沙門(mén)氏菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

周忠坤

山東省煙臺(tái)市福山區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所

一、引言

豬霍亂沙門(mén)氏菌屬是寄生于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的無(wú)芽胞直桿菌，革蘭氏陰性，生化特性和抗原結(jié)構(gòu)相似，兼性厭氧。本屬菌現(xiàn)可分為：腸道沙門(mén)氏菌和邦戈?duì)柹抽T(mén)氏菌兩個(gè)種。 豬霍亂沙門(mén)氏菌呈直桿狀，0.7～1.5um×2.0～5.0um,革蘭氏陰性[1]。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上通常形成無(wú)色菌落， 在SS 瓊脂培養(yǎng)基上常形成無(wú)色但中心稍發(fā)黑的菌落，因該菌絕大多數(shù)可分解產(chǎn)生H2S，可使三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基變黑。在培養(yǎng)基中加入硫代硫酸鈉、胱氨酸、血清、葡萄糖、腦心浸液和甘油等均有助于本菌生長(zhǎng)。 本屬菌均有致病性，具有極其廣泛的動(dòng)物宿主。本菌最常侵害幼、青年動(dòng)物，使之發(fā)生敗血癥、胃腸炎及其他組織局部炎癥。 沙門(mén)氏菌很容易在動(dòng)物與動(dòng)物、動(dòng)物與人、人與人之間通過(guò)直接或間接地途徑傳播，沒(méi)有中間宿主。 主要傳染途徑是消化道,豬霍亂沙門(mén)氏菌生命力頑強(qiáng),對(duì)外界的抵抗力較強(qiáng),在凍土中可過(guò)冬。對(duì)消毒劑的抵抗力不強(qiáng),3%來(lái)蘇兒、福爾馬林等能將其殺死。 關(guān)于沙門(mén)菌耐藥性機(jī)制,主要集中于以下幾個(gè)方面： 拓?fù)洚悩?gòu)酶基因的突變；抗菌藥物攝取或累積量降低；可轉(zhuǎn)移遺傳元件介導(dǎo)的耐藥性機(jī)制；質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥性[2]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)本地區(qū)某豬場(chǎng)患病豬進(jìn)行了病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn),為查明病因和進(jìn)一步選用有效的抗生素進(jìn)行臨床治療提供科學(xué)根據(jù)。

二、材料與方法

1.材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某豬場(chǎng)患豬。

培養(yǎng)基。 麥糠凱瓊脂培養(yǎng)基、SS 瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)自廣州環(huán)凱；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基，按照標(biāo)準(zhǔn)方法自行配制。

藥敏紙片。藥敏試驗(yàn)用16 種藥敏紙片，購(gòu)自由杭州天和。

革蘭氏染色液自行配制。

2.試驗(yàn)方法

（1）病料采集及細(xì)菌分離。 對(duì)某豬場(chǎng)患豬進(jìn)行病料采集。 將病料用含5%小牛血清的營(yíng)養(yǎng)肉湯活化，37℃培養(yǎng)24 小時(shí)增菌[3]。將渾濁的肉湯培養(yǎng)物用接種環(huán)劃線(xiàn)接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和SS 瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 小時(shí)。將麥康凱培養(yǎng)基上的無(wú)色菌落和在SS 瓊脂培養(yǎng)基上無(wú)色， 菌落中心位置發(fā)黑的可疑菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 用60%甘油保存，并進(jìn)一步做生化鑒定實(shí)驗(yàn)。

（2）細(xì)菌鑒定。革蘭氏涂片染色法：用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落涂于玻璃片上，采用革蘭氏染色，并進(jìn)行顯微鏡觀察。

三糖鐵試驗(yàn)。把營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)的純菌培養(yǎng)液接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基上，觀察是否產(chǎn)氣及顏色的變化。

生化試驗(yàn)。 用接種針跳取細(xì)菌純菌落，分別接種于腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管中， 溫箱中培養(yǎng)24 小時(shí)觀察。

（3）藥敏試驗(yàn)。 紙片擴(kuò)散方法（K-B）藥敏試驗(yàn),將配制好的菌液1 毫升用涂菌棒均勻涂于MH 平板上，待菌液完全晾干后用滅菌小鑷子將藥敏紙片輕輕貼于澆好的MH 瓊脂上，每個(gè)平板貼4 張紙片，每張紙片間距不少于24 毫米， 紙片中心距平皿邊緣不少于15 毫米。 溫箱中倒置培養(yǎng)24 小時(shí)后觀察結(jié)果。24 小時(shí)后將貼有藥敏紙片的平皿取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑， 從平板背面測(cè)量最接近的整毫米數(shù)并記錄，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見(jiàn)不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限[4]。結(jié)果依據(jù)CLSI 推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分離菌株的耐藥性判定。

三、結(jié)果

1.培養(yǎng)特性及形態(tài)特征

采集的病料經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌后變渾濁。37℃培養(yǎng)24 小時(shí)，在麥糠凱瓊脂平板上呈無(wú)色菌落，濕潤(rùn)，隆起。SS 瓊脂平板上呈無(wú)色中心發(fā)黑的菌落，見(jiàn)圖1。分離菌株革蘭染色呈陰性，兩端鈍圓的短桿菌，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，都有周身鞭毛，見(jiàn)圖2。

圖2 革蘭氏染色細(xì)菌形態(tài)

2.三塘鐵試驗(yàn)

分離菌株肉湯培養(yǎng)物穿刺斜面后，斜面頂部呈黑色，表明H2S 產(chǎn)生，底部產(chǎn)酸，呈黃色，且上部呈紅色。由于沙門(mén)氏菌只能利用葡萄糖，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，因接觸空氣而氧化，細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來(lái)又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類(lèi)不被氧化，所以仍保持黃色。

3.生化試驗(yàn)

將分離菌株的肉湯純培養(yǎng)物接種于腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管中培養(yǎng)37℃24 小時(shí)， 編碼42361 對(duì)應(yīng)菌名為豬霍亂沙門(mén)氏菌，鑒定值為95.31%。因此根據(jù)生化鑒定結(jié)果初步判定該菌為豬霍亂沙門(mén)氏菌。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌株生化鑒定結(jié)果

4.藥敏試驗(yàn)

分離菌株對(duì)鏈霉素，慶大霉素，多粘菌素B，諾氟沙星，恩諾沙星，氧氟沙星敏感，對(duì)卡那霉素，氯霉素，紅霉素，頭孢噻肟中介，對(duì)氨芐西林，四環(huán)素，頭孢拉定，頭孢唑林，呋喃唑酮呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 抗菌藥物紙片藥敏試驗(yàn)結(jié)果

四、討論

本次試驗(yàn)從患豬體內(nèi)分離到一株豬霍亂沙門(mén)氏菌，并通過(guò)藥物敏感性試驗(yàn)對(duì)該菌的耐藥性進(jìn)行了初步研究。 試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)氨芐西林，四環(huán)素，頭孢拉定，頭孢唑林，呋喃唑酮呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性?？傮w來(lái)說(shuō)該菌對(duì)硝基呋喃類(lèi)， 四環(huán)素類(lèi)和β-內(nèi)酰胺類(lèi)的抗微生物藥產(chǎn)生耐藥性，如青霉素，頭孢菌素等，是獸醫(yī)臨床實(shí)踐中最常用的抗菌消炎藥。 但是，濫用該類(lèi)抗微生物藥， 已經(jīng)造成敏感菌產(chǎn)生了強(qiáng)大的耐藥性，為感染性疾病的治療帶來(lái)了巨大的困難[5]。對(duì)該區(qū)域定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)， 為今后的臨床用藥提供合理的參考，防止由于盲目用藥而造成耐藥敏感菌產(chǎn)生，減少由此帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。 同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理, 增強(qiáng)抗病能力；對(duì)于患病豬進(jìn)行無(wú)害化處理，做好消毒工作,保持良好的衛(wèi)生條件。

[1]陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[2]肖春玲,姚天爵.細(xì)菌耐藥性與新抗菌藥物的研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),2004, 26(4)：351-353.

[3]劉華偉，馬立農(nóng)等.畜禽及環(huán)境中沙門(mén)氏菌的PCR快速檢測(cè)與控制[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào).2005,2：59-63.

[4]佟金平，王鎮(zhèn)山等.磷霉素與14 種抗菌藥物分別連用的體外抗菌活性研究[J]. 中國(guó)抗生素雜志，2005,4(30)：229-232.

[5]糜租煌.細(xì)菌耐藥的分子機(jī)制[J].臨床兒科雜志,2005,23(7)：422-424.