)相似，獵隼的腎臟主要由許多腎單位、集合管和少量結(jié)締組織構(gòu)成，但獵隼的腎臟皮質(zhì)與髓質(zhì)分界較明顯。腎單位由腎小體和與之相連的上皮樣腎小管構(gòu)成。腎小體由一團(tuán)蟠曲的毛細(xì)血管構(gòu)成。近曲小管由單層立方上皮細(xì)胞組成，上皮細(xì)胞游離面有刷狀緣。遠(yuǎn)曲小管和集合管管腔較大，腔面無(wú)刷狀緣。腎小管和集合管上皮細(xì)胞都呈HGF免疫反應(yīng)陽(yáng)性。表明HGF可能參與調(diào)節(jié)正常組織細(xì)胞的生命活動(dòng)。

獵隼；腎臟；HGF；顯微結(jié)構(gòu)；免疫組織化學(xué)

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor, HGF），是20世紀(jì)70年代中期發(fā)現(xiàn)的一種新型生物活性物質(zhì)，最初由Michalopoulos等[1]從部分肝切除的大鼠血漿中提取，能獨(dú)立特異地在體內(nèi)外啟動(dòng)并促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，故命名為HGF[2]。近期研究表明，HGF是一種間充質(zhì)來(lái)源的多效性細(xì)胞因子，對(duì)多種組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織修復(fù)再生具有重要的生理調(diào)節(jié)功能[3]。

獵隼（Falco cherrug），屬鳥綱隼形目隼科隼屬，主要分布于中國(guó)和中歐、北非、印度北部、蒙古等地區(qū)，為瀕危野生二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。目前，有關(guān)獵隼的研究比較少，關(guān)進(jìn)科等[4]比較了獵隼與其他隼屬鳥類Cytb和CO I基因的差異，馬鳴等[5]調(diào)查了中國(guó)西部地區(qū)獵隼的分布狀況與繁殖生態(tài)，吳逸群等[6]研究了繁殖期獵隼的食性，但有關(guān)獵隼腎組織學(xué)方面的研究未見報(bào)道。為了搞清獵隼腎臟的結(jié)構(gòu)特征，為動(dòng)物學(xué)研究、生理學(xué)研究、比較解剖學(xué)研究和保護(hù)生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料，本研究利用生物顯微技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法觀察分析了獵隼腎臟的組織結(jié)構(gòu)和有關(guān)生物活性物質(zhì)的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 材料

成縣動(dòng)物保護(hù)站因傷斷翅救援無(wú)效的成年獵隼1只（♂），體重760 g，體長(zhǎng)32.6 cm，打開體腔取其腎臟（未發(fā)現(xiàn)異常變化）作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 組織學(xué)觀察

將獵隼腎臟用生理鹽水沖洗后修成常規(guī)大小的組織塊，投入15%的中性福爾馬林液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片（厚5-7 μm），H.E染色，在顯微鏡（Olympus，F(xiàn)X-35WA，Japan）下觀察并拍照。

1.3 免疫組織化學(xué)

免疫組化SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法）。將腎臟石蠟切片脫蠟至水，微波處理進(jìn)行抗原修復(fù)，用3% H2O2室溫孵育10 min，正常兔血清室溫封閉30 min，然后用兔抗HGF多克隆抗體（1∶50），4℃孵育過(guò)夜；次日取出切片以PBS沖洗后，再依次滴加生物素化羊抗兔IgG孵育30 min，SABC工作液孵育30 min，最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，空白對(duì)照以PBS代替一抗。常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 圖像分析

用美國(guó)Image-proplus 5.0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。從免疫組織化學(xué)切片中各選1張形態(tài)典型對(duì)應(yīng)切面，檢測(cè)活性物質(zhì)在腎臟中表達(dá)的強(qiáng)度。測(cè)量時(shí)保證光源的穩(wěn)定，并且取圖之前預(yù)熱20 min以上，采圖時(shí)各項(xiàng)設(shè)置包括光源、光圈大小、白平衡、曝光強(qiáng)度、敏感度、對(duì)比度等均改為手動(dòng)調(diào)節(jié)且固定，以保證每次取圖系統(tǒng)的設(shè)置值一樣。取平均光密度和積分光密度兩個(gè)指標(biāo)，測(cè)量值的平均值為最終灰度值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，采用單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)分析過(guò)程以SPSS13.0軟件完成。

2 結(jié)果

和其它鳥類腎臟結(jié)構(gòu)相似，獵隼的腎臟左右各一個(gè)，呈長(zhǎng)條形，深陷于愈合薦骨的凹窩內(nèi)。腎的表面包裹一層致密的結(jié)締組織被膜。腎實(shí)質(zhì)的皮質(zhì)和髓質(zhì)分界較清楚（圖1a），主要由許多腎單位、集合管和少量的結(jié)締組織構(gòu)成（其間有血管）。腎單位（腎結(jié)構(gòu)和功能的基本單位）由一個(gè)腎小體和一個(gè)與其連接的腎小管構(gòu)成。

腎小體多為橢圓形或圓形，其一側(cè)是血管極，為入球小動(dòng)脈進(jìn)入腎的入口，另一側(cè)為尿極，是腎小囊與腎小管連接處。腎小體由腎小球和腎小囊組成。腎小球?yàn)橐粓F(tuán)蟠曲的毛細(xì)血管，包繞在腎小囊內(nèi)，其中央是一群緊密堆集的細(xì)胞群。腎小囊是腎小管盲端膨大凹陷形成的雙層球狀囊，囊壁分壁層和臟層2層（圖1b、1c）。

圖1 獵隼腎臟觀察圖片

腎小管分為近曲小管、細(xì)段和遠(yuǎn)曲小管（圖1b、1c）。近曲小管是腎小管中最長(zhǎng)的部分，起始于腎小囊壁層，管壁細(xì)胞矮柱狀，細(xì)胞之間界限不清楚，胞質(zhì)嗜酸性，被染成紅色，腔面具有明顯的刷狀緣。細(xì)段管壁薄，由單層扁平上皮組成，細(xì)胞染色淡，管腔上皮無(wú)刷狀緣。遠(yuǎn)曲小管比近曲小管短，管壁上皮為單層立方型細(xì)胞，上皮細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞之間界限較明顯，胞質(zhì)呈弱嗜酸性，染色較淺，腔面缺少刷狀緣。

集合管管壁內(nèi)襯淡染的立方上皮細(xì)胞和呈矮柱狀上皮細(xì)胞，細(xì)胞界限明顯，管腔較大，腔面無(wú)刷狀緣（圖1b）。

免疫組織化學(xué)顯示，陽(yáng)性表達(dá)部位被染成棕黃色。腎小管和集合管上皮細(xì)胞呈HGF免疫反應(yīng)陽(yáng)性，陽(yáng)性物質(zhì)主要集中于細(xì)胞質(zhì)（圖1d～ 1e）。陰性對(duì)照組無(wú)棕黃色反應(yīng)物（圖1f、1g）。獵隼腎臟中HGF表達(dá)部位的平均光密度及積分光密度如表1。

表1 HGF 在腎臟表達(dá)的平均光密度和積分光密度

3 討論

獵隼的腎實(shí)質(zhì)的皮質(zhì)和髓質(zhì)分界較紅腹錦雞[7]、大鴇[8]、雀鷹[9]、高山兀鷲[10]等鳥類明顯，但沒(méi)有哺乳動(dòng)物腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)的分界清楚，獵隼腎實(shí)質(zhì)的皮質(zhì)和髓質(zhì)分界仍要依據(jù)腎小體、腎小管、集合管及髓袢的分布來(lái)確定。在已研究的哺乳動(dòng)物中，發(fā)現(xiàn)腎臟外周層為褐色的皮層，是主要的泌尿區(qū)，深部是顏色較淡的髓質(zhì)，在垂直斷面可以明顯區(qū)分出皮質(zhì)和髓質(zhì)[11]。獵隼等鳥類的腎小球結(jié)構(gòu)都較為簡(jiǎn)單，為一團(tuán)蟠曲的毛細(xì)血管，中央是一群緊密堆集的細(xì)胞群，而且體積較小，這表明腎小球?yàn)V過(guò)率較低。但鳥類的腎臟相對(duì)較大，約占體重的0.6%～2.1 %，哺乳動(dòng)物腎臟約占體重的0.4%～1.1 %；腎小球數(shù)量比哺乳動(dòng)物要多，鳥類每1 mm3的腎臟皮質(zhì)中，含有100～500個(gè)腎小球，而哺乳類只有15個(gè)左右，這表明鳥類是通過(guò)增大腎臟比重和腎小球數(shù)量補(bǔ)償了濾過(guò)面積少的不足[11]。因此，獵隼能迅速地排除廢物，維持體內(nèi)的水鹽平衡，這與其既能棲息于山區(qū)開闊地帶、河谷、草地，同時(shí)又能生活于干旱沙漠地區(qū)的生活習(xí)性相適應(yīng)。

HGF是眾多腎臟生長(zhǎng)因子中較為重要的一種。腎臟HGF由腎小球系膜細(xì)胞、腎成纖維細(xì)胞、腎間質(zhì)細(xì)胞和腎血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，HGF是腎臟上皮基質(zhì)、內(nèi)皮腎小球基膜之間相互作用的介質(zhì)。HGF可通過(guò)旁分泌、內(nèi)分泌及自分泌作用于腎小球上皮細(xì)胞和腎血管內(nèi)皮細(xì)胞，在正常情況下主要是以無(wú)活性的形式存在，經(jīng)酸、堿、原溶酶作用或移去潛伏分子的碳水化合物之后被激活，促進(jìn)靶細(xì)胞的有絲分裂、遷移、分化，并促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞和腎成纖維細(xì)胞形成腎小管[3]。當(dāng)組織器官損傷時(shí)，HGF在受損組織中表達(dá)增加，從而使損傷的組織修復(fù)、重新構(gòu)建[2]。但彭栗等[2]在基因水平和蛋白水平上證實(shí)在正常牙髓細(xì)胞中有HGF的表達(dá)，Weng等[12]發(fā)現(xiàn)HGF在晶狀體和視網(wǎng)膜中也有表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)觀察顯示，HGF在獵隼腎臟中有大量表達(dá)，提示HGF可能具有調(diào)節(jié)正常組織細(xì)胞的生命活動(dòng)的功能，但有待于進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯、校對(duì)：李春香）

Histological Observation and Expression of HGF of Falco Cherrug Kidney

WANG Yu

(Department of Biology and Chemistry, Longnan Teachers College, Chengxian 742500, China)

To provide basic data for the study on zoology, physiology and zootomy, the structural features of the kidney of Falco cherrug were studied by microscopy and expression of HGF was measured by immunohistochem- ical method. The result shows that similar to most birds’ kidney, the kidney of Falco cherrug consisted mainly of nephrons, collecting ducts and a little connective tissue, but the verge of cortex and medulla in kidney was clear. The nephron comprised renal corpuscle and a renal tubule. The structure of glomerular capillary was made from convoluted capillaries. The proximal convoluted tubule was lined with a well-developed brush border. The lumen diameters of both distal convoluted tubule and collecting duct were large, and their cell apex had no a bush border. HGF appeared to be expressed in the epithelial cells of the renal tubular and collecting duct. The evidence indicates that HGF might be involved in the regulation of the normal histiocyte life activities.

Falco cherrug; kidney; HGF; microstructure; immunohistochemistry

Q954.62

A

1009-9115(2015)02-0032-03

10.3969/j.issn.1009-9115.2015.02.010

甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1107RJZK243），甘肅省高等學(xué)?？蒲匈Y助項(xiàng)目（1128B-01）

2014-07-11

王昱（1973-），男，甘肅天水人，碩士，教授，研究方向?yàn)榧?xì)胞與發(fā)育生物學(xué)。