早期妊娠自然流產(chǎn)的絨毛細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析156例

潘觀玉

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院胎兒醫(yī)學(xué)科，廣東廣州510630)

自然妊娠流產(chǎn)是一種常見(jiàn)的婦科疾病，其發(fā)病率約占臨床妊娠的10～20%［1］，并且主要發(fā)生于妊娠早期(孕前3個(gè)月左右)。自然流產(chǎn)的原因包含多種因素的影響，例如遺傳、環(huán)境、免疫、內(nèi)分泌、感染等原因，甚至其他未知因素等［2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有一半以上的流產(chǎn)胚胎存在不同程度的染色體異常［3］。因此，遺傳因素特別是染色體異常，被認(rèn)為是最主要的自然流產(chǎn)誘發(fā)因素［4］。所以對(duì)自然妊娠流產(chǎn)患者的絨毛樣本進(jìn)行染色體核型分析，不僅對(duì)于明確流產(chǎn)原因，減輕患者的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)非常重要，對(duì)今后開展優(yōu)生優(yōu)育也具有很好的理論依據(jù)和相關(guān)的政策指導(dǎo)方針。本研究針對(duì)156例自然流產(chǎn)患者的絨毛細(xì)胞培養(yǎng)后染色體核型分析，了解染色體異常的相關(guān)情況。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2012年3月至2014年4月于華僑醫(yī)院婦產(chǎn)科門診的自然流產(chǎn)患者，孕周5～16周，其中5～10周112例，11～16周44例。平均孕婦年齡20～41歲，平均(28±1)歲。B超提示胎兒停止發(fā)育(無(wú)心管搏動(dòng)等)。排除孕期感染及有害物質(zhì)接觸史。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集和絨毛細(xì)胞培養(yǎng) 行清宮手術(shù)過(guò)程中，無(wú)菌抽取絨毛組織約5～15 mg，置于生理鹽水中洗滌，以去除影響細(xì)胞貼壁的血凝塊和其他非絨毛組織。隨后在倒置顯微鏡下挑選絨毛組織，并用滅菌的眼科剪將其剪碎成糊狀，將組織懸液移入離心管中 1 500 r/min 10 min，棄去上清液后，加入0.25%的胰酶及500 U/mLⅡ型膠原酶2 mL，吹打混勻。再加入相應(yīng)體積的血清終止消化，離心棄上清，加入 10 mL AmnioMax－Ⅱ培養(yǎng)基(GIBCO)，混勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 絨毛細(xì)胞培養(yǎng)和染色體制備 細(xì)胞培養(yǎng)5～7 d后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)是否貼壁、良好。待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛且多見(jiàn)梭形細(xì)胞克隆后進(jìn)行換液和傳代，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d。待細(xì)胞密度適中時(shí)，加入50μg/mL秋水仙素1滴后，阻斷細(xì)胞周期于中期，繼續(xù)培養(yǎng)40～60 min后收集細(xì)胞，并制備染色體玻片行常規(guī)G顯帶。

1.2.3 G顯帶染色體核型分析 每例樣本于油鏡下計(jì)數(shù)30個(gè)核型(鑲嵌體則計(jì)數(shù)100個(gè)核型)，分析5個(gè)核型。染色體畸變的鑒別及核型描述參照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制2009版》。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，計(jì)數(shù)資料用率表示，兩組間的比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)結(jié)果

在156例絨毛組織標(biāo)本中，細(xì)胞培養(yǎng)成功共147例，占總標(biāo)本數(shù)的94.2%。細(xì)胞培養(yǎng)失敗共計(jì)9例(5.8%)，其中3例因絨毛組織取樣前已經(jīng)壞死，細(xì)胞無(wú)法培養(yǎng)貼壁;另外6例細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)污染。

2.2 自然流產(chǎn)絨毛的染色體異常核型分析及分類

147例成功培養(yǎng)的絨毛組織中共檢出異常核型67例，染色體異常率為45.5%(67/147)。染色體異常主要為三體型，共檢出62例，占異常核型的92.54%(62/67)。其中 21－三體(圖 1A)32例，占異常核型的47.76%(32/67);18－三體(圖1B)9例，占異常核型的13.43%(9/67);16－三體5例，占異常核型的7.46%(5/67);13－三體5例，占異常核型的7.46%(5/67);47，XXY 1例，占異常核型的1.49%(1/67);47，XY，+22 4例，占異常核型的5.97%(4/67);47，XX，+21/46，XX 3 例，占異常核型的 4.48%(3/67);47，XX+8/46，XX 3 例，占異常核型的 4.48%(3/67);48，XY，+7，+14 2 例，占異常核型的2.99%(2/67);45，X 2例，占異常核型的2.99%(2/67);69，XXX(Y)/46，XX 1 例，占異常核型的1.49%(1/67)，見(jiàn)表1。

圖1 染色體異常的核型分析

表1 67例自然流產(chǎn)絨毛染色體異常核型結(jié)果與分類

2.3 流產(chǎn)次數(shù)與染色體異常核型的關(guān)系

在78例反復(fù)流產(chǎn)(≥2次)的患者中，絨毛細(xì)胞樣本染色體核型異常者有45例，占總異常核型病例的57.7%(45/78)。69例單一流產(chǎn)患者中絨毛細(xì)胞樣本染色體核型異常者22例，占總異常核型病例的31.9%(22/69)。經(jīng)χ2分析，反復(fù)流產(chǎn)患者染色體核型的異常發(fā)生率顯著高于單一流產(chǎn)患者(χ2=1.26，P=0.013)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表 2。

表2 流產(chǎn)次數(shù)與染色體異常核型之間的關(guān)系

2.4 自然流產(chǎn)患者胚胎性別和染色體異常核型的關(guān)系

在147例自然流產(chǎn)患者的胚胎中，女性胚胎89例，占總流產(chǎn)患者的60.5%(89/147)，男性胚胎58例，占總流產(chǎn)患者的39.5%(58/147)。女性胚胎中染色體異常核型48例(48.9%，48/89)，男性胚胎19例(32.8%，19/58)。經(jīng)χ2統(tǒng)計(jì)在自然流產(chǎn)胚胎的女性胚胎染色體異常核型的發(fā)生率顯著高于男性胚胎(χ2=1.89，P=0.035)，見(jiàn)表 3。

表3 自然流產(chǎn)胚胎性別與染色體異常核型之間的關(guān)系

2.5 自然流產(chǎn)患者的孕周數(shù)與染色體異常核型的關(guān)系

在147例自然流產(chǎn)患者的胚胎中，早期流產(chǎn)患者(孕周＜12 w)95例，占總流產(chǎn)患者的64.6%(105/147)，晚期流產(chǎn)患者(孕周≥12 w)52例，占總流產(chǎn)患者的35.4%(42/147)。早期流產(chǎn)患者染色體核型異常有51例(53.7%，51/95)，晚期流產(chǎn)患者16例(30.8%，16/52)。經(jīng) χ2統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，早期流產(chǎn)患者中，染色體核型的異常發(fā)生率明顯高于晚期流產(chǎn)患者(χ2=2.33，P=0.05)，見(jiàn)表 4。

表4 自然流產(chǎn)患者的孕周數(shù)與染色體異常核型的關(guān)系

3 討論

在臨床中大概有10%～20%的妊娠者會(huì)發(fā)生自然流產(chǎn)的現(xiàn)象，不僅給患者帶來(lái)了較為嚴(yán)重的心理和精神創(chuàng)傷，同時(shí)也對(duì)整個(gè)家庭造成了極大的痛苦和相當(dāng)?shù)慕?jīng)濟(jì)壓力。因此，自然流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制研究一直是醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，約有一半以上的自然流產(chǎn)是由染色體核型異常所導(dǎo)致的［5－6］。因此，對(duì)自然流產(chǎn)胎兒進(jìn)行染色體核型分析，不僅可以對(duì)臨床上流產(chǎn)的問(wèn)題進(jìn)行調(diào)查分析，減輕患者的心理和精神分析，還可以有效指導(dǎo)下一次的受孕。絨毛組織是受精卵在發(fā)育過(guò)程中所形成的重要附屬物，與胚胎細(xì)胞一樣具有相同的生物遺傳學(xué)特性，因此被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷［7－8］。本研究針對(duì)自然流產(chǎn)患者的絨毛進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后并行染色體核型分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在147例自然流產(chǎn)的胎兒絨毛組織中，染色體異常核型共67例，檢出率為45.5%。這一結(jié)果也于文獻(xiàn)報(bào)道一致，說(shuō)明胚胎的染色體異常是導(dǎo)致自然流產(chǎn)的主要原因之一［9］。

染色體異常主要分為染色體數(shù)目異常和染色體結(jié)構(gòu)異常兩類。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在自然流產(chǎn)的胎兒中染色體異常96%為數(shù)目異常，結(jié)構(gòu)異常僅為4%～5%［10］。非整倍體異常是自然流產(chǎn)胚胎中染色體異常的主要因素，約占染色體異常胚胎的80%以上。在本研究所收集的67例染色體異常的流產(chǎn)胚胎中發(fā)現(xiàn)，幾乎都為數(shù)目異常，這可能也與收集的樣本數(shù)量有限具有一定的關(guān)系。本研究中發(fā)現(xiàn)的非整倍體的比例為:21三體32例(占異常核型的47.76%)、18三體9例(占13.43%)、16三體和13三體各5例(占7.46%)、22三體4例(占5.97%)、8三體和21三體(嵌合體)各3例(占4.48%)、7/14復(fù)合三體和X單體各2例(占2.99%)。根據(jù)以往報(bào)道發(fā)現(xiàn)，三體型出現(xiàn)頻率最高的染色體是 21、16、18、13、22號(hào)，本研究的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符［11－12］。這些結(jié)果說(shuō)明胚胎的染色體異常是自然流產(chǎn)的主要因素，其不僅以非整倍體的為主要表現(xiàn)形式，而且具體的類型比較集中，數(shù)目異常明顯多于結(jié)構(gòu)異常。這一趨勢(shì)將為臨床診斷和相關(guān)領(lǐng)域的研究提供可靠的數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)次數(shù)、流產(chǎn)胎兒的性別以及自然流產(chǎn)患者的孕周數(shù)與胚胎染色體的異常之間均存在一定的聯(lián)系。在反復(fù)流產(chǎn)(≥2次)的患者，自然流產(chǎn)的女性胚胎和自然早期流產(chǎn)的患者(孕周＜12 w)中，染色體核型異常的發(fā)生率明顯高于正常核型，這也提示我們?cè)诮窈蟮呐R床檢測(cè)和預(yù)防工作中，要加強(qiáng)對(duì)不同染色體異常情況的監(jiān)測(cè)，做到早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早診斷，從而提高優(yōu)生優(yōu)育工作的效率。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在147例成功培養(yǎng)的自然流產(chǎn)的胎兒絨毛組織樣本中，女性為89例，約占總流產(chǎn)患者的60.5%;而在67例染色體異常的胚胎中，女性為48例，約占總?cè)旧w異常胚胎的71.6%。說(shuō)明不論在自然流產(chǎn)胎兒還是在染色體異常的胎兒中，女性胚胎的比例明顯高于男性，這也與其他文獻(xiàn)報(bào)道的性別特異性的胚胎淘汰現(xiàn)象相符［13］。然而，上述性別傾向性的具體機(jī)制目前仍不明朗，可能有其他的因素導(dǎo)致了女性胚胎的自然流產(chǎn)的高發(fā)生率，也可能是因?yàn)椴±占臄?shù)量有限，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要更大的樣本量來(lái)深入研究證實(shí)這一現(xiàn)象［14］。

與此同時(shí)，我們研究也發(fā)現(xiàn)染色體的核型異常所導(dǎo)致的流產(chǎn)現(xiàn)象與發(fā)育的不同階段(孕周數(shù))有著密切的聯(lián)系。通常在2周左右的流產(chǎn)兒約60%存在染色體異常的情況，而在4～20周左右，其異常率則降為43%。并且在不同時(shí)期中，染色體異常的類型往往也是不同的，因此這也提示我們?cè)谂R床的檢測(cè)和診斷過(guò)程中要更加細(xì)致地去研究和區(qū)分相關(guān)的差異。在本研究中，早期流產(chǎn)患者(＜12w)胚胎的異常核型以21－三體和18－三體最為常見(jiàn)(分別占23%和17%)。而在晚期流產(chǎn)患者胚胎中，異常核型以16－三體最多(約占14%)。這些結(jié)果提示我們，染色體異常胚胎的存活率普遍不高，容易發(fā)生早期流產(chǎn)，需要在臨床的診斷、治療和預(yù)防方面加以重視。

綜上所述，胎兒的染色體異常是臨床上自然流產(chǎn)的主要誘因。如果能廣泛對(duì)針對(duì)流產(chǎn)的胚胎進(jìn)行大規(guī)模的染色體核型分析及相關(guān)的生化檢驗(yàn)，將有效地提高優(yōu)生優(yōu)育工作的效率，并為相關(guān)政策法規(guī)提供評(píng)估和指導(dǎo)意見(jiàn)。與此同時(shí)，隨著科學(xué)技術(shù)手段的進(jìn)步，更多新型的檢測(cè)方法也將應(yīng)用于臨床診斷和流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，將為更多的面臨生育困難的家庭帶來(lái)福音。

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