樹突狀細胞與調節(jié)性T細胞在大鼠動脈粥樣硬化中的作用及氟伐他汀的干預效應研究*

牛 川，王 清

(1.濰坊醫(yī)學院心血管內(nèi)科，山東濰坊 261053；2.山東省千佛山醫(yī)院心內(nèi)一科，濟南 250014)

論著·基礎研究

樹突狀細胞與調節(jié)性T細胞在大鼠動脈粥樣硬化中的作用及氟伐他汀的干預效應研究*

牛 川1，王 清2△

(1.濰坊醫(yī)學院心血管內(nèi)科，山東濰坊 261053；2.山東省千佛山醫(yī)院心內(nèi)一科，濟南 250014)

目的 探討樹突狀細胞(DCs)與調節(jié)性T細胞(Treg)在動脈粥樣硬化過程中的作用機制及DCs與Treg之間的相關性，觀察氟伐他汀對大鼠主動脈粥樣硬化的干預效應。方法30只雄性Wistar大鼠，分為3組。其中，對照組10只，喂養(yǎng)普通飼料；高脂組10只，喂養(yǎng)普通AS飼料；氟伐他汀組10只，喂養(yǎng)AS飼料+氟伐他汀0.1 g·kg-1·d-1。喂養(yǎng)20周，取胸主動脈，采用流式細胞儀檢測各組DCs的免疫表型CD11c、HLA-DR及Treg免疫分子CD4、CD25、FoxP3的表達，分析DCs、Treg在各組主動脈壁中的數(shù)量分布變化及DCs與Treg相關性。結果(1)流式細胞術檢測，CD11c+及CD11c+HLA-DR+雙陽性分子表達，高脂組及氟伐他汀組與對照組比較明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；氟伐他汀組與高脂組比較明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；(2)CD4+CD25+及CD4+CD25+FoxP3+Treg淋巴細胞表達，氟伐他汀組與高脂組比較，Treg淋巴細胞表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，對照組血管壁內(nèi)未見Treg表達；(3)相關性分析，動脈粥樣硬化病變組織中CD11c+HLA-DR+DCs與CD4+CD25+FoxP3+Treg相關性分析顯示，在高脂組與氟伐他汀組中均呈明顯負相關。結論免疫細胞DCs與Treg均參與了AS大鼠主動脈粥樣硬化病變的發(fā)生與發(fā)展過程，且氟伐他汀可通過降低粥樣斑塊內(nèi)DCs的數(shù)量、增加CD4+CD25+FoxP3+Treg的表達來實現(xiàn)抗AS病變的目的。

動脈粥樣硬化；樹突細胞；調節(jié)性T細胞；氟伐他?。幻庖哒{節(jié)

動脈粥樣硬化是一種免疫炎癥性疾病，是通過一系列免疫反應來實現(xiàn)的，在經(jīng)歷脂質條紋、脂質斑塊到纖維斑塊和粥樣硬化斑塊的過程中,始終都有各種炎性細胞和大量炎癥介質參與。目前，很多研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化斑塊中存在大量的樹突狀細胞(DCs)和T淋巴細胞的浸潤，DCs作為體內(nèi)最強有力的抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)，在長期高血脂環(huán)境下，一旦被充分激活會將自身抗原提呈給T淋巴細胞而直接在血管壁發(fā)生炎性反應。調節(jié)性T細胞(Treg)是一組建立和維持外周免疫耐受的成熟CD4+CD25+T淋巴細胞亞群，而其中FoxP3是檢測Treg的特征性標志，現(xiàn)已證實動脈粥樣硬化病變外周血中的Treg數(shù)量會減少并成為動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的重要因素[1]。他汀類藥物對心血管疾病有著多方面的作用，包括抑制血管內(nèi)炎癥、增強內(nèi)皮細胞功能、增加循環(huán)血內(nèi)皮祖細胞及增強其功能、減少血管平滑肌細胞的擴增及遷移、穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊及抑制血小板聚集等。目前，對粥樣硬化斑塊組織內(nèi)DCs及Treg細胞表型的分布、兩者之間的關系及藥物的干預性研究較少。本實驗通過對大鼠主動脈粥樣硬化病變組織中DCs及Treg表型的分布及數(shù)量變化，進一步研究DCs及Treg與動脈粥樣硬化形成過程的關系，并探討在動脈粥樣硬化過程中氟伐他汀對DCs及Treg的免疫調控作用，為他汀類藥物抗動脈粥樣硬化尋找新的理論依據(jù)及機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 健康雄性Wistar大鼠30只，鼠齡2～3個月，體質量200～220 g,購自山東大學實驗動物中心。流式試劑：Anti-ratHLA-DR-FITC、Anti-ratCD11c-PE、anti-ratCD4-PC5、anti-ratCD25-PE、anti-ratFoxP3-PE、固定破膜液均購自eBioscience公司，兔抗大鼠IgG-PC5、IgG-PE、IgG-FITC購自BD公司。

1.2 實驗動物模型的建立 30只雄性大鼠在比較理想的實驗室條件下進行喂養(yǎng)[室內(nèi)相關濕度為(80±2)%，溫度為(24±1)℃]。先將大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，分為3組。(1)對照組(10只)：給予普通飼料飲食；(2)高脂組(10只)：給予普通AS飼料(5.0%膽固醇、0.7%膽酸鈉、0.5%丙基硫氧嘧啶、6.0%白糖、10.0%豬油、77.8%基礎飼料)；(3)氟伐他汀組(10只)：在給予AS飼料基礎上，加用氟伐他汀0.1 g·kg-1·d-1。每天對大鼠的攝入量和體質量進行測定，以評估各種變化，20周后進行實驗。喂養(yǎng)過程中對照組死亡2只，高脂組死亡3只，氟伐他汀組死亡5只。

1.3 標本采集 所有大鼠用戊巴比妥鈉進行深度麻醉(120 mg/kg，腹腔內(nèi)注射)后固定在手術臺上，無菌操作下開胸，鈍性分離胸主動脈并進行肝素鹽水灌洗，剪下胸主動脈段組織1～2 cm置于75%乙醇中備用。

1.4 組織單細胞懸液的制備 將主動脈剪碎至小塊放入離心管中，加入2～3 mL膠原酶及胰蛋白酶恒溫37 ℃消化30 min，期間進行間接振蕩，加入少量RPMI1640后以200目尼龍網(wǎng)過濾除去大團塊并低速離心除去細胞碎片，棄上清液后用PBS漂洗沉淀細胞3次，離心后再次棄上清液得到細胞懸液。

1.5 DCs與Treg的流式細胞術檢測 取各組主動脈單細胞懸液并調整細胞密度為1×106/mL，每組取細胞懸液各100 μL分別加入4個離心管中，對DCs及Treg分別進行檢測。對DCs的檢測標記為實驗管和同型對照管，其中實驗管加FITC anti-ratHLA-DR抗體、PE anti-ratCD11c抗體各10 μL，同型對照管加兔抗大鼠IgG-FITC、IgG-PE各10 μL,在室溫避光反應30 min，用含0.5%的胎牛血清洗滌2遍，再加入300 μL PBS重懸成單細胞懸液后上機檢測。對Treg的檢測標記為實驗管和同型對照管，其中，實驗管加anti-ratCD4-PC5抗體、anti-ratCD25-PE抗體，對照管加兔抗大鼠IgG-PC5、IgG-PE各10 μL，避光孵育20 min，PBS液洗滌后重懸，加入1 mL固定、破膜工作液混勻，4 ℃避光60 min后加入2 mL PBS液離心洗滌2次,在實驗管加入anti-ratFoxP3-PE抗體10 μL，對照管加入IgG-PE 10 μL，4 ℃避光后孵育40 min，用500 μL PBS重懸細胞后上機檢測。

2 結 果

2.1 3組大鼠體質量變化比較 3組大鼠在喂養(yǎng)結束后體質量均出現(xiàn)不同程度增加，對照組、高脂組及氟伐他汀組大鼠的體質量分別為(30.52±1.58)g、(31.85±2.14)g、(28.63±1.75)g，3組大鼠間體質量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組大鼠體質量情況比較

2.2 3組大鼠主動脈壁內(nèi)DCs水平變化比較 細胞流式結果分析，高脂組、氟伐他汀組的CD11c分子、CD11c+HLA-DR+雙陽性分子表達較對照組明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。氟伐他汀組的CD11c分子、CD11c+HLA-DR+雙陽性分子表達較高脂組明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2、圖1。

表2 3組大鼠DCs細胞表型的流式細胞分析比較

圖1 流式細胞術檢測各組CD11c+DCs和CD11c+HLA-DR+DCs的比例

圖2 流式細胞術檢測高脂組與氟伐他汀組CD4+CD25+Treg占CD4+T細胞的比例

2.3 高脂組與氟伐他汀組大鼠主動脈壁病變組織Treg水平變化比較 流式細胞術檢測結果分析，對照組血管壁內(nèi)未見Treg細胞表達，高脂組與氟伐他汀組CD4+CD25+與CD4+CD25+FoxP3+Treg分別占CD4+T淋巴細胞比例的比較中顯示，氟伐他汀組中二者的表達較高脂組均明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3、圖2。

2.4 高脂組與氟伐他汀組大鼠主動脈壁病變組織中DC與Treg的相關性 分析顯示高脂組與氟伐他汀組CD11c+HLA-DR+DC細胞與CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞在數(shù)量上呈明顯負相關。見表4、圖3。

表3 高脂組與氟伐他汀組Treg細胞表型的流式細胞術分析

圖3 流式細胞術檢測高脂組與氟伐他汀組CD4+CD25+FoxP3+Treg占CD4+T細胞的比例

表4 DC細胞與Treg細胞水平對比及相關性分析

3 討 論

動脈粥樣硬化目前被認為是一種慢性免疫炎癥性疾病，在病變過程中發(fā)現(xiàn)有T淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等多種免疫細胞參與其中。研究發(fā)現(xiàn)在正常動脈管壁內(nèi)膜下及外膜處定居著一定數(shù)量的樹突狀細胞，這部分細胞被稱為血管樹突狀細胞(VDCs)，現(xiàn)有研究表明廣泛分布在動脈血管內(nèi)膜并表達HLA-DR的VDCs有可能在維持血管內(nèi)環(huán)境的平衡中起著重要作用[2-3]。在高血脂、高血壓等危險因素條件下，血管內(nèi)皮細胞因血流條件的改變而發(fā)生功能變化，從而促使了正常內(nèi)皮組織發(fā)生炎癥反應，使得這些損傷的內(nèi)皮組織區(qū)域優(yōu)先獲得大量的樹突狀細胞和巨噬細胞的定居。大鼠DCs細胞膜表面特異性地表達CD11c分子，而研究發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化形成的起始階段CD11c+DCs則起著重要的積極作用[4]，HLA-DR是MHC Ⅱ類分子的一種，一般在樹突狀細胞、B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞中表達，在成熟樹突狀細胞表面HLA-DR能明顯上調。動脈粥樣硬化是由脂質類物質調控的疾病，正常情況下DCs首先攝取內(nèi)膜和循環(huán)血中的脂質，通過遷移機制輸送至外周淋巴結，經(jīng)過對抗原的加工后提呈給T淋巴細胞發(fā)生特異性免疫反應，而在長期的高血脂環(huán)境作用下，血管內(nèi)皮損傷后脂質不斷在血管壁滯留，特別是氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL)能影響樹突狀細胞遷移至外周淋巴結[5]，并逐漸打破血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，促進動脈粥樣硬化形成。本實驗通過流式細胞術檢測了AS大鼠主動脈壁粥樣斑塊病變內(nèi)DCs表面分子CD11c、HLA-DR數(shù)量的變化，研究結果顯示主動脈粥樣斑塊內(nèi)CD11c+及CD11c+HLA-DR+雙陽性分子數(shù)量較正常動脈血管壁明顯增加，提示DCs向炎性斑塊內(nèi)遷移并且在斑塊病變中大量聚集和定居并誘導成熟，使DCs攝取相關免疫抗原并激活、擴增T淋巴細胞而發(fā)生免疫應答。

調節(jié)性T細胞在動脈粥樣硬化的進展中同樣發(fā)揮著重要作用，Veillard等[6]將ApoE--/CXCR3--小鼠與ApoE-小鼠模型進行比較，發(fā)現(xiàn)動脈粥樣斑塊形成減少但病變組織內(nèi)Treg的數(shù)量卻明顯增加，提示Treg在動脈粥樣硬化早期發(fā)揮著重要作用。Maganto-Garcia等[7]研究也發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化形成早期斑塊內(nèi)Treg數(shù)量是增加的，Treg會逐漸向斑塊病變組織內(nèi)遷移，但在長期高血脂環(huán)境下Treg遷移至動脈粥樣病變部位的能力會大大下降，動脈粥樣硬化進展的后期粥樣斑塊內(nèi)Treg的數(shù)量也會明顯減少。本實驗研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+FoxP3+Treg在高脂組及氟伐他汀組均有不同程度表達，提示CD4+CD25+FoxP3+Treg參與了動脈粥樣硬化的形成過程，并發(fā)揮了積極的免疫調節(jié)作用。Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn)淋巴器官Treg數(shù)量的減少可以促使DCs的分化與擴增，而機制是通過依賴增強的Flt3受體信號轉導完成的。本研究在對DCs與Treg的相關性分析中，高脂組動脈粥樣斑塊中DCs細胞的數(shù)量與Treg細胞呈明顯負相關，Treg含量表達越少而DCs的表達越多，提示在高血脂環(huán)境下，病變組織中Treg數(shù)量的減少可能弱化了對DCs的抑制作用從而增加了DCs的數(shù)量，從另一個角度說明Treg在參與動脈粥樣硬化形成的過程中很可能通過抑制了DCs的成熟分化來發(fā)揮免疫調節(jié)功能。

他汀類藥物目前已成為治療心血管疾病的基石，也是構成動脈粥樣硬化二級預防的基礎之一[9]。研究證實，他汀類藥物能抑制血管內(nèi)炎癥及穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊等功能[10-11]。Maganto-Garcia等[7]對Treg相關研究中認為逆轉高脂血癥能增加Treg對病變組織的遷移，并能大大增加斑塊內(nèi)Treg的數(shù)量。而本研究發(fā)現(xiàn)大鼠病變組織中經(jīng)過氟伐他汀的藥物干預后Treg數(shù)量較高脂組明顯增加，而DCs的數(shù)量較高脂組卻明顯減少了。提示氟伐他汀的穩(wěn)定斑塊、抗炎機制是通過多種途徑來實現(xiàn)的，其中包括增加Treg細胞數(shù)量、促進Treg的免疫抑制功能，以及減少DCs的數(shù)量、抑制其分化成熟來達到抗動脈粥樣硬化的目的。另外，在對DCs與Treg的相關性分析中發(fā)現(xiàn)氟伐他汀組中DCs細胞的數(shù)量與Treg細胞也呈明顯負相關，也提示氟伐他汀很可能增強了Treg的免疫調節(jié)功能來抑制DCs的成熟與分化，但具體機制仍需進一步研究。

動脈粥樣硬化的發(fā)展始終伴隨著DCs、Treg及效應T淋巴細胞三者之間免疫平衡的破壞過程。在長期高血脂環(huán)境下，大量的ox-LDL作為抗原被DC攝取并由DC模式識別受體(PRR)通過細胞信號轉導觸發(fā)炎癥反應[12-13]，促使樹突狀細胞的成熟和細胞因子的合成，包括上調細胞表面MHC-Ⅱ復合分子以及共同刺激分子CD40、CD80、CD86的表達，從而激活Th1、Th2、Th17淋巴細胞，同時Treg通過分泌TGF-β、IL-10等細胞因子來抑制效應T淋巴細胞的免疫反應[14]。隨著動脈管壁內(nèi)環(huán)境的不斷紊亂，最終打破了效應T淋巴細胞與Treg之間的免疫平衡，促進效應T淋巴細胞的擴增而導致了動脈粥樣硬化的發(fā)生[15]。他汀類藥物能夠糾正粥樣斑塊組織內(nèi)免疫平衡紊亂，逆轉Treg與DCs、效應T淋巴細胞間的比例失衡，從而達到抑制斑塊內(nèi)免疫反應、穩(wěn)定斑塊的目的。關于DCs、Treg在動脈粥樣硬化過程中的作用及與效應T淋巴細胞之間的關系還有許多問題需要深入研究，并為臨床中他汀類藥物的作用靶點提供新的思路。

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The effects of fluvastatin on dendritic cells and regulatory T cells in experimental atherosclerosis rat model*

NiuChuan1，WangQing2△

(1.DepartmentofCardiology,WeifangMedicalCollege，Weifang,Shandong261053,China; 2.DepartmentofCardiology,QianfoshanHospital,Jinan,Shandong250014,China)

Objective To establish experimental atherosclerosis (AS) rat model,and to investigate the effects of fluvastatin on dendritic cells(DCs) and regulatory T cells in the model.MethodsThirty male Wistar rats were divided into 3 groups:control group(fed with normal diet),high-fat diet group(fed with AS feed),fluvastatin group(fed AS diet plus fluvastatin 0.1 g·kg-1·d-1).For all the 3 groups,the samples of aorta were obtained after 20 weeks.The flow cytometry was used to detect the immune-phenotypic expression of DCs(CD11c,HLA-DR) and CD4+CD25+FoxP3+regulatory T cells.Results(1)The numbers of CD11c+and CD11c+HLA-DR+double positive cells were significantly increased in the high-fat and fluvastatin group compared with the control group(P<0.01),while fluvastatin treatment reduced the CD11c+and CD11c+HLA-DR+ expression of DCs significantly(P<0.01).(2)the numbers of CD4+CD25+and CD4+CD25+FoxP3+regulatory T cells were higher significantly in fluvastatin group than the high-fat group(P<0.01).No CD4+CD25+and CD4+CD25+FoxP3+regulatory T cells was detected in control group.(3)Correlation analysis between CD11c+HLA-DR+DCs and CD4+CD25+FoxP3+Treg showed that,there was a negative correlation in high-fat diet group and fluvastain group.ConclusionFluvastatin could regulate immune-phenotypic expression of DCs(CD11c,HLA-DR) and numbers of CD4+CD25+FoxP3+regulatory T cells,which shows a new immune regulating mechanism of statins for its anti-atherosclerotic effect.

atherosclerosis；dendrtic cells；regulatory T cell；fluvastatin；immunoregulation

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.35.006

山東省自然科學基金資助項目(2007ZRB14126)。

：牛川(1982-)，醫(yī)師，碩士，主要從事臨床心血管內(nèi)科研究?！?/p>

，Tel：13791120930；E-mail：nrz20110530@163.com。

R541.4

A

1671-8348(2015)35-4913-04

2015-05-08

2015-07-23)