C18 硅膠制備荔枝果皮原花青素低聚體的組成分析及單體分離

李書藝，吳 茜，隋 勇，孫智達*

1武漢輕工大學食品科學與工程學院，武漢 430023;2華中農業(yè)大學食品科學技術學院 環(huán)境食品學教育部重點實驗室，武漢 430070

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)，為無患子科常綠喬木，也是我國南方重要的水果農作物。研究表明，除了味美可口的果肉，荔枝的花、果皮和果核均具有抗氧化活性［1-3］;特別是荔枝果皮，其色澤鮮艷，占果實鮮重15%，產量頗為豐富。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［4，5］，荔枝果皮經(jīng)過醇提、濃縮、AB-8 大孔樹脂富集和乙酸乙酯萃取后可得到純度較高的原花青素低聚 體 (Litchi pericarp oligomeric procyanidins，LPOPC)。LPOPC 中同時含有A-和B-型原花青素，延伸單元和末端單元為表兒茶素，通過4→8，2→O→7 或4→6，4→8 連接而成，以A-型原花青素低聚體為主［2］。然而，當利用上述純化方法結合Toyopearl 柱層析分級制備典型的A-型原花青素二聚體{表兒茶素-(4β→8，2β→O→7)-表兒茶素}和三聚體{表兒茶素-(4β→8，2β→O→7)-表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素}時，周期較長，費時費力。且提取物中含有的少量B-型原花青素與同等聚合度的A-型原花青素相比，僅單元連接鍵之間少了一個C-O-C鍵，分子量差距為2，難以通過凝膠色譜分離。為此，本文將對原有的純化方法進行優(yōu)化改進:用C18硅膠柱材料替代原來的AB-8 大孔樹脂純化，甲醇洗脫取代乙醇洗脫分離，其他步驟仍保持不變。這樣，既可使A-和B-型原花青素達到完全分離的目的，又可快速制備純度更高、聚合度更低的A-型原花青素低聚體。在此基礎上，通過等輻射分析法(即Isobologram 法)評價了所得A-型原花青素二聚體和三聚體的協(xié)同抗氧化能力，對探究原花青素的結構與抗氧化活性之間的構效關系具有特殊意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

荔枝品種為妃子笑(Litchi chinensis Sonn.cv.Feizixiao)，2012年6 月采自廣州。選取色澤鮮艷，果形勻稱，未受機械損傷的果實，取其皮于-20℃下保存。

1.2 主要試劑與儀器

試劑:(-)-表兒茶素、(+)-兒茶素、DPPH(美國Sigma 公司);福林酚試劑(美國Sigma 公司分裝);甲醇，乙腈(色譜純，美國Fisher 公司);High Techsil-C18 硅膠填料(蘇州匯通色譜分離純化有限公司分裝);Toyopearl HW-40s 凝膠填料(日本Tosoh 公司);其他化學試劑(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。儀器:UV-2100 型紫外可見分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司);LC-MSn1100 series 液質聯(lián)用儀(美國Agilent 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 荔枝果皮原花青素粗提物的制備

稱取100±0.5 g 粉碎后的荔枝果皮，在70%的乙醇溶液中(料液比1∶15，W/V)50 ℃水浴避光浸提90 min。提取結束后抽濾除去殼渣，濾液于旋轉蒸發(fā)儀內40 ℃減壓回收乙醇，殘留的水溶液為荔枝果皮原花青素的粗提物。

1.3.2 荔枝果皮原花青素的純化

將上述粗提液100 mL 用滴管緩慢加入C18 硅膠層析柱(3 ×2.5 cm，5 μm)中，給予泵壓力，控制洗脫液流速約50 mL/min。待吸附完全后，采用5倍柱體積的蒸餾水和等體積的90%甲醇分步洗脫處理，前者以去可溶性糖和其它小分子化合物，后者通過下接錐形瓶予以收集。然后，40 ℃減壓旋蒸除去收集液中的甲醇，余下水溶液用3 倍體積乙酸乙酯萃取。再合并有機相，旋蒸除去有機溶劑，殘留液復溶于蒸餾水后冷凍干燥即為優(yōu)化制備的荔枝果皮原花青素低聚體(以下簡稱LPOPC)。

1.3.3 LPOPC 總酚含量的測定

1.3.3.1 標準曲線繪制

采用Folin-Ciocalteu 法測定上述LPOPC 中的總酚含量［6］。以沒食子酸溶液為標準品繪制標準曲線:分別取濃度為0、0.05、0.1、0.125、0.25、0.5 mg/mL 的標準溶液0.1 mL 加至6 mL 蒸餾水中，混合后加入1 mL 福林酚試劑，均勻混合30 s 后靜置8 min，然后加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液，定容至10 mL。室溫下避光放置2 h 后，765 nm 下比色。以標準溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y=0.0013X +0.0189，R2=0.9909。

1.3.3.2 樣品測定

配制0.3 mg/mL 樣品溶液，按標曲制作步驟進行操作，根據(jù)標曲回歸方程計算出樣品中的總酚含量(mg/g)，平行操作三次，取平均值。

1.3.4 LPOPC 的低聚體組成成分分析

取一定量凍干樣品溶于甲醇配成0.5 mg/mL溶液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后進行組分分析。使用Agilent 1100 Series LC/MSD Trap 液質聯(lián)用儀，配有二元梯度泵，二極管陣列(DAD)檢測器，柱溫箱和自動進樣器。

色譜條件:色譜柱為VP-ODS C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);柱溫28 ℃;流動相:A 為0.4%的醋酸水溶液，B 為乙腈;洗脫梯度:0～40 min，5%～35% B;40～45 min，35%～50% B;45～50 min，50%～80% B;50～55 min，80%～5% B，然后柱平衡10 min;流速1 mL/min;檢測波長280 nm;進樣量20 μL。

質譜條件:離子源，電噴霧(ESI);壓力，30 psi;干燥氣，N2;載氣溫度，325 ℃;載氣流速，12 mL/min;監(jiān)測模式，MRM，負離子模式;離子掃描范圍，100～1200 m/z;關注分子量，500 m/z;同步進行二級破碎。

1.3.5 LPOPC 平均聚合度的計算

根據(jù)LPOPC 中主要低聚體的聚合度和其相對含量，可推算出LPOPC 的近似平均聚合度，公式如下:

式中:ACatechin為兒茶素的百分含量(%);AEpicatechin為表兒茶素的百分含量(%);A2為原花青素二聚體的百分含量(%);A3為原花青素三聚體的百分含量(%);A4為原花青素四聚體的百分含量(%)。

1.3.6 A-型原花青素二聚體和三聚體的制備

采用Toyopearl HW-40s 凝膠柱(200 mm ×16 mm，30 μm，適用分子量范圍100～1000)，對C18 純化工藝所得的LPOPC 進行了分級。將100 mg LPOPC 溶于3 mL 甲醇中，上樣前先經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾。洗脫液為甲醇，流速為0.8 mL/min，上樣后每6 min 收集一管。洗脫液經(jīng)紫外檢測儀280 nm 處比色后將吸光度值記錄在對應的儀器上。合并相同出峰位置的試管，減壓除去甲醇，冷凍干燥，得到不同聚合度的黃烷醇組分［7］。對各組分進行質譜解析確定其種類后(方法同1.3.4)，可通過歸一化法計算目標化合物的純度。

1.3.7 Isobologram 法分析A-型原花青素二聚體、三聚體的相互作用

1.3.7.1 二聚體、三聚體清除DPPH 自由基的能力

DPPH·是一種穩(wěn)定的大分子自由基，在乙醇中呈紫色。當抗氧化劑與DPPH·反應時，紫色逐漸消失，通過測定吸光值可計算清除率。清除率反映了抗氧化劑對DPPH·的清除能力，通常表示為半數(shù)抑制率濃度IC50，即清除率為50%時抗氧化劑的濃度。IC50值越小，提取物清除自由基的能力越強［8］。

準確配制1 mg/mL 上述A-型原花青素二聚體和三聚體水溶液，將母液分別稀釋10 倍和100 倍得到100 μg/mL 和10 μg/mL 樣品溶液。再取不同體積樣液定容至2 mL，加入DPPH 乙醇溶液后，混勻，在室溫下避光反應30 min，于515 nm 處比色?？瞻捉M以等體積無水乙醇代替DPPH·，對照組以等體積蒸餾水代替樣品，平行測定3 次，計算公式如下:

式中:A0為對照組吸光值;Ai為樣品組吸光值;Aj為空白組吸光值。

1.3.7.2 二聚體、三聚體復配物清除DPPH 自由基的能力

選擇3 組濃度，即將A-型原花青素二聚體和三聚體的濃度比固定為1∶4、1∶1.5、1∶0.5，且每組確定固定比例濃度設計使各自計算出的清除率在10%～100%范圍內均勻分布。化合物按固定比例混合后，以1.3.7.1 的方法測定復合抗氧化劑對DPPH·的清除作用，計算復配組的IC50值。

1.3.7.3 構建二聚體、三聚體復配后的Isobologram分析圖

等輻射分析法(Isobologram)常用于研究藥物相互作用，選取兩種能產生類似效應的藥物，用等輻射圖分析之間的相互作用［9］。將DPPH·清除實驗中得到的二聚體IC50值和95%可信限標繪在橫軸上，三聚體的IC50值和95%可信限標繪在縱軸上，連接橫縱軸兩IC50值構成相加線，連接兩可信限構成相加線95%可信限。如果復配組的效應點落在相加線上或可信限內，則表示兩種抗氧化劑的相互作用為相加，如果落在相加線及可信限下方則表示相互作用為協(xié)同作用，如果落在相加線及可信限上方則表示相互作用為拮抗作用［10］。

2 結果與討論

2.1 荔枝果皮原花青素低聚體LPOPC 的組成分析

Folin-Ciocalteu 法測定的結果顯示，C18 硅膠替代AB-8 大孔樹脂純化荔枝果皮原花青素提取物后，所制得的LPOPC 中總酚含量顯著提升，達到940±123 mg/g［4］。表明此法確實可以達到優(yōu)化提取的效果，故通過HPLC 和LC-MS 聯(lián)合對LPOPC 的組成成分進行了進一步的驗證和分析。

圖1 為LPOPC 在波長280 nm 處的液相色譜圖，從圖中不難看出，提取物主要由12 個不同極性的組分構成。表1 中羅列了幾種A-和B-型原花青素低聚體的典型結構碎片信息，可作為對LPOPC 中各組分結構解析的依據(jù)。如表1 所示，(+)-兒茶素和(-)-表兒茶素的分子離子［M-H］-為289 m/z，結合標準品的保留時間信息，分別對應為圖1 中的峰1、峰2。B-型原花青素二聚體，分子離子［M-H］-為577 m/z，對應二級碎片451、425、407 和289 m/z，通過雜環(huán)裂解脫去間苯三酚(heterocyclic ring fission，HRF)、逆狄爾斯-阿德耳(retro-Diels-Alder，RDA)或同時脫水、醌甲基裂解(quinone methide，QM)類黃酮連接鍵等反應產生［11］，故可同時存在多種同分異構體。而A-型原花青素二聚體與B-型原花青素二聚體相比，因連接單元之間增加了一個C-O-C 醚鍵，分子量少2，故［M-H］-為575 m/z［12］;相應的，當發(fā)生以上相同的裂解反應時，分別產生質荷比449、423、289 和285 m/z 的二級碎片［13，14］。A-和B-型三聚體的碎片斷裂方式同二聚體類似，不同的是A-型原花青素三聚體的裂解通常發(fā)生在沒有C-O-C 酯鍵連接的兩個單元之間，m/z 711 和693 為其RDA碎片，m/z 573 和289 為QM 裂解產生?；谝陨辖Y構特征，結合LC-MS 分析的結果可知，LPOPC 的每個組分中同時包含了一種或多種黃烷醇化合物(表2)。其中，共鑒定出9 種A-型二聚體、4 種A-型三聚體和2 種B-型二聚體(表2)。

以色譜圖中該組分的峰面積表示其所占的比例，以對應質譜圖中各物質的相對豐度表示該物質在該組分中的相對含量，可以對LPOPC 中各黃烷醇類物質的種類和分布進行初步表征(表2)。經(jīng)過比對和計算發(fā)現(xiàn)，C18 硅膠制備的LPOPC 中黃烷醇類物質的含量高達93.12%，其中A-型原花青素約占41.98%，而B-型僅占2.31%，主要由A-型二聚體、三聚體和B-型二聚體組成。(-)-表兒茶素、A-型二聚體和三聚體的相對含量分別為44.86%、36.02%和9.86%。與AB-8 純化法相比較，前者純化產物中(-)-表兒茶素含量遠高于后者，提取物中B-型原花青素的含量顯著降低。這是因為C18 柱材料為疏水性最強的硅膠基體吸附劑，對非極性的化合物具有極好的強保留效果［15］。A-型原花青素相對于B-型而言極性更弱，與C18 表面會結合得更為緊密，故洗脫時較晚被分離。加上實驗操作中吸附洗脫的過程應用的是反相色譜分離的原理，只要控制好實驗條件，就可以達到除去B-型，富集A-型原花青素的目的。同時，根據(jù)公式(1)，可計算得到LPOPC 中原花青素的近似平均聚合度僅為1.62。由此證明，使用C18 純化工藝雖然增加了實驗操作的價格成本，但在科學研究中，可以用來快速地制備聚合度更低、組分更簡單的A-型原花青素低聚體，同時也可近乎完全地避免B-型化合物對分級制備帶來的不利影響。

圖1 荔枝果皮原花青素低聚體LPOPC 的RP-HPLC 圖Fig.1 RP-HPLC chromatogram of litchi pericarp oligomeric procyanidins (LPOPC)

表1 A-和B-型原花青素低聚體的典型結構碎片Table 1 Typical structure fragments of A-and B-type procyanidin oligomers

表2 LPOPC 的組成成分分析(LC-MS 法)Table 2 Composition of LPOPC by LC-MS analysis

注:“Cat”為(+)-兒茶素，“Epi”為(-)-表兒茶素，“A-2”、“A-3”和“B-2”分別表示A-型原花青素二聚體、三聚體和B-型原花青素二聚體。Note:“Cat”and“Epi”were the abbreviations of (+)-catechin and (-)-epicatechin;“A-2”，”A-3”and“B-2”represented A-type procyanidin dimer，A-type procyanidin trimer and B-type procyanidin dimer，respectively.

2.2 荔枝果皮中A-型原花青素二聚體和三聚體的制備

利用C18 純化的LPOPC 制備A-型原花青素二聚體和三聚體。經(jīng)過凝膠色譜分級后，LPOPC 混合物被分成了7 個組分，如圖2 所示。樣品收集從出峰處開始，合并后進行HPLC 和LC-MS 分析。通過與原樣的比對，確定后出峰的5 個組分，即圖中標注的F3～F7 為LPOPC 中的主要黃烷醇類物質。經(jīng)質譜鑒定和色譜歸一化分析(色譜圖均未顯示):F3 為(-)-表兒茶素，純度90%;F4 為(+)-兒茶素，純度92%;F6 為原花青素A2，表兒茶素-(4β→8，2β→O→7)-表兒茶素，純度93%;F7 為原花青素A-型三聚體，表兒茶素-(4β→8，2β→O→7)-表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素，純度85%。F5 為一種未知的A-型原花青素二聚體，純度82%。由于在本實驗條件下無法得到足夠量高純度的該化合物，故沒有對它們進行進一步的結構鑒定。多次重復上樣和富集后，回收有機溶劑甲醇，可得到足量的上述已知結構的A-型原花青素二聚體和三聚體化合物，以進行后續(xù)實驗和分析。

圖2 LPOPC 經(jīng)Toyopearl HW-40 s 的分級洗脫圖譜Fig.2 Elution profile of LPOPC applied to Toyopearl HW-40 s column

2.3 A-型原花青素二聚體和三聚體的抗氧化相互作用

根據(jù)公式(2)可計算A-型原花青素二聚體和三聚體對DPPH 自由基的清除率。數(shù)據(jù)顯示，以上二者均具有較強的DPPH·清除能力，且在一定范圍內，隨著濃度的增加，清除率逐漸上升，最大時分別達到87.7%和86.7%，半數(shù)抑制率濃度IC50值依次為9.34 和12.04 μg/mL。以A-型二聚體和三聚體清除自由基的IC50值為依據(jù)，將兩者按幾組固定比例混合進行復配實驗，包括兩種抗氧化劑效強含量相當及兩種抗氧化劑分別占主導地位的情況，即選擇3 組固定濃度比，分別使其抗氧化效應能力表現(xiàn)為1∶3、1∶1、3∶1，以確定新的量效曲線和IC50值，從而進行統(tǒng)計學分析。由于二聚體和三聚體的IC50比值為1∶1.4，因此近似選定二聚體和三聚體的復配濃度比為1∶4、1∶1.5 和1∶0.5。再將三種固定濃度比例各設計6 組濃度梯度，分別測定不同比例的復配物對DPPH·的清除率，計算相應的IC50值，結果如表3 所示。

在表3 中，每組濃度梯度的復配物對DPPH·的清除率均勻地分布在10%～100%以內。二聚體和三聚體以1∶4、1∶1.5 和1∶0.5 復配后的IC50，mix值分別為10.15、11.01 和10.19 μg/mL，數(shù)據(jù)結果符合分析要求，故可利用Isobologram 分析法確定二者之間的相互作用類型。根據(jù)1.3.7.3 中描述的方法構建Isobologram 分析圖(圖3)，橫縱坐標分別表示三聚體和三聚體的反應濃度。當二聚體與三聚體的濃度比為1∶4 時，IC50，A-2值為2.03 μg/mL，IC50，A-3為8.12 μg/mL;濃度比為1∶1.5 時，IC50，A-2值為4.36 μg/mL，IC50，A-3為6.65 μg/mL;濃度比為1∶0.5 時，IC50，A-2值為6.55 μg/mL，IC50，A-3為3.34 μg/mL(表3)。不難看出，三個效應點均落在相加線和95%可信限下方，表明A-型原花青素二聚體和三聚體復配后具有顯著的協(xié)同抗氧化作用。

研究A-型原花青素二聚體和三聚體的協(xié)同抗氧化作用，一方面可以證明抗氧化活性與酚類化合物的羥基數(shù)目之間的關系:即羥基數(shù)量越多，抗氧化能力越強;另一方面，可以協(xié)助我們了解荔枝果皮A-型原花青素混合物是如何發(fā)揮抗氧化作用的。實驗結果證明，三聚體的抗氧化活性雖僅略高于二聚體，但二聚體和三聚體之間卻存在著顯著的協(xié)同抗氧化關系，提示LPOPC 的高活性極有可能來源于不同聚合度原花青素的相互作用［16，17］。同時，我們還可能利用這種協(xié)同效應重組得到一種抗氧化活性遠高于原提取物的復配物。在此，Isobologram 分析法為新型復合抗氧化劑的開發(fā)提供了重要參考依據(jù)［18］。

表3 A-型原花青素二聚體和三聚體復配后清除DPPH·的能力Table 3 DPPH radical scavenging activities of A-type procyanidin dimer and trimer mixture

圖3 二聚體和三聚體復配的Isobologram 分析圖Fig.3 Isobologram analysis graph of interaction with procyanidin dimer and trimer

3 結論

本文在傳統(tǒng)AB-8 分離純化荔枝原花青素的基礎上，通過C18 硅膠柱層析優(yōu)化制備了聚合度更低、A-型原花青素純度更高的荔枝果皮原花青素低聚體(LPOPC)。組分分析結果顯示，C18 硅膠制備的LPOPC 中總酚含量達到940±123 mg/g，且B-型原花青素近乎完全地被分離。其中，(-)-表兒茶素、A-型原花青素二聚體和三聚體為提取物中最主要的單體和低聚體，相對含量分別為44.86%、36.02%和9.86%;提取物平均聚合度為1.62。因此，可高效利用C18 制備的LPOPC 通過凝膠色譜分級獲得已知結構的A-型原花青素二聚體和三聚體?？寡趸u價結果顯示，A-型原花青素二聚體和三聚體均具有較強的自由基清除能力;等輻射分析法證明兩者之間呈現(xiàn)一定的協(xié)同抗氧化效應，為新型復合抗氧化劑的開發(fā)提供了新的研究思路。

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