芹菜素通過升高ROS 促進(jìn)不同細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

廖月霞，孔桂美，陶文華，卜 平

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤防治實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225001

芹菜素(4＇，5，7-三羥基黃酮，Apigenin)是一種天然植物黃酮，廣泛存在于蔬菜、水果、豆類、中草藥、紅酒和啤酒中，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等黃酮類生物活性［1，2］。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示飲食中富含芹菜素可以降低腸癌、卵巢癌、肺癌等腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［3］。一些研究結(jié)果提示芹菜素能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤細(xì)胞生長［4，5］。Munyendo等［6］應(yīng)用磷脂混合膠技術(shù)研究芹菜素抗腫瘤活性，結(jié)果顯示口服芹菜素混合膠可明顯提高芹菜素對S180移植瘤抑瘤活性。此外，芹菜素具有抑制免疫細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，具有潛在的調(diào)控肥大細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)活性和抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8、ICAM-1 等炎癥因子活性［7-9］。對其機(jī)制研究結(jié)果顯示芹菜素可以通過對相應(yīng)基因和蛋白的抑制或激活，調(diào)節(jié)信號分子，干預(yù)酶作用等途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞周期與凋亡、抑制侵襲與遷移、抑制血管新生、調(diào)節(jié)免疫等機(jī)制發(fā)揮生物性活性［10］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同濃度芹菜素作用于正常小鼠脾細(xì)胞和小鼠S180肉瘤細(xì)胞，觀察其對不同細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用，以期為合理開發(fā)利用芹菜素提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

MTT、硫酸亞鐵、水楊酸，DPPH［2，2-di(4-tertoctylphenyl)-1-picrylhydrazyl］、碘化丙啶(PI)為Sigma 公司產(chǎn)品，芹菜素(apigenin，HPLC ＞98%)為南京替斯艾么中藥技術(shù)研究所產(chǎn)品，活性氧檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司，RPMI 1640 購自Gibco 公司，其他實(shí)際均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.2 主要儀器

多功能酶標(biāo)儀(Biotek，USA)，SUV-2120 分光光度儀(SCINCO，韓國)，分析型流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur，USA)，倒置熒光顯微鏡(Nikon，日本)。

1.1.3 細(xì)胞及動物

小鼠S180肉瘤細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;4～6 周齡SPF 級ICR 小鼠購自江蘇省比較醫(yī)學(xué)中心(合格證No:2023469)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1 小鼠S180肉瘤細(xì)胞

S180細(xì)胞培養(yǎng)于完全RPMI 1640 培養(yǎng)基(含10% FBS，100 IU/mL 青霉素和鏈霉素100 (g/mL)，取對數(shù)生長期S180細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 ×104/mL。

1.2.1.2 小鼠脾細(xì)胞

4～6 周SPF 級ICR 小鼠脫頸處死，75%乙醇浸泡10 min，無菌操作取鼠脾臟，放在裝有預(yù)冷PBS的平皿中漂洗去血漬剔除外膜。用PBS 溶液沖洗兩遍，輕柔碾碎，200 目金屬細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液，加入紅細(xì)胞裂解液，靜置5 min 后，用PBS溶液洗滌3 次，調(diào)整細(xì)胞濃度5 ×105/mL。

1.2.2 MTT 檢測細(xì)胞增殖情況

將與不同濃度芹菜素孵育細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)工作液，37 °C，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)4 h，離心去上清，每孔加入100 μL DMSO，于振蕩器上震蕩10 min，檢測吸光度，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)孔A均值-空白孔A 均值)/(溶媒空均值-空白孔A 均值)×100%。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)平行6 復(fù)孔，重復(fù)3 次。

1.2.3 PI 單染測細(xì)胞凋亡

同上細(xì)胞濃度種板，以5%血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，24 h 后收集細(xì)胞。以PBS 重懸細(xì)胞，加入-20 °C預(yù)冷的75%乙醇中固定。4 °C 過夜后PBS 重懸細(xì)胞5 min。200 目篩網(wǎng)收集細(xì)胞。加入1mL PI 染色液(50 μg/mL)，4 °C、避光孵育45 min。流式細(xì)胞儀分析PI 熒光Sub-G1細(xì)胞百分率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度測定

應(yīng)用不同濃度芹菜素(12.5、25、50、100 μmol/L)刺激S180細(xì)胞和脾細(xì)胞24 h，調(diào)整S180細(xì)胞濃度為2 ×106/mL，脾細(xì)胞濃度5 ×107/mL，參考文獻(xiàn)［11］實(shí)驗(yàn)方法，應(yīng)用碧云天活性氧檢測試劑盒，步驟簡述如下:按照1∶1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的37 °C DCFH-DA 中45 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，ROS 陽性對照或不同濃度芹菜素(12.5、25、50、100 μmol/L)刺激細(xì)胞30 min。收集細(xì)胞后流失細(xì)胞儀檢測，使用488 nm 激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，檢測刺激前后熒光的強(qiáng)弱，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 芹菜素素對細(xì)胞活力的影響

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芹菜素素對正常ICR 小鼠來源的脾細(xì)胞具有明顯抑制細(xì)胞增殖作用，與溶媒對照組比較，25 μmol/L 芹菜素可抑制60%左右的細(xì)胞增殖，IC50約為20 μmol/L。對小鼠S180肉瘤細(xì)胞也具有明顯抑制細(xì)胞增殖作用，IC50約為50 μmol/L。結(jié)果提示芹菜素素對不同細(xì)胞增殖作用可能沒有特異性(圖1)。

圖1 芹菜素抑制小鼠來源脾細(xì)胞(A)及S180細(xì)胞(B)增殖(*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01)Fig.1 Apigenin inhibited the proliferation of mice spleen cells (A)and S180cells (B)(*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01)

2.2 芹菜素對細(xì)胞凋亡的影響

為進(jìn)一步研究芹菜素對不同細(xì)胞的作用，對芹菜素作用24 h 后的細(xì)胞進(jìn)行單染分析，結(jié)果顯示＞25 μmol/L 芹菜素作用的小鼠來源的脾細(xì)胞組Sub-G1期細(xì)胞比例明顯增加(P＜0.05)，提示芹菜素可能通過促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞凋亡抑制其細(xì)胞增殖(圖2)。對S180細(xì)胞作用結(jié)果也顯示＞25 μmol/L 芹菜素作用的S180細(xì)胞組Sub-G1期細(xì)胞比例明顯增加(P＜0.05)，提示芹菜素可能也是通過促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞凋亡抑制其細(xì)胞增殖(圖3)。這些結(jié)果提示芹菜素可能非特異性地誘導(dǎo)不同細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖2 芹菜素誘導(dǎo)小鼠來源脾細(xì)胞凋亡(*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01)Fig.2 Apigenin induced the mice spleen cell apoptosis (*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01)

圖3 芹菜素誘導(dǎo)S180肉瘤細(xì)胞凋亡(*，P＜0.05)Fig.3 Apigenin induced the S180cell apoptosis (*，P＜0.05)

2.3 芹菜素素對不同細(xì)胞內(nèi)活性氧作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示芹菜素在較低濃度時(shí)即明顯升高ICR 小鼠來源脾細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生，在量效關(guān)系上呈現(xiàn)低濃度上升，較高濃度下降的特點(diǎn)，且對脾細(xì)胞不同細(xì)胞群細(xì)胞內(nèi)活性氧均有增加作用(圖4)。圖5 結(jié)果顯示芹菜素顯著促進(jìn)S180小鼠肉瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生，在量效關(guān)系上也呈現(xiàn)低濃度上升，較高濃度下降的特點(diǎn)，這些結(jié)果提示芹菜素素對不同細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生也存在非特異性調(diào)節(jié)作用，且較低濃度即明顯促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧生成，推測其在較高濃度的下降趨勢可能與細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。

3 討論

圖4 芹菜素升高了脾細(xì)胞內(nèi)活性氧水平(*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01)Fig.4 Apigenin increased the level of intercellular ROS of mice spleen cells (*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01)

圖5 芹菜素升高了S180細(xì)胞內(nèi)活性氧水平(＊＊，P＜0.01)Fig.5 Apigenin increased the level of intercellular ROS of S180cells (＊＊，P＜0.01)

本節(jié)研究結(jié)果顯示芹菜素顯著抑制了小鼠脾細(xì)胞和S180細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)，芹菜素顯著升高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。這些結(jié)果提示芹菜素可能是通過升高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，誘導(dǎo)不同細(xì)胞發(fā)生凋亡。

藥物或毒物抑制細(xì)胞增殖通常通過阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞壞死等途徑［12］，本次實(shí)驗(yàn)中，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡變化，結(jié)果顯示芹菜素、顯著誘導(dǎo)S180細(xì)胞和脾細(xì)胞發(fā)生凋亡，隨著濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增加。這些結(jié)果提示芹菜素可能通過促進(jìn)S180細(xì)胞和脾細(xì)胞凋亡從而抑制細(xì)胞增殖。

由超氧離子、過氧化氫和羥自由基組成的活性氧是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)品，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中具有調(diào)控作用［13］。研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化基本處于平衡狀態(tài)，當(dāng)?shù)臀⑺降幕钚匝跎呖纱龠M(jìn)細(xì)胞增殖，而較高水平的活性氧則引發(fā)細(xì)胞凋亡，更高水平的活性氧則直接導(dǎo)致細(xì)胞壞死［14］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示芹菜素明顯升高了S180細(xì)胞和脾細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，這與文獻(xiàn)［14］報(bào)道結(jié)論基本一致，提示芹菜素可能是通過升高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，進(jìn)一步影響活性氧下游的細(xì)胞信號系統(tǒng)，促進(jìn)了S180細(xì)胞和脾細(xì)胞的凋亡。

脾臟是體內(nèi)最大的外周免疫器官，在機(jī)體免疫，尤其抗腫瘤免疫方面占有十分重要的地位，脾臟富含大量的免疫細(xì)胞和免疫因子參與腫瘤免疫，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC 細(xì)胞和調(diào)理素、補(bǔ)體等，通過不同的機(jī)制參與免疫反應(yīng)，發(fā)揮免疫功能［15］。脾臟功能在腫瘤的不同階段扮演不同的角色，具有雙向性、時(shí)向性特點(diǎn)，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，脾臟切除對大鼠腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和擴(kuò)散有顯著的促進(jìn)作用［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示芹菜素同時(shí)抑制脾細(xì)胞和S180腫瘤細(xì)胞增殖，提示其作用可能具有非特異性，這種非特異性作用在芹菜素抗腫瘤機(jī)制的意義和作用有待進(jìn)一步研究。

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