UPLC-MRM-MS 法測(cè)定頭花蓼藥材中7 個(gè)指標(biāo)成分

劉 躍，胡 杰，謝玉敏，黃 勇，廖尚高，鄭 林

1貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴陽(yáng) 550004

頭花蓼又名四季紅、石莽草等，為蓼科植物頭花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don 的干燥全草或地上部分，在《苗族醫(yī)藥學(xué)》、《中華本草·苗藥卷》、《貴州植物志》、2003 版《貴州省中藥、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中均有收載，現(xiàn)廣泛用于治療泌尿系統(tǒng)感染，泌尿系統(tǒng)結(jié)石，急、慢性尿道炎等泌尿系統(tǒng)疾病［1］。目前，以頭花蓼為原料藥已開(kāi)發(fā)并上市了熱淋清顆粒、寧泌泰膠囊、四季草顆粒等各種單復(fù)方苗藥制劑。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，頭花蓼的化學(xué)成分主要包括揮發(fā)油、黃酮類及酚酸類等化合物［2-6］，其藥理活性研究表明，其內(nèi)含有的酚酸及黃酮類具有一定的抗氧化活性，為頭花蓼的主要藥效成分［7-9］。

2003 版《貴州省中藥、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中僅收錄用高效液相法測(cè)定槲皮素這一單一成分，盡管目前已有不少學(xué)者對(duì)頭花蓼當(dāng)中的沒(méi)食子酸、槲皮苷及槲皮素等成分進(jìn)行了含量測(cè)定［10，11］，以多指標(biāo)成分對(duì)頭花蓼藥材進(jìn)行全面質(zhì)量評(píng)價(jià)尚未報(bào)道?；诖?，本文以沒(méi)食子酸、原兒茶酸、楊梅苷、陸地棉苷、槲皮苷、槲皮素-3-O-(2″-沒(méi)食子?；?-鼠李糖苷、槲皮素及兒茶素這7 個(gè)成分為檢測(cè)指標(biāo)，應(yīng)用專屬性強(qiáng)，靈敏度高，快速準(zhǔn)確的UPLC-MRM-MS 法對(duì)頭花蓼藥材進(jìn)行全面的含量測(cè)定，進(jìn)一步為頭花蓼及其相關(guān)制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)及其資源的綜合開(kāi)發(fā)、利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

葛根素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)0752-9605，純度≥98%)，沒(méi)食子酸(中國(guó)固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，批號(hào)M20-101209，純度≥98%)，原兒茶酸、楊梅苷(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)110306，111018，純度≥98%)，陸地棉苷、槲皮苷、槲皮素-3-O-(2″-沒(méi)食子?；?-鼠李糖苷、槲皮素及兒茶素實(shí)驗(yàn)室自制(采用1H NMR、13C NMR、MS、UV、IR 波譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，用UPLC-PDA 在多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定，其峰面積歸一化結(jié)果均大于98)，甲醇(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)、乙腈(德國(guó)Merck 公司)為色譜純，其余溶劑均為分析純，水為超純水。頭花蓼藥材:共6 批樣品，來(lái)源于貴州施秉頭花蓼GAP 基地及貴州主要產(chǎn)地，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院龍慶德副教授鑒定為蓼科植物頭花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don的干燥全草。

1.2 儀器設(shè)備

ACQUITY 系統(tǒng)超高液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters 公司，包括二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、三重四級(jí)桿質(zhì)譜分析器和Masslynx4.1 質(zhì)譜工作站)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

對(duì)照品溶液:精密稱取沒(méi)食子酸等7 種對(duì)照品適量，分別置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。得沒(méi)食子酸(1.073 mg/mL)、原兒茶酸(0.974 mg/mL)、陸地棉苷(0.690 mg/mL)、槲皮苷(1.020 mg/mL)、兒茶素(0.902 mg/mL)、槲皮素-3-O-(2″-沒(méi)食子?；?-鼠李糖苷(0.540 mg/mL)及槲皮素(1.010 mg/mL)的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取沒(méi)食子酸等七種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇按梯度稀釋成所需濃度，得混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。置冰箱(-20 ℃)保存，備用。

內(nèi)標(biāo)溶液:精密稱取葛根素10.33 mg，用甲醇定容至25 mL，獲得葛根素0.413 mg/mL 的儲(chǔ)備液。取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量至5 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液，置冰箱(-20℃)保存，備用。

2.2 供試品溶液的制備

取本品細(xì)粉約0.5000 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合液25 mL，稱定重量(精確至0.01 g)，置水浴中加熱回流1 h，放冷，稱重，用提取液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液5 mL 至25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱:Waters BEH C18(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)柱，保護(hù)柱:Waters Van Guard BEH C18(2.1 mm×5 mm，1.7 μm);流速:0.35 mL/min;柱溫:45 ℃;進(jìn)樣體積為1 μL;流動(dòng)相:0.1% 甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B);梯度洗脫程序如下:0～1.5 min，5%～30%(A);1.5～3 min，30%～90%;3～4 min，90%;4～5 min，90%～5%。

2.4 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離源(ESI)，毛細(xì)管電離電壓3 kV，離子源溫度120 ℃;去溶劑氣N2，流速650 L/h，去溶劑氣溫度350 ℃;碰撞氣Ar，流速0.16 mL/min。掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)，監(jiān)測(cè)離子見(jiàn)表2。

表1 多反應(yīng)離子檢測(cè)質(zhì)譜條件Table 1 MRM analysis parameters for the 7 targeted compounds

注:分析物1～7 分別為沒(méi)食子酸、原兒茶酸、陸地棉苷、槲皮苷、兒茶素、槲皮素-3-O-(2″-沒(méi)食子?；?-鼠李糖苷及槲皮素.Note:Analyte 1-7 are gallic acid，protocatechuic acid，que-3-O-β-D-Glc，quercitrin，catechin，que-3-O-(2″-O-galloyl)-β-D-Glc and quercetin，respectively.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 專屬性試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液適量并分別加入內(nèi)標(biāo)(葛根素)溶液，15000 rpm 離心5 min，取上清液分別進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此結(jié)果可看出成分間分離良好，未見(jiàn)雜質(zhì)干擾，供試品溶液中被測(cè)成分與7 個(gè)對(duì)照品的保留時(shí)間相同，通過(guò)比較被測(cè)定成分和對(duì)照品的母離子、子離子質(zhì)譜圖，兩者一致，表明本法專屬性良好。

圖1 混合對(duì)照品溶液(A)和供試品溶液(B)的UPLC-MRM-MS 圖譜Fig.1 UPLC-MRM-MS chromatogram of reference substances (A)and sample (B)

3.2 線性試驗(yàn)

精密吸取“2.1”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液適量，依次稀釋，制得6 個(gè)濃度的系列濃度線性工作液，分別進(jìn)樣測(cè)定。以待測(cè)物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(A/Ai)為縱坐標(biāo)Y，各物質(zhì)濃度(C)為橫坐標(biāo)X 進(jìn)行直線回歸，權(quán)重系數(shù)為1/X，求得直線方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程見(jiàn)表2。

表2 7 種成分的線性關(guān)系Table 2 Linear relationships of 7 components

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批次頭花蓼藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在UPLC-MRM-MS 條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算沒(méi)食子酸、原兒茶酸、陸地棉苷、槲皮苷、兒茶素、槲皮素-3-O-(2″-沒(méi)食子?；?-鼠李糖苷及槲皮素的平均含量分別為1.276、0.179、0.041、1.326、0.069、0.061 及2.681 mg/g，RSD 分別為1.07%、3.58%、1.43%、2.23%、2.62%、2.62%及2.59%，結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。

3.4 精密度試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，在相同條件下連續(xù)測(cè)定3 d，每天進(jìn)樣6 次，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果7 種成分的日內(nèi)和日間精密度(n=6)分別為0.92%～3.49%和1.21～4.41%，表明儀器精密度良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別處理后于0、2、4、8、12、18、24 h 進(jìn)樣分析，7 種成分的RSD 分別為1.03%、2.66%、1.83%、0.93%、2.95%、2.73%、3.23%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取6 份已知含量的頭花蓼樣品0.5000 g，平均分為3 組，分別精密加入0.5、1.0、2.0 mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液［沒(méi)食子酸、原兒茶酸、陸地棉苷、槲皮苷、兒茶素、槲皮素-3-O-(2″-沒(méi)食子?；?-鼠李糖苷及槲皮素濃度分別為0.407、0.092、0.065、0.228、0.256、0.051、0.383 μg/mL］，制成低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果低、中、高濃度水平下原兒茶酸等7 種成分回收率分別為93.22%～100.32%、95.37%～102.68%、97.37%～102.11%、94.89%～103.35%、91.23%～104.35%、95.54%～ 103.12%、93.83%～105.33%。

3.7 樣品測(cè)定

按“2.2”項(xiàng)下方法制備6 批樣品的供試品溶液，處理后分別進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 6 批樣品中7 個(gè)成分的含量(mg/g，n=3)Table 3 Determination of 7 components in six batches of P.capitatum sample (mg/g，n=3)

4 討論

2010年版《中國(guó)藥典》中對(duì)熱淋清顆粒的質(zhì)量控制方法僅以沒(méi)食子酸為指標(biāo)［12］，然而不同批次間沒(méi)食子酸含量略有差異，因此建立一種靈敏、快速、可靠的的定量分析方法以同時(shí)測(cè)定頭花蓼藥材中主要活性成分的含量是極其有必要的。

本研究采用UPLC-MRM-MS 系統(tǒng)建立了頭花蓼藥材中七個(gè)指標(biāo)成分靈敏、快速、可靠的定量分析方法，5 min 即完成樣品的分析，顯著提高了定量分析的重復(fù)性和可靠性。從表4 的6 批頭花蓼藥材含量測(cè)定結(jié)果可看出原兒茶酸，陸地棉苷在不同批次藥材中含量較穩(wěn)定，但含量較低，沒(méi)食子酸、槲皮苷、槲皮素含量較高，6 批藥材槲皮素的含量均符合2003版《貴州省中藥、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》。經(jīng)對(duì)不同產(chǎn)地的頭花蓼中7 種化學(xué)成分含量測(cè)定，表明本方法能達(dá)到有效分離各組分的目的，可作為頭花蓼的質(zhì)量控制方法;同時(shí)表明不同地域的頭花蓼中3 種成分的含量存在明顯差異，說(shuō)明生態(tài)環(huán)境、采收時(shí)間和儲(chǔ)存條件等可能對(duì)含量產(chǎn)生影響。上述結(jié)果提示，為保證頭花蓼相關(guān)制劑批次間質(zhì)量的一致性，應(yīng)加強(qiáng)頭花蓼的質(zhì)量控制，必要時(shí)固定藥材的來(lái)源。

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