RNAi對胃癌SGC-7901細胞侵襲及遷移能力的影響*

裴 波，寸英麗，姚 乾，張凱戀，覃向南，代佑果，查 勇

(1.昆明醫(yī)科大學研究生院，昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院腹部外科，昆明 650118；3.云南省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，昆明 650118)

論著·基礎研究

RNAi對胃癌SGC-7901細胞侵襲及遷移能力的影響*

裴 波1，寸英麗2△，姚 乾3，張凱戀1，覃向南1，代佑果2，查 勇2

(1.昆明醫(yī)科大學研究生院，昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院腹部外科，昆明 650118；3.云南省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，昆明 650118)

目的 運用RNA干擾(RNAi)技術抑制HER2基因的表達，探討其對胃癌SGC-7901細胞侵襲及遷移能力的影響。方法設計、構建RNAi片段靶向抑制HER2高表達的胃癌細胞株(HER2-RNAi組)，以轉(zhuǎn)染陰性對照系列(陰性對照組)及未轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞(空白對照組)為對照組。利用RT-PCR和Western blot法檢測各組胃癌SGC-7901細胞中HER2的表達情況；采用Transwell小室模型及劃痕實驗檢測RNAi對胃癌細胞體外的侵襲和遷移能力的影響。結果RNAi片段轉(zhuǎn)染后SGC-7901細胞的HER2 mRNA和蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)；侵襲實驗結果顯示,HER2-RNAi組的穿膜細胞數(shù)[(31.5±3.8)個/視野]顯著低于未轉(zhuǎn)染組[(103.6±4.5)個/視野]；遷移實驗結果顯示，HER2-RNAi組的穿膜細胞數(shù)[(63.6±5.1)個/視野]顯著低于未轉(zhuǎn)染組[(193.5±6.2)個/視野]，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論RNAi沉默HER2基因可以抑制胃癌SGC-7901細胞的侵襲和遷移能力，提示RNAi基因沉默技術有可能成為進展期胃癌治療的新方法。

胃腫瘤；RNA干擾；腫瘤轉(zhuǎn)移；HER2基因

胃癌在全球最常見的惡性腫瘤中排名第4位，同時也是世界范圍內(nèi)第2位致死性腫瘤[1]。目前，盡管有手術、化療和放療等多種治療手段綜合治療胃癌，但對于進展期胃癌患者總體療效欠佳，其5年生存率仍低于30%[2]。隨著分子生物學的發(fā)展及對胃癌發(fā)病機制研究的深入，目前，已認識到胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多階段、多步驟、多因素參與的過程，在基因水平研究胃癌的治療成為近年研究熱點。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來發(fā)展起來的一種從基因的角度治療疾病的新技術，RNA中極少量的siRNA就能特異有效地抑制相應基因的表達[3]。本研究采用RNA干擾技術下調(diào)胃癌SGC-7901細胞中HER2基因的表達，觀察其對胃癌細胞株SGC-7901侵襲遷移能力的影響，旨在為胃癌轉(zhuǎn)移的基因靶向治療提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞株SGC-7901(云南省腫瘤研究所常規(guī)保存)；質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-HER2和陰性質(zhì)粒(pGPU6/GFP/Neo-shNC，上海吉瑪公司)；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Hyclone公司)；脂質(zhì)體Lipofectamine2000、TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒、Matrigel膠(日本TAKARA公司)；Transwell小室(美國Coning公司)；RIPA裂解液(索萊寶)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；兔抗人HER2單克隆抗體(Bioss antibody公司)；β-actin、山羊抗兔IgG-HRP(signalway antibody公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 (1)細胞培養(yǎng)：將存在HER2蛋白表達[4]的胃癌SGC-7901細胞株用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)細胞轉(zhuǎn)染：根據(jù)HER2(NM_001005862)基因信息利用siRNA設計原則與方法設計siRNA序列[5]，送上海吉瑪公司合成，選取含有干擾HER2效果最佳的靶點序列pGPU6/GFP/Neo-HER2 (5′-GGG CAG TTA CCA GTG CCA AT-3′)，以及陰性對照組的pGPU6/GFP/Neo-shNC序列(5′-GTT CTC CGA ACG TGT CAC GT-3′)，按照轉(zhuǎn)染手冊轉(zhuǎn)染至SGC-7901細胞中，制備成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HER2-RNAi的SGC-7901細胞(HER2-RNAi組)及陰性對照細胞(陰性對照組)；并收集同期未轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞設為空白對照組。轉(zhuǎn)染后24 h觀察細胞。

1.2.2 RT-PCR檢測HER2 mRNA的表達 應用TRIzol試劑提取細胞總RNA，按TaKaRa公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒進行操作，并以GAPDH為內(nèi)參照。HER2上游引物為5′-TCC GTT TCC TGC AGC AGT C-3′，下游引物為5′-AGA GAG CCA GCC CTC TGA CGT CCA T-3′；內(nèi)參基因GAPDH上游引物為5′-GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3′，下游引物為5′-AGC CAA ATT CGT TGT-3′。反應體系20 μL，反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.2.3 Western blot檢測HER2蛋白的表達 提取各組細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每組取20 μL蛋白上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳產(chǎn)物以250 mA恒流電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用3%BSA封閉液室溫于搖床上搖動封閉2 h，用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)漂洗后置于稀釋的I抗(HER2為1∶500；β-actin為1∶3 000)中4 ℃孵育過夜，再次PBST漂洗后加入稀釋的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)，室溫置于搖床上孵育2 h，洗膜后進行顯影、定影，行圖像分析。

1.2.4 細胞侵襲和遷移實驗 應用無血清的冷DMEM按1∶6稀釋Matrigel基質(zhì)膠，在24孔板的細胞培養(yǎng)孔中置入Transwell小室，在上室覆蓋100 μL稀釋膠，室溫干燥過夜。HER2-RNAi轉(zhuǎn)染組細胞及未轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)48 h后，應用無血清的DMEM調(diào)整細胞密度至5×105/mL，轉(zhuǎn)移至Matrigel包被的Transwell小室中，小室下層加入含10%血清的DMEM。37 ℃培養(yǎng)24 h后，用棉簽拭去非侵襲性細胞，然后用結晶紫固定并染色，在100倍熒光顯微鏡下計數(shù)細胞。細胞遷移實驗步驟除Transwell小室不鋪膠外，其余方法同侵襲實驗。

1.2.5 細胞劃痕實驗 以6孔細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)HER2-RNAi轉(zhuǎn)染組細胞及未轉(zhuǎn)染組細胞，生長24 h后用移液槍頭在培養(yǎng)皿中劃痕，加入無血清培養(yǎng)基。放入5%CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h取樣，拍照。

2 結 果

2.1 載體成功轉(zhuǎn)染并獲得HER2穩(wěn)定表達的SGC-7901細胞 轉(zhuǎn)染24 h后，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察細胞，HER2-RNAi組與陰性對照組中大多數(shù)細胞都熒光著色，與背景形成明顯反差，表明pGPU6/GFP/Neo-HER2與pGPU6/GFP/Neo-shNC載體成功轉(zhuǎn)染進入SGC-7901細胞株并獲得穩(wěn)定表達HER2蛋白，見圖1。

圖1 熒光顯微鏡觀察載體轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞后影像表現(xiàn)(×100)

表1 RT-PCR檢測各組細胞中HER2 mRNA的相對表達量

2.2 RT-PCR檢測各組胃癌SGC-7901細胞中HER2 mRNA的表達 結果顯示，干擾組細胞HER2的mRNA表達水平相對于陰性對照組及空白對照組明顯下降，干擾效率為73.8%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而陰性對照組較空白對照組細胞HER2的mRNA表達則無明顯改變(P>0.05)，提示本實驗設計的siRNA能有效地沉默HER2基因，見表1。

2.3 Western blot檢測各組胃癌SGC-7901細胞中HER2蛋白的表達 HER2-RNAi組與陰性對照組及空白對照組比較，細胞內(nèi)HER2蛋白的表達下調(diào)，HER2-RNAi組的HER2蛋白相對表達量降低了53.9%和52.2%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。陰性對照組和空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組間內(nèi)參β-actin表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

1:空白對照組；2：陰性對照組；3：HER2-RNAi組。

圖2 Western blot檢測各組細胞中HER2蛋白的表達

2.4 RNAi對胃癌SGC-7901細胞體外侵襲和遷移能力的影響 在倒置顯微鏡下觀察，穿膜細胞被染成紫藍色。Transwell小室模型法檢測結果顯示，HER2-RNAi組細胞侵襲穿膜細胞的數(shù)量為(31.5±3.8)個/視野，與未轉(zhuǎn)染的陰性對照組[(103.6±4.5)個/視野]比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3);HER2-RNAi組細胞遷移穿膜細胞的數(shù)量為[(63.6±5.1)個/視野]，與陰性對照組[(193.5±6.2)個/視野]比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。細胞劃痕實驗顯示，與陰性對照組SGC-7901細胞比較，HER2-RNAi組細胞的遷移能力明顯下降，見圖4。

圖3 沉默HER2基因?qū)毎忠u能力的影響(×100)

圖4 HER2-RNAi組和陰性對照組細胞劃痕實驗結果表現(xiàn)(×100)

3 討 論

侵襲轉(zhuǎn)移是進展期胃癌預后差的最主要原因，也是進展期胃癌治療難以突破瓶頸的關鍵因素。故研究胃癌侵襲轉(zhuǎn)移相關因素及其機制并找到抑制這些因素的策略對胃癌的治療具有十分重要的意義。胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移機制尚不清楚，許多腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移都和癌基因或受體基因過度表達有關，其中，HER2基因已被證實是多種腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的密切相關因子，它在細胞信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作用，是細胞分化、增殖、黏附、移動的重要調(diào)節(jié)因子。Boku[6]研究證實，HER2在胃癌組織中高表達，并與胃癌的轉(zhuǎn)移及預后密切相關。故本研究以HER2基因為研究對象，探討RNAi基因沉默技術對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

RNA干擾是近年來被證實在體內(nèi)外沉默基因均十分有效的技術手段，具有高效性、低毒性和特異性，目前已廣泛應用于許多人類基因相關疾病的診治與研究，尤其是在惡性腫瘤、感染性疾病上取得了重大進展[7]。由于RNAi技術能夠選擇性抑制胃癌相關基因的表達，因此它成為胃癌治療非常有前景的可選方法[8]。本實驗中，作者采用RNAi下調(diào)胃癌SGC-7901細胞中HER2的表達，并采用實時定量PCR和Western blot方法在mRNA及蛋白表達水平上進行驗證。結果證實，RNA干擾片段能有效沉默HER2基因，與陰性對照組和空白對照組比較均有顯著差異。

侵襲與轉(zhuǎn)移能力是癌細胞區(qū)別于正常細胞的最基本的特征。Transwell小室實驗和細胞劃痕實驗已被國內(nèi)外眾多學者運用于腫瘤細胞侵襲和遷移的研究[9]，本研究亦采用Transwell小室實驗和細胞劃痕實驗來檢測RNA干擾HER2基因的表達對胃癌細胞侵襲和遷移能力的影響。結果顯示，侵襲和遷移實驗中，與未轉(zhuǎn)染陰性對照組比較，HER2-RNAi組穿膜進入下室的細胞數(shù)量均明顯減少，提示下調(diào)HER2基因的表達可以使胃癌SGC-7901細胞的運動能力明顯降低；細胞劃痕實驗結果顯示，與未轉(zhuǎn)染的對照組比較，HER2-RNAi組細胞的遷移能力明顯下降。本研究結果表明，RNAi基因沉默能夠降低胃癌的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，這與李增軍等[10]利用RNAi沉默高遷移蛋白B1基因可抑制胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移的研究結果是一致的。此外，RNAi在抑制胃癌細胞的生長、促進細胞凋亡[11]，抑制胃癌血管、淋巴管的生成[12-13]，提高放療敏感性[14]，以及逆轉(zhuǎn)胃癌化療多藥耐藥性[15]等方面的研究已取得了初步的成功，這為RNAi基因沉默技術在胃癌治療上的應用奠定了良好的基礎。

綜上所述，RNAi沉默HER2基因可以有效抑制胃癌SGC-7901細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，提示RNAi基因沉默技術能夠產(chǎn)生抗侵襲轉(zhuǎn)移效應，有望成為進展期胃癌治療的新方法。

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The influence of RNAi on invasion and migration of gastric cancer cell line SGC-7901*

PeiBo1，CunYingli2△，YaoQian3，ZhangKailian1，QinXiangnan1，DaiYouguo2，ZhaYong2

(1.GraduateSchoolofKunmingMedicalUniversity,Kunming，Yunnan650500,China；2.DepartmentofAbdominalSurgery,theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650118,China；3.YunnanTumorInstitute,TumorHospitalofYunnanProvince，Kunming，Yunnan650118,China)

Objective To investigate the effect of RNA interference(RNAi) on gastric cancer cell line SGC-7901 invasion and migration by inhibiting HER2 expression.MethodsThe RNAi segments targeting HER2 were designed and transfected into cell lines with high level of HER2(HER2-RNAi group),SGC-7901 cells transfected with nagetive control series(the nagetive control group) and vacant SGC-7901 cells(the blank control group) were used as controls．The mRNA and protein expression of HER2 were detected by real-time PCR and Western blot.The invasive and migration ability of transfected tumor cells by Transwell assay and scratch assay.ResultsThe expression of HER2 was significantly reduced after the transfection(P<0.05).In invasion test，the number of cells crossing through chambers in HER2-RNAi group[(31.5±3.8)/view] was significantly lower than that in the control group[(103.6±4.5)/view](P<0.05)；in migration test，the number of cells crossing through chambem in HER2-RNAi group[(63.6±5.1)/view] was significantly lower than that in the control group[(193.5±6.2)/view](P<0.05).ConclusionHER2 silencing by RNAi suppresses the capacities of invasion and migration of human gastric cancer SGC-7901 cells,suggesting that RNAi gene silencing technique might be a new method in the treatment of advance gastric cancer．

gastric neoplasms;RNA interference;neoplasm metastasis;HER-2 gene

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.35.005

云南省自然科學應用基礎研究基金資助項目(2010CD179、2012FB065、2014FZ034)。

：裴波(1987-)，醫(yī)師，碩士，主要從事胃腸道腫瘤的基礎與臨床研究?！?/p>

，Tel：(0871)8185656；E-mail：kunmingcunyingli@163.com。

R735.2

A

1671-8348(2015)35-4910-03

2015-05-14

2015-07-04)