丹參水提物一步制備丹參素乙酯的研究

錢三立，李冰玉，吳君怡，張真中，楊春杰，鄒云增*

1復旦大學附屬中山醫(yī)院，上海 200032;2 上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071

丹參來源于唇形科鼠尾草屬植物Salvia miltiorrhiza 的干燥根及根莖。丹參水溶性組分，包括丹參素、丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸等，是丹參主要的活性化合物［1］。丹參素是丹參中重要的水溶性活性組分，其他水溶性化合物都可以看作是丹參素的衍生物或者聚合物。丹參素具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、保肝的藥理活性，可用于心腦血管疾病、肝病、糖尿病并發(fā)癥、腎病、神經系統(tǒng)疾病的治療［2-4］。

眾多研究報道了丹參素衍生物的制備方法［5］，期望能夠找到活性更強、口服利用率更高的化合物。由于酚羥基是丹參素抗氧化作用的活性基團，其結構修飾主要集中在其醇羥基和羧基上進行，羧基酯化反應是其中重要的一種。丹參素在大鼠體內的代謝產物丹參素異丙酯，即3-(3，4-二羥苯基)-2-羥基丙酸異丙酯，在體外實驗中證明具有擴張血管的作用［6］。崔慶彬等研究了丹參素醇羥基結構修飾對其活性的影響，結果顯示醇羥基的修飾，不能明顯增加丹參素的活性［7］。

丹參素在丹參中含量較低，常規(guī)的制備方法是采用堿處理丹參水提取物，使丹參的丹參素聚合物(如丹酚酸B、紫草酸等)在堿性條件下水解，得到丹參素粗品，后者經過進一步純化制得丹參素純品。然而，丹參素在堿性條件下不穩(wěn)定，并且純化得到的丹參素進行結構修飾后，需要再一次純化其產物，這無疑大大增加了生產成本。丹參中主要水溶性成分丹酚酸B、紫草酸和迷迭香酸，是丹參素多聚體，在丹參中含量較高。如果能夠開發(fā)一條工藝，將丹參素多聚體的解聚和衍生化合并一步完成，直接制備丹參素的衍生物，將顯著降低其生產成本。本研究探討了用丹參水提取物一步制備成丹參素乙酯的工藝，具有生產應用前景。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

丹參藥材，產自山東臨沂，購自安徽亳州藥材市場，經過上海醫(yī)藥工業(yè)研究院王曙光博士鑒定確證。乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、硫酸，皆為分析純，購自國藥集團化學試劑廠。色譜級乙腈、甲醇為美國天地(Tedia)品牌。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼［1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical;2，2-Diphenyl-1-(2，4，6-trinitrophenyl)hydrazyl)，DPPH］，購自Sigma。丹參提取物對照品丹酚酸B(批號:13091231)、紫草酸(批號:12082915)、迷迭香酸(批號:14011215)、丹參素(批號:13121106)購自上海同田生物技術有限公司。

1.2 丹參提取物的制備

丹參藥材加入10 倍量70%乙醇，80 ℃提取兩次，每次1 h，提取液過濾合并，旋轉蒸發(fā)儀回收乙醇，剩余部分調節(jié)至pH 7，兩倍體積的乙酸乙酯萃取兩次，去除其中的脂溶性成分丹參酮。剩余水相，調節(jié)至pH 2，兩倍體積的乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯相濃縮至干，得到的浸膏即為水提取物，可以直接作為合成用原料(其中丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸三者含量應該不低于85%，以上述三者計算的收率應該不低于90%)。

1.3 丹參素乙酯制備

10 g 丹參水提取物溶解在200 mL 無水乙醇中，加入濃硫酸200 μL，水浴加熱，保持乙醇回流，HPLC 檢測反應進程，6 h 后終止反應。

調節(jié)反應液至pH 2，濃縮回收乙醇，剩余部分，加入200 mL 水溶解，調節(jié)至pH 6，過大孔吸附樹脂“微球1 號”，水洗脫，分步收集50 mL/瓶，HPLC 檢測。產物純度超過80% 的樣品合并，濃縮至200 mL，調節(jié)pH 6，再次過樹脂，最終得到純度超過98%的樣品，冷凍干燥，用于下一步的光譜學分析，結構鑒定。由于丹參素乙酯水溶性較強，該純化過程收率較低，約30%左右。

1.4 DPPH 自由基清除試驗

丹參素、丹參素乙酯清除自由基能力實驗，通過穩(wěn)定自由基DPPH 來檢測［8］。取96 孔板，每孔加入10 μL DPPH(無水乙醇溶液，1mM)，89.6 μL 無水乙醇和0.4 μL 丹參素(或丹參素乙酯)，混勻后置于黑暗中靜置30 min，517 nm 處檢測吸光值。自由基清除能力，以IC50來計算，表示清除半數自由基所需要的丹參素(或丹參素乙酯)的濃度。

1.5 HPLC 分析方法

丹參水溶性組分的提取、丹參素乙酯的制備、純化等，都通過HPLC 檢測。HPLC 采用安捷倫HP1200 液相色譜儀，配備四元泵、自動進樣器、DAD檢測器。流動相為1.7%甲酸∶乙腈∶水=75∶23∶2，流速1 mL/min，檢測波長286 nm。采用C18液相色譜柱，柱溫25 ℃，進樣體積10 μL。

2 結果與討論

2.1 產物的分離純化及結構鑒定

圖1 丹參提取物一步法制備丹參素乙酯反應過程的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of S.miltiorrhiza extract in the transformation to ethyl 3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoate

如圖1 所示，隨著時間的延長，HPLC 保留時間6.5 min 處出現產物并逐漸增加。紫外吸收圖譜表明，該產物具有和丹參素相似的吸收峰，顯示該化合物可能是丹參素的衍生物。ESI-MS 顯示其分子量為226，等同于丹參素乙酯化產物的分子量。由于該反應體系采用乙醇作為溶劑，可以猜測該化合物可能是丹參素乙酯(3-(3，4-二羥苯基)-2-羥基丙酸乙酯)。NMR 結果驗證了該化合物的結構(圖2)。

圖2 丹參素乙酯的NMR 數據Fig.2 NMR data of ethyl 3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoate

2.2 丹參提取物一步法直接制備丹參素乙酯

隨著反應時間的延長，丹參素乙酯含量逐漸增加，反應體系中丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸含量逐漸降低，顯示丹參素乙酯可能來源于它們。同時生成保留時間7.5 min 的產物(原紫草酸，prolithospermic acid，參考文獻的方法制備［9］)，來源于丹酚酸B在酸性條件下的水解。原紫草酸在該條件下不穩(wěn)定，逐漸進一步降解生成其他物質。

圖3 反應路線圖Fig.3 Chemical reaction routes

整個體系反應過程如圖3 所示，丹參水溶性組分中丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸在濃硫酸的催化下發(fā)生水解，生成丹參素，后者在乙醇體系內發(fā)生酯化丹參素乙酯。由于羧酸和醇的酯化反應一般采用相似的反應條件，可以預見若采用其它醇類化合物，亦會發(fā)生類似的酯化反應，得到相關醇的酯化產物。采用類似的方法，可以直接由丹參水溶性提取物，制備各種丹參素酯化產物。相比傳統(tǒng)的首先提純丹參素然后酯化反應的方法，本工藝采用硫酸做催化劑，并且省略了丹參素純化的過程。由于丹參素在酸性條件下更加穩(wěn)定，本方法得率更高，為我們提供了一種制備丹參素酯化產物的新方法。

2.3 丹參主要化合物及丹參素乙酯清除自由基試驗

自由基主要包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、脂氧自由基、羧自由基等，是機體氧化反應產生的物質，具有強氧化性，可以對機體健康細胞產生巨大的損害，引起慢性疾病及衰老癥狀［10，11］。丹參水溶性組分，包括丹參素、丹酚酸B 等，具有非常強的清除自由基的能力。化合物抗氧化活性的大小，常用其清除自由基能力的大小來檢測。DPPH 是一種穩(wěn)定自由基，其溶液在517 nm 波長下有較大吸收，當該自由基被其它化合物所清除時在該波長下吸收減弱，因此常采用它來測定化合物對自由基的清除能力［8］。

圖4 丹酚酸B、紫草酸、丹參素和丹參素乙酯對自由基的清除能力對比Fig.4 DPPH scavenging ability of salvianolic acid B，lithospermic acid，danshensu and ethyl 3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoate

圖4 顯示丹參主要水溶性化合物丹酚酸B、紫草酸、丹參素和丹參素乙酯自由基清除能力，他們的IC50分別為:5.15、6.40、10.25、9.68 μg/mL。丹酚酸B、紫草酸的自由基清除能力強于丹參素，丹參素被乙酯化后，其自由基清除能力略有增加，差異達到顯著水平(P＜0.01)。

乙酯化后，丹參素的自由基清除能力增加，同時乙酯化后導致丹參素脂水分配系數的改變，使其更容易透過細胞膜進入體內，從而可以明顯增加其口服吸收率。

丹參素是丹參中主要的活性組分之一，雖然其活性低于丹酚酸B，但由于其分子量更小，且更容易被純化，使其化合物的結構修飾成為一個研究熱點。

由于通過化學合成的丹參素是光學混旋體，目前丹參素的大量制備方法仍然以丹參水提取物水解為主。本研究將丹參水提取物的水解和衍生化在一個體系內通過一步反應完成，同時水解催化采用濃硫酸而非堿，水解后的產物進一步酯化得到了丹參素衍生物，從而保證了水解反應進行完全，且反應原料和產物未接觸強堿從而降低了副反應，增加了反應的收率(以丹酚酸B 計算，本反應總收率超過40%)?？梢灶A見，本實驗采用的思路，可以推廣至其他丹參素酯化物的制備，為我們提供了一種簡單、高效、低成本的制備方法。

3 結論

本實驗介紹了一種通過丹參水提物直接制備丹參素乙酯的方法。同已有的報道相比，本研究省略了丹參素制備、純化的過程，直接將丹參水提物水解成丹參素和丹參素的酯化反應合并到一步反應進行，使反應過程變得更加簡單。由于酯化反應具有類似的反應條件，因此丹參素其他酯化衍生物的制備，也可以借鑒本研究使用的方法。

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