HPLC 法同時(shí)測定不同栽培年限亳芍中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量

陳乃東 ，陳 翰，陳乃富，2，李 清，陳 瓊，謝小樂

1皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院;2皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心，六安 237012;3 安徽醫(yī)科大學(xué)，合肥 230032

亳芍(Bozhou Peony Paeonia lactiflora)，即亳白芍，是芍藥科植物芍藥或其變種毛果芍藥栽培品的根［1］，為安徽道地藥材之一，主產(chǎn)安徽省亳州地區(qū)。味苦、酸、甘，性微寒，具養(yǎng)血斂陰柔肝止痛、平抑肝陽等功效［2］，以芍藥總苷為主要活性成分，其中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷約占總苷70%以上［3］?，F(xiàn)代藥理研究表明，芍藥苷具有增加冠脈流量，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，對抗急性心肌缺血，抑制血小板凝聚及降低血壓等作用［4］，芍藥內(nèi)酯苷具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用［5-7］。芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量對亳芍臨床用藥具有重要影響。

中藥的活性成分積累與栽培年限密切相關(guān)。截止目前，有關(guān)白芍中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量研究主要集中在不同提取方法和不同產(chǎn)地的含量比較［8-10］，尚未見栽培時(shí)間對亳芍主要活性成分芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷積累的影響的報(bào)道。

本文建立了一種同時(shí)測定芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的檢測方法，在此基礎(chǔ)上，對不同生長年限亳芍中的芍藥苷及芍藥內(nèi)酯苷進(jìn)行含量變化研究，為探討中藥亳芍的最佳藥材采收時(shí)期、規(guī)范化種植、質(zhì)量評價(jià)及臨床用藥提供依據(jù)。

1 儀器與材料

分析天平(FA1004 型，中國上海精科有限公司)，超聲清洗器，Lanbo Service 4000 高效液相色譜儀(EZchrom Elite 軟件，UV4000 二極管陣列檢測器，美國Lanbo 公司)，循環(huán)水式多用真空泵(SHB-3S 型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。標(biāo)準(zhǔn)對照品芍藥苷(含量測定用，含量≥98%，批號:B10091)、芍藥內(nèi)酯苷(含量測定用，含量≥98%，批號:B10102)均購自上海士鋒生物科技有限公司。乙腈(色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?，水為市售娃哈哈純凈水，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

實(shí)驗(yàn)材料亳芍2013 年8 月于亳芍道地產(chǎn)區(qū)安徽省亳州市6 個(gè)不同的亳芍種植基地，品種經(jīng)皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心陳乃東博士鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.干燥的根。6 個(gè)不同栽培基地分別挖取栽培1～7 年的亳芍，共42 個(gè)樣品，洗凈，去皮，晾干，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制

以50% 乙醇配制成濃度125.0 μg/mL、22.5 μg/mL 芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷對照品溶液適量，0.45 μm 微孔濾膜過濾、備用。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取亳芍粉末0.5 g，置50 mL 容量瓶中，加50%的乙醇35 mL，60 ℃超聲處理(240 W，45 kHz)30 min，冷卻，加50%的乙醇定容至刻度，過濾，精密量取續(xù)濾液2 mL 以50%的乙醇定容到8 mL，微孔濾膜過濾，得供試品溶液。

2.3 色譜條件

Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫程序如下:0～5 min，5%～10%A;10～15.0 min，10～15%A;15.0～17.0 min，15～30%A;17～30.0 min，30%A;30.0～35.0 min，30～100%A;35～40.0 min，100%A。流速:1.0 mL/min;檢測波長:230 nm;柱溫為30 ℃。

在上述色譜條件下，對照品和供試品溶液HPLC 檢測結(jié)果如圖1 所示。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

分別緊密吸取2.1 項(xiàng)下配制的芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷對照品溶液各1、5、10、15、20 μL，注入高效液相色譜儀，按2.3 項(xiàng)下色譜條件，測定芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷峰面積，平行測定三次，取平均峰面積。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對照品質(zhì)量進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，分別得到的芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷回歸方程:y=1.2 ×1010x-3.5 ×106，R2=0.9960;y=1.1 ×106x-3.9×105，R2=0.9994。結(jié)果表明，芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在0.1250～2.5000 μg 和0.0225～0.4500 μg 范圍內(nèi)，分別與對應(yīng)峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷混合對照品溶液(A)、樣品溶液(B)及樣品溶液與對照品混合溶液(C)的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards (A)，Bozhou Penoy (B)and mixed solution of standards and Bozhou Penoy sample (C)

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取亳芍樣品適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10.0 μL，分別于0、4、8、12、16、20、24、48 h 進(jìn)樣。結(jié)果表明芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷峰面積的RSD 分別為0.96%和0.85%，說明樣品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定較好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批次亳芍樣品粉末6 份，按2.2 項(xiàng)方法制備供試品溶液，精密吸取10.0 μL，按2.3 色譜條件測定。結(jié)果顯示芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷峰面積的RSD 分別為1.83%、1.79%，表明本測定方法重復(fù)性良好。

2.4.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.1 項(xiàng)項(xiàng)下配制的芍藥苷和芍藥苷內(nèi)酯對照品溶液各10.0 μL，按2.3 項(xiàng)述方法，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得二者峰面積RSD 均小于1.5%，說明儀器精密度良好。

2.4.5 回收率試驗(yàn)

精密稱取0.5 g 已知含量的亳芍樣品粉末9份，每3 份一組，依次精密加入高、中、低3 個(gè)水平芍藥苷對照品5.0、1.0、0.1 mg 和藥內(nèi)酯苷2.0、0.5、0.1 mg，按2.2 項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.3 項(xiàng)方法進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果芍藥內(nèi)酯苷的平均回收率為101.30%，RSD 為2.57%;芍藥苷的平均回收率為100.56%，RSD 為2.10%。

2.5 樣品含量測定

精密稱取栽培1～7 年的亳芍樣品粉末各0.5 g，按2.2 項(xiàng)方法制備成供試品溶液，精密吸取10.0 μL 按2.3 項(xiàng)方法進(jìn)行測定，測得不同栽培年限的亳芍中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷HPLC 色譜圖(圖2)，記錄芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的峰面積，利用建立的芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量(圖3)。

圖2 不同株齡的亳芍芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷HPLC 檢測結(jié)果Fig.2 HPLC analysis of paeoniflorin and albiflorin in different years-old of Bozhou Peony P.Lactiflora

1～7 年株齡亳芍的芍藥苷含量依次為:3.26 ±0.20%、4.97 ± 0.18%、5.84 ± 0.20%、3.57 ±0.06%、3.38 ± 0.12 %、3.37 ± 0.07%、2.70 ±0.03%。1～7 年株齡亳芍的芍藥內(nèi)酯苷含量分別為:0.66 ±0.09%、1.71 ±0.09%、0.48 ±0.07%、0.83 ±0.02%、0.48 ±0.02%、0.47 ±0.03%、0.27±0.04%。上述檢測結(jié)果表明，亳芍中芍藥內(nèi)酯苷的含量遠(yuǎn)少于芍藥苷，芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量因株齡的不同存在一定差異。1～7 年株齡亳芍，以3 年株齡的芍藥苷含量最多，2 年株齡的芍藥內(nèi)酯苷含量最多。

圖3 不同株齡的亳芍芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷含量Fig.3 The contents of paeoniflorin and albiflorin from different years-old of Bozhou Peony P.Lactiflora

株齡1～7 年的亳芍中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷含量的方差分析顯示，芍藥苷在1～3 年含量呈遞增趨勢，3 年后含量降低，4～7 年株齡的芍藥苷含量差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，說明栽培3 年后，亳芍中芍藥苷含量趨于穩(wěn)定;芍藥內(nèi)酯苷在1～2 年呈遞增趨勢，2 年后含量降低，5～7 年含量平穩(wěn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)，說明隨著栽培年限增加，芍藥內(nèi)酯苷含量趨于穩(wěn)定。上述結(jié)果分析表明，如以芍藥苷含量為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，以栽培3 年的亳芍藥材品質(zhì)較好。如以芍藥內(nèi)酯苷為依據(jù)，亳芍栽培2 年做藥效果較好。

表1 不同生長年限的亳芍芍藥苷含量方差分析結(jié)果Table 1 The ANOVA results of paeoniflorin contents in Bozhou Peony P.lactiflora with different growth years

表2 不同生長年限的亳芍芍藥內(nèi)酯苷含量方差分析結(jié)果Table 2 The ANOVA results of albiflorin contents in Bozhou Peony P.lactiflora with different growth years

3 結(jié)論

首次對不同生長年限的安徽道地藥材——亳芍中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷含量進(jìn)行對比研究，研究發(fā)現(xiàn)三年株齡亳芍中芍藥苷含量最高，兩年株齡芍藥內(nèi)酯苷含量最多。研究結(jié)果對亳芍采收時(shí)期的確定、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和亳芍的藥物作用機(jī)制及臨床應(yīng)用提供新的參考依據(jù)。

1 Sun J(孫婕)，Ling NS(凌寧生).Comparison of the determination methods for paeoniflorin in Radix paeoniae Alba.Chin Tradit Herb Drugs，2004，35:1372-1374.

2 The State Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of People＇s Republic of China (Part I).2005.109.

3 Zhang XY(張曉燕)，Li X(李銑)，Gong JH(工金輝).A study on the chemical constituents of Paeonia lactiflora Pall.J Shenyang Pharm Univ，2001，18:30-32.

4 Liu YX(劉鷹翔)，Ma YZ(馬玉卓).Advances in research of chemistry and pharmacology of Radix paeoniae Alba.Chin Tradit Herb Drugs，1995，26:437-440.

5 Lee B，Shin YW，Bae EA，et al.Antiallergic effect of the root of Paeonia lactiflora and its constituents paeoniflorin and paeonol.Arch Pharm Res，2008，31:445-450.

6 Xiao L，Wang YZ，Liu J，et al.Effects of paeoniflorin on the cerebral infarction，behavioral and cognitive impairments at the chronic stage of transient middle cerebral artery occlusion in rats.Life Sci，2005，784:413-420.

7 Tomoda M，Matsumoto K，Shimizu N，et al.An acidic poly-saccharide with immunological activities from the root of Paeonia lactiflora.Biol Pharm Bull，1994，17:1161-1164.

8 Jeon MH，Kwon HJ，Jeong JS，et al.Detection of albiflorinand paeoniflorin in Paeoniae radix by reversed-phase high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection.J Chromatogr A，2009，1216:4568-4573.

9 Huang SJ(黃山君)，Yang QW(楊琪偉)，Shi YH(石燕紅)，et al.Simultaneous assay of paeoniflorin and albiflorin in Paeoniae Radix Alba by QAMS.China J Chin Mater Med，2011，19:780-783.

10 Kim N，Park KR，Park IS，et al.Application of novel HPLC method to the analysis of regional and seasonal variation of the active compounds in Paeonia lactiflora.Food Chem，2006，96:496-502.