籽瓜皮多酚的提取及其抑菌作用研究

劉忠義，彭 麗，包 浩，譚 操，劉文平

湘潭大學化工學院食品與生物工程系，湘潭 411105

籽瓜(Citrullus lanatus ssp.Vulgaris convar.megalaspermus Lin et Chao)系葫蘆科西瓜屬植物，為普通西瓜的栽培變種，原產于非洲，現(xiàn)在我國甘肅等地大量種植，具有較高的營養(yǎng)、保健和經濟價值［1-3］。傳統(tǒng)上，籽瓜常用于取籽，其皮和瓤被大量丟棄，在一定程度上造成了資源的浪費。從自然資源中獲取天然活性成分，已成為當前的研究要點。研究顯示，籽瓜多酚具有一定的抗氧化和抗腫瘤活性，然而籽瓜多酚的其他活性鮮見報道。多酚廣泛分布于植物、水果蔬菜中［4］，具有較高的保健和經濟價值，在醫(yī)藥、食品、日用品等行業(yè)［5］都有很高的利用價值。本文以籽瓜皮為原料，通過超聲波輔助提取多酚，并通過高效液相色譜(HPLC)鑒定籽瓜皮多酚提取物的主要成分，通過微生物培養(yǎng)法探討其抑菌作用，旨在為籽瓜皮、囊的深加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

籽瓜摘自湘潭籽瓜實驗種植基地，選取成熟無破損的籽瓜，清洗干凈，去除綠衣和瓜瓤，將瓜

皮打漿粉碎，于-80 ℃超低溫冰箱中保存，使用前置于4 ℃的冰箱中融解備用。大腸桿菌由湘潭大學微生物實驗室保藏提供。

1.2 藥品與試劑

BHT、乙醇、Na2CO3、FeSO4等均為分析純;沒食子酸標準品(色譜純，批號:MUST-11122813)，成都曼思特生物科技有限公司;福林酚試劑，合肥博美生物科技責任有限公司;氨芐西林，市售。

1.3 儀器與設備

Forma-86ULT 型超低溫冰箱(美國Thermo 公司)，GL21M 高速冷凍離心機(長沙英泰儀器有限公司)，尤尼RE-2000A 型旋轉蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設備儀器有限公司)，WFZ UV-2802SH 型紫外可見分光光度計(上海柯儀器有限公司)，QTR3120 型超聲波清洗機(天津市瑞普電子儀器公司)，XW-80A微型旋渦混合器(上海碩光電子科技有限公司)，BHC-1300ⅡA2 生物安全柜［阿爾泰實驗室設備(北京)有限公司］。

2 實驗方法

2.1 多酚的測定

多酚的測定采用Folin-Ciocalteu 比色法，以沒食子酸作為標準物，參照文獻［6］所介紹的方法，適當改動。分別準確量取0.1 mg/mL 沒食子酸標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于10 mL 比色管中，各加6 mL 水，混合均勻，加入0.5 mL 福林酚試劑，搖勻。3 min 之后，加入200 g/mL 碳酸鈉溶液1.0 mL，超純水定容。30 ℃水浴條件下反應30 min，于740 nm 波長下測定吸光度，所有樣品平行操作三次，建立標準曲線。

2.2 超聲波輔助提取條件確定

按不同的料液比，準確稱取一定量的籽瓜皮漿于燒瓶中，加入不同體積分數(shù)的乙醇，將燒瓶放入超聲波機中，在不同的溫度下提取不同的時間。每次提取后，收集提取液，抽濾，濃縮，按照2.1 所述方法測定其多酚含量。多酚得率按下式計算:

W=m/M

其中，W:多酚提取率，mg/g;M:樣品質量，g;m:籽瓜皮多酚含量，mg。

在單因素實驗的基礎上，設計L9(34)正交實驗，考察提取時間、乙醇濃度、提取溫度、料液比對樣品中多酚提取率的影響，優(yōu)化出超聲波輔助提取多酚的最佳工藝參數(shù)。L9(34)正交實驗因素與水平設計見表1。

表1 L9(34)正交因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

2.3 籽瓜皮多酚主要成分測定

稱取10 mg 沒食子酸標準品，溶于100 mL 容量瓶中，得0.1 mg/mL 沒食子酸標準液，以此標準液配制不同濃度的沒食子酸系列標準液，經液相色譜得到沒食子酸液相色譜圖。籽瓜皮多酚提取物，經離子沉淀法純化及與提取液等體積的乙酸乙酯萃取三次之后，濃縮至1 mL。經0.45 μm 微孔濾膜過濾后進色譜柱，根據(jù)保留時間定性，外標法定量，進行籽瓜皮多酚主要成分分析。色譜柱Inertsil ODS-SP C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:20 μL;檢測器:spd-m20a 光電二極管陣列檢測器;檢測波長:280 nm。流動相:乙腈(A)，質量分數(shù)0.4%甲酸溶液(B);梯度洗脫程序:0～5 min，25%A;5.01～10.00 min，80%A;10.01～15.00 min，10%A，15.01～25.00 min，25%A。

2.4 籽瓜皮多酚的抑菌實驗

籽瓜多酚的大腸桿菌抑菌實驗參照文獻［7］完成。采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。吸取0.1 mL預先培養(yǎng)并制好的菌懸液，加入到約15 mL 未凝固已滅菌的培養(yǎng)基中，震蕩混合均勻，倒入插有牛津杯的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基凝固后，于牛津杯中加入0.2 mL 0.4 mg/mL 的經過乙酸乙酯萃取的籽瓜皮多酚提取液，然后入恒溫箱37 ℃培養(yǎng)48 h。2 mg/mL 氨芐西林做陽性對照，0.9%生理鹽水做陰性對照。

2.5 籽瓜皮多酚最低抑菌濃度測定

采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。在無菌條件下，取無菌試管10 支(15×100 mm)，每管加入液體培養(yǎng)基2 mL，在第1 管加入0.4 mg/mL 籽瓜皮多酚提取液2 mL，連續(xù)倍比稀釋至第8 管，并從第8 管中吸取2 mL 棄去，第9 管為細菌生長對照，第10 管為藥物對照。在每管內加入制備好的菌懸液0.1 mL。接種完畢后，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。肉眼觀察，不發(fā)生混濁變化的最高提取物稀釋倍數(shù)即為該提取物的最低抑菌濃度。

2.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均采用三次平行試驗的平均值，圖用Origin(Pro)7.5 繪制，數(shù)據(jù)間差異用SPSS13.0 進行方差分析和多重比較，結果以平均值±標準偏差表示。

3 結果與分析

3.1 多酚標準曲線

按1.3.1 所述方法，進行測定，利用Origin7.5分析得標準曲線回歸方程為:A=0.01794+91.18452C，R=0.99946。式中:A 為吸光度，C 為濃度，mg/mL。

3.2 不同提取條件對多酚提取率的影響

選用70 mL/100 mL 的乙醇，料液比1∶5，在40℃溫度下超聲波輔助提取，探討不同提取時間對提取率的影響。實驗結果見圖1A。由圖1A 看出:隨著提取時間的增加，多酚提取率增加;然而，提取時間達到40 min 之后，隨著提取時間增加多酚的提取率反而降低。這和橄欖［8］、西蘭花［9］和板栗總苞［10］等多酚提取時所得結果一致。由于酚羥基易被氧化，超過一定提取時間，其某些活性被破壞［11］，故提取時間對多酚提取率的影響存在閾值。

圖1 提取時間(A)、乙醇濃度(B)、提取溫度(C)和料液比(D)對多酚提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time(A)，ethanol concentration(B)，extraction temperature(C)and ratio of solid to liquid(D)on yield of polyphenols

選用料液比1∶5，溫度40 ℃，提取時間40 min，超聲波輔助提取，研究不同乙醇濃度對提率的影響。由圖1B 看出:隨著乙醇濃度的增大，多酚提取率增加;當乙醇濃度超過70 mL/100 mL 之后，多酚的提取率隨乙醇體積濃度增加反而降低。此結果與桑葉多酚的提取實驗結果基本一致［12］，與橄欖［8］、西蘭花［9］和板栗總苞［10］等多酚提取時所呈現(xiàn)的趨勢相同，但最佳乙醇濃度有一定差別。這表明醇濃度對多酚的提取率存在影響，且很可能是由于70 mL/100 mL 的乙醇與籽瓜多酚的極性相近，因而籽瓜多酚在70 mL/100 mL 的乙醇中溶解度較高［13］。

選用料液比1∶5，乙醇濃度70 mL/100 mL，提取時間40 min，超聲波輔助提取，探討不同提取溫度對提率的影響。實驗結果見圖1C。由圖1C 看出:隨著提取溫度數(shù)的增大，多酚提取率增加;當提取溫度超過60 ℃之后，多酚的提取率隨溫度增加而降低。究其原因可能是由于多酚不穩(wěn)定，溫度高時多酚物質分解［14］。由圖1C 還可知，提取溫度對多酚提取率的影響存在閾值，甘薯渣中多酚［14］、西蘭花多酚［9］、板栗總苞多酚［10］提取時最佳溫度分別為80、50、65 ℃。溫度對多酚的提取存在一定影響，但對不同的原料，其多酚種類和含量及其存在狀態(tài)存在差別，故溫度的影響不同，導致最佳提取溫度差別較大。

選用乙醇濃度70 mL/100 mL，溫度60 ℃，提取時間40 min，超聲波輔助提取，探索不同料液比對提取率的影響。實驗結果見圖1D。由圖1D 看出:隨著料液比的增大，多酚提取率增加;當料液比超過1∶10 之后，多酚的提取率隨料液比增加反而降低。一方面由于水的用量過少，有效成分不能很好的溶出，而另一方面水的用量過多，雜質成分含量增多，使多酚相對含量減少［12］。由圖可知，料液比對多酚提取率的影響存在閾值，這一結果與西蘭花多酚［9］、板栗總苞多酚［10］、生姜多酚［14］提取時所得結果相同。但對于不同的原料，最佳的料液比不同，這可能與原料的結構、組成以及含水量有關。

3.3 多酚提取條件的優(yōu)化

正交實驗結果見表2。由表2 直觀觀察，2 號實驗即提取時間為35 min，乙醇濃度為70 mL/100 mL，提取溫度為60 ℃，料液比為1∶10 時，多酚的提取率最高。而根據(jù)K 值分析得出最優(yōu)因素水平組合為A1B2C2D1，即提取時間為35 min，乙醇濃度為70 mL/100 mL，提取溫度為60 ℃，料液比為1∶12。通過極差分析，可以看出料液比對多酚提取率的影響最大、時間次之，溫度的影響較小，乙醇濃度影響最小。最優(yōu)因素水平組合未直接出現(xiàn)在正交表中，故需對最優(yōu)條件進行實驗驗證。

取正交表中2 號實驗的工藝條件和最佳組合工藝條件進行實驗，每組實驗平行3 次，取平均值。2號實驗的提取率為33.21±0.89 mg/g，最佳組合的提取率為38.37±1.02 mg/g。結果表明，優(yōu)化的因素水平組合A1B2C2D1的提取效果優(yōu)于2 號實驗的因素水平組合。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of the orthogonal test

3.4 籽瓜皮多酚主要成分

經測定，HPLC 能夠較好地檢測沒食子酸(見圖2A)，其標準曲線為y=-72522.8+56624.2x，R=0.99674，P＜0.0001，線性關系良好，能夠用于定量分析。且該方法回收率為95.21%，標準偏差為0.55%，說明該方法準確可靠。圖2B 表明，雖然樣品峰有明顯拖尾及尾部凸出，仍然可以確定籽瓜皮多酚的主要成分是沒食子酸。沒食子酸是植物多酚的重要組成成分之一［6，15］，具有優(yōu)越的抗氧化功能及諸多功能性質。

3.5 籽瓜皮多酚的抑菌效果

籽瓜皮多酚的抑菌實驗結果見圖3。結果表明，在接種大腸桿菌菌懸液的培養(yǎng)皿的滴加籽瓜皮多酚提取液的牛津杯周圍形成明顯的抑菌圈(圖3A)，而陰性對照滴加生理鹽水的牛津杯周圍沒有抑菌圈產生(圖3C)，這表明籽瓜皮多酚提取物具備抑制大腸桿菌生長的作用。經測定，0.4 mg/mL 籽瓜皮多酚提取液形成的抑菌圈大小約為12.6±0.3 mm，低于2 mg/mL 氨芐西林溶液產生的36.5±0.4 mm 的抑菌圈(圖3B)。這說明籽瓜皮多酚提取液具有明顯的抑菌效果。由于籽瓜皮多酚提取物的主要成分為沒食子酸，故很容易理解籽瓜皮多酚的抑菌作用。

圖2 沒食子酸標準品(A)及籽瓜皮多酚提取物(B)的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of gallic acid standard(A)and polyphenol extract of seed watermelon peel(B)

圖3 籽瓜多酚(A)、氨芐西林(B)及生理鹽水(C)的抑菌效果Fig.3 Anti-bacterial effect of polyphenol extracts of seed watermelon peel(A)，ampicillin(B)and normal saline(C)

3.6 籽瓜皮多酚的最低抑菌濃度

籽瓜皮多酚的最低抑菌濃度實驗結果見表3。由表3 可知，當籽瓜皮多酚濃度大于0.1 mg/mL，由于受到籽瓜皮多酚的抑制，大腸桿菌不能良好生長，故試管中培養(yǎng)基不出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，當籽瓜皮多酚濃度稀釋至0.05 mg/mL 時，大腸桿菌表現(xiàn)出微弱的生長態(tài)勢，故試管中培養(yǎng)基略微出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，當籽瓜皮多酚濃度繼續(xù)稀釋至0.0125 mg/mL 及以下時，大腸桿菌受到的抑菌程度很微弱，試管中培養(yǎng)基明顯出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。由實驗結果初步推斷籽瓜皮多酚的最低抑菌濃度為0.05 mg/mL。

表3 籽瓜皮多酚提取液的最低抑菌濃度(n=3)Table 3 Minimal inhibitory concentration of polyphenol extract of seed watermelon peel(n=3)

4 討論與結論

超聲波由于誘導空化作用而有助于低溫下提取植物中的有效成分，故超聲波輔助提取在食品相關領域中得到比較廣泛的應用［16］。超聲波輔助提取籽瓜皮多酚有比較好的效果，經過試驗得到籽瓜皮多酚的最佳提取條件為提取時間為40 min，乙醇濃度為70 mL/100 mL，提取溫度為60 ℃，料液比為1∶12。

籽瓜皮多酚提取液的主要成分為沒食子酸，這對進一步研究并理解籽瓜多酚提取液的抗氧化、抗菌等功能性質及其構效關系具有重要的意義。單寧類物質包括單寧(即沒食子酸)、縮合單寧及復合單寧是很多植物中多酚類物質的主要成分［6，15］。沒食子酸具有多個酚羥基，這是其具有優(yōu)異抗氧化功能的結構基礎。

籽瓜皮多酚對大腸桿菌具有明顯抑制作用，其最低抑菌濃度經初步測定為0.05 mg/mL。大腸桿菌是食品中必須檢測的微生物指標，是食品衛(wèi)生的重要指標之一。大腸桿菌經常被用做抑菌研究實驗對象［7］。目前，國內外對天然植物源性防腐劑研究異?；钴S，本研究顯示籽瓜皮多酚有望發(fā)展成為一種天然防腐劑。

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