低溫蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

莫清珊 ，張會圖，田 耀，孫同韋，馮士元，孫 軍，路福平

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457)

低溫蛋白酶是指最適催化溫度在40,℃以下，并且在20～30,℃仍能保持較高酶活(50%以上)的一類蛋白水解酶[1].由于其最適催化溫度接近自然環(huán)境中的溫度，因此在應(yīng)用過程中可省去加熱或冷卻過程，與中高溫蛋白酶相比具有節(jié)能、省時(shí)等特點(diǎn)，在食品及洗滌行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景.低溫蛋白酶多數(shù)來源于冰川、極地、高山、深海等低溫環(huán)境中的嗜低溫或耐低溫微生物[2–3].這些低溫微生物為了適應(yīng)其所處的低溫環(huán)境，常可表達(dá)分泌一些在低溫條件下仍具有較高催化活性的胞外酶或胞內(nèi)酶，因此從耐低溫或嗜低溫微生物中篩選獲得低溫蛋白酶已成為發(fā)掘新型工業(yè)用低溫酶制劑的主要方法[4].目前已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)低溫蛋白酶菌株有來源于冰川凍土中的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和短小桿菌(Curtobacterium luteum)、來源于南極地區(qū)的梭狀芽孢桿菌(Clostridium sp.)和嗜冷桿菌(Psychrobacter proteolyticus)、來源于海洋浮冰中的科爾韋爾氏菌屬(Colwellia sp.)、來源于寒漠地區(qū)的微小桿菌(Exiguobacterium sp.)以及來源于其他寒冷環(huán)境中的沙雷氏菌(Serratia sp.)、弧菌(Vibrio sp.)、黃單胞菌(Xanthomonas maltophilia)、希瓦氏菌屬(Shewanella sp.)產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)等.這些菌株所產(chǎn)低溫蛋白酶的最適催化溫度大部分均在30～40,℃，只有少數(shù)幾種的最適催化溫度低于20,℃，但穩(wěn)定性很差.國內(nèi)對低溫蛋白酶及其產(chǎn)生菌的研究起步較晚，研究對象多集中在來源于冰川及凍土中的假單胞菌屬 (Pseudomonas)、黃桿菌屬(Xanthomonas)、產(chǎn)氣單胞菌屬(Aeromonas)等.本研究則從深海沉積物中分離到1 株產(chǎn)低溫蛋白酶動性球菌(Planococcus sp.)，并對該菌株的生長特性、產(chǎn)酶特性及其所產(chǎn)蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究.

1 材料與方法

1.1 菌株來源

嗜冷菌株由天津科技大學(xué)孫軍教授提供的南印度洋的深海沉積物中分離得到.

1.2 主要試劑和儀器

連接酶、Taq DNA 聚合酶、dNTP、T 載體、DNA Marker，寶生物工程(大連)有限公司；酪蛋白、瓊脂粉、緩沖液試劑，上海生工生物工程有限公司.

PCR 儀、凝膠成像儀、電泳系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；1500–201 型全波長酶標(biāo)儀，美國熱電公司.

1.3 培養(yǎng)基

酪蛋白篩選培養(yǎng)基：酪蛋白20,g，瓊脂15,g，人工海水定容到1,L，調(diào)節(jié)pH 到7.5～8.0.

發(fā)酵培養(yǎng)基：ZoBell 2216E 培養(yǎng)基.

1.4 產(chǎn)低溫蛋白酶菌株的分離與鑒定

1.4.1 產(chǎn)低溫蛋白酶菌株的分離

取深海沉積物樣品1,g，加入20,mL 生理鹽水，渦旋振蕩混勻.按10 倍稀釋法稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-76 個(gè)稀釋度的稀釋液，每個(gè)稀釋度各取0.2,mL 稀釋液涂布于3 個(gè)酪蛋白篩選培養(yǎng)基平板上，并分別于4、20、25,℃培養(yǎng)72,h.選取菌落周圍有明顯蛋白水解圈的菌落于酪蛋白分離培養(yǎng)平板上進(jìn)行三區(qū)劃線純化培養(yǎng).根據(jù)水解圈直徑dH與菌落直徑dc的比值確定菌株低溫條件下產(chǎn)蛋白酶能力的大小.

1.4.2 16S,rDNA 的克隆及系統(tǒng)進(jìn)化分析

菌體基因組提取參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行；以上述基因組為模板，以細(xì)菌 16S rDNA 通用引物 27,F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1492,R(5'-AGT AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3')對16S rDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增.PCR 反應(yīng)條件為：94,℃預(yù)變性5,min，然后94,℃ 60,s，55,℃ 90,s，72,℃ 120,s，循環(huán)30 次，72,℃ 延伸10,min.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆至T 載體，并委托北京華大基因公司測序.將所得序列在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行 Blastn 比對(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，確定與其相關(guān)的種屬特性.

1.4.3 菌株形態(tài)及生理生化特性鑒定

最適生長溫度、菌落形態(tài)、革蘭氏染色、氧化酶活性檢測、過氧化氫酶活性檢測、明膠液化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行.

1.5 蛋白酶粗酶液的制備及酶活測定

將種子培養(yǎng)液以2%的體積比接種至50,mL 發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在不同溫度下(15、20、25,℃)，200,r/min振蕩培養(yǎng)52,h，定時(shí)取樣，考察不同培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響.

收集菌液于4,℃、10,000,r/min 離心30,min，收集上清液.

以酪蛋白為底物的酶活的測定方法參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行；根據(jù)QB/T 1803—1993《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》，以1,mL 酶液在37,℃、pH 8.0 條件下，每分鐘反應(yīng)產(chǎn)生1,μg 酪氨酸所需要的酶量為1 個(gè)酶活力單位(U/mL).

粗酶液用緩沖溶液稀釋至適當(dāng)濃度，作為待測酶液.緩沖液配制1%的酪素溶液作為底物并將粗酶液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù).取1,mL 稀釋的酶液，37,℃保溫2,min，加入同樣溫度的底物 1,mL，于 37,℃反應(yīng)10,min，加入2,mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸終止反應(yīng).靜置離心，取1,mL 上清液，加入5,mL 0.4,mol/L Na2,CO3溶液、1,mL 福林酚試劑，混勻，40,℃保溫20,min，測定吸光度A680.以滅活酶液為空白對照.

1.6 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.6.1 溫度對蛋白酶酶活的影響

分別將1,mL 粗酶液與1,mL 水解酪蛋白溶液(1%，pH 8.0)混勻，分別在4～50,℃ 測定酶活力，以酶活力最高時(shí)為100%，計(jì)算其他條件下的相對酶活力.

1.6.2,pH 對蛋白酶酶活的影響

用不同pH 的乳酸鈉緩沖液(pH 2.0、3.0、4.0、5.0)、磷酸鹽緩沖液(pH 6.0、7.0、7.5、8.0)、硼砂緩沖液(pH 9.0、10.0)將待測酶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，?7,℃及相應(yīng)pH 條件下測定酶活，酶活數(shù)值最大者計(jì)為100%，所對應(yīng)的pH 即為待測酶最適反應(yīng)pH，其他pH 下的酶活與最高酶活的比值即為其相對酶活.

1.6.3 蛋白酶的熱穩(wěn)定性檢測

將粗酶液分別在10、37、45,℃保溫30、60、90、120,min 后測定殘余酶活，以未進(jìn)行保溫處理的酶活力值作為對照，設(shè)定其相對酶活力為100%，得出酶活力隨保溫時(shí)間變化的曲線.

1.6.4 不同金屬離子及化學(xué)試劑對蛋白酶酶活的影響

將待測酶液置于不同濃度(5、1,mmol/L)的Ca2+、Mg2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+緩沖液中，4,℃保溫1,h，在pH 10.0、37,℃條件下測定殘留的酶活.將待測酶液置于EDTA、PMSF、β-ME 緩沖液中，4,℃保溫1,h，在pH 10.0、37,℃條件下測定殘留的酶活.

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)低溫蛋白酶菌株的篩選

低溫培養(yǎng)條件下不同菌株的蛋白水解圈形成情況如圖1 所示.在低溫培養(yǎng)條件下(4～10,℃)，經(jīng)透明圈篩選以及劃線純化后復(fù)篩，共獲得3 株具有分泌表達(dá)蛋白酶能力的菌株，分別將其編號為11813、11815 以及11816.其中菌株11815 的蛋白酶分泌表達(dá)能力較強(qiáng)，在培養(yǎng)溫度為10,℃的條件下，24,h 內(nèi)，其蛋白水解圈直徑與菌落直徑的比值(dH/dc)最高可達(dá)2.77；而在相同條件下，菌株11813 及11816 的dH/dc則分別僅有1.78 和1.60.

圖1 低溫培養(yǎng)條件下不同菌株的蛋白水解圈形成情況Fig.1 Cold protease transparent zone formed by strains

在不同培養(yǎng)溫度下，分別對上述3 株產(chǎn)蛋白酶菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，菌株11815 在4～37,℃均可生長，其最適生長溫度為20,℃左右，當(dāng)溫度大于等于40,℃時(shí)，則生長極為緩慢甚至停止生長；菌株11813及11816 的最適生長溫度與菌株11815 相似，因此均屬于典型的耐冷菌.由于菌株11815 的產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)，因此作為下一步重點(diǎn)研究對象.

2.2 菌株11815的分析鑒定

菌株11815 屬革蘭氏陽性菌，呈球形或卵圓形，直徑約1.0～1.2,μm，呈雙球狀或連珠狀排列；菌落形態(tài)圓形，顏色橙黃色，表面光滑、邊緣齊整.該菌屬好氧性或兼性厭氧菌，可較好利用葡萄糖、果糖、淀粉等碳源，能夠利用硫酸銨、蛋白胨、水解酪蛋白等氮源；具有氧化酶、過氧化氫酶活性，明膠液化實(shí)驗(yàn)呈陽性.

該菌16S rDNA 全長序列為1,450,bp，與動性球菌(Planococcus antarcticus) DSM 14505 的相似度為99%，結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特性，將其鑒定為動性球菌屬.

2.3 溫度和pH對菌株11815產(chǎn)酶的影響

在搖瓶發(fā)酵條件下，研究不同培養(yǎng)溫度(15、20、25,℃)對菌株11815 產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖2 所示.結(jié)果表明：該菌株的最佳生長溫度與最適產(chǎn)酶溫度相一致，均為20,℃，發(fā)酵培養(yǎng)48,h 可達(dá)到產(chǎn)酶高峰，產(chǎn)酶量約為280,U/mL.在菌體培養(yǎng)的初級階段，菌體的生長量與產(chǎn)酶量呈正比；當(dāng)菌體生長達(dá)到平衡期后，菌體量不再增加，而粗酶液中的蛋白酶活性則開始下降，這可能與蛋白酶的自身降解有關(guān).從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷：該蛋白酶的表達(dá)應(yīng)為組成型表達(dá)，只與菌體量有關(guān)，而與其他誘導(dǎo)因素?zé)o關(guān).因此在發(fā)酵過程中設(shè)法提高菌體濃度，同時(shí)在發(fā)酵液中加入適量蛋白酶抑制劑，可有效提高蛋白酶產(chǎn)量.

圖2 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of culture temperature on enzyme production

pH 對菌株產(chǎn)酶的影響較小，初始pH 在6～8 之間，菌株11815 均可穩(wěn)定生長并產(chǎn)酶.

2.4 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 酶的最適作用溫度及熱穩(wěn)定性檢測

在不同溫度下分別對菌株11815 發(fā)酵液中的蛋白酶活性進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖3 所示.該菌株所產(chǎn)蛋白酶的最適作用溫度為37,℃左右，并且在25～30,℃均有較好的催化活性(最高催化酶活的50%以上)，與其他低溫蛋白比較發(fā)現(xiàn)，蛋白酶SKPB5 以及焦曲霉(Aspergillus ustus)、假單胞菌(Pseudomonas)strain DY-A 分泌的蛋白酶等，最適溫度在 40～42,℃[8–10]，11815 分泌的蛋白酶的最適作用溫度更低.因此，該菌株所產(chǎn)蛋白酶的最適作用溫度與自然環(huán)境中的溫度基本一致，在使用過程中可以省去加熱及冷卻的過程，具有節(jié)能環(huán)保等應(yīng)用屬性.

圖3 蛋白酶的作用溫度與相對酶活的關(guān)系Fig.3 The relationship between protease temperature and the relative enzyme activity

酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示.該菌株所產(chǎn)蛋白酶的熱穩(wěn)定性較低，37,℃保溫 20,min 或45,℃保溫60,min 后，酶活僅剩原來的10%；50,℃保溫10,min 后，則催化活性完全喪失；該蛋白酶只有在10,℃以下才能保存較長的時(shí)間；這一特性與大多數(shù)低溫蛋白酶[7–9]相似，主要與低溫蛋白酶本身較為松散的蛋白結(jié)構(gòu)及其較高的分子柔性有關(guān).

圖4 蛋白酶的熱穩(wěn)定性Fig.4 Effects of temperature on the stability of protease activity

2.4.2 酶的最適作用pH

分別在不同pH 條件下測定菌株11815 所產(chǎn)蛋白酶活力，酶活力隨pH 變化的曲線如圖5 所示.該酶在pH 4.0～10.0 均具有催化活力，其最適作用pH為8.0 左右；當(dāng)pH 升至9.0 時(shí)，其酶活約為最高酶活的70%左右，當(dāng)pH 升至10.0 時(shí)，酶活大幅下降，僅為最高酶活的25%；當(dāng)pH 降至7.0 時(shí)，酶活力約為最高活力的82%.因此，該菌株所產(chǎn)蛋白酶為低溫蛋白酶.

圖5 蛋白酶的作用pH與相對酶活的關(guān)系Fig.5 The relationship between pH of protease and the relative enzyme activity

2.4.3 不同金屬離子及化學(xué)試劑對蛋白酶酶活的影響

不同金屬離子及化學(xué)試劑對蛋白酶酶活的影響見表1.

表1 不同的金屬離子、抑制劑對蛋白酶酶活的影響Tab.1 Effect of various metal ions and inhibitors on protease activity

金屬離子Ca2+對該菌株所產(chǎn)蛋白酶有激活作用，Mn2+對其基本沒有影響；Mg2+、Ba2+、Fe3+、Zn2+、Co2+、Ni2+則對其有一定的抑制作用，Ni2+對其抑制作用最強(qiáng)，濃度為1.0,mmol/L 的Ni2+可抑制90%以上的酶活，因此組氨酸可能是該酶的活性中心之一；EDTA 對該酶有一定抑制作用，某些金屬離子可能對維持酶分子的三維結(jié)構(gòu)有重要作用；另外，該酶被PMSF 強(qiáng)烈抑制，因此該菌株所產(chǎn)蛋白酶的活性位點(diǎn)應(yīng)包括His、Ser 以及羧基氨基酸.

3 結(jié)語

從南印度洋深海沉積物中分離得到1 株產(chǎn)低溫蛋白酶菌株，經(jīng)菌種鑒定為動性球菌(Planococcus sp.).該菌株的最適生長溫度為 20,℃左右，可在10～25,℃進(jìn)行快速生長代謝；并在20,℃以下具有表達(dá)分泌低溫蛋白酶的能力，最適的培養(yǎng)溫度為20,℃，搖瓶發(fā)酵條件下，48,h 內(nèi)的蛋白酶產(chǎn)量可達(dá)280,U/mL.酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果顯示：該菌株所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH 為8.0，最適作用溫度為37,℃，當(dāng)催化溫度降至30,℃時(shí)，酶活可保持在80%以上，并且在4,℃條件下仍具有水解蛋白的能力.EDTA 對該酶有一定抑制作用，PMSF 對該酶具有強(qiáng)烈抑制作用，因此該菌株所產(chǎn)蛋白酶的活性位點(diǎn)應(yīng)包括His、Ser 以及羧基氨基酸.該酶熱穩(wěn)定性較差，50,℃僅保溫1.0,min，則酶活完全喪失.由該菌株所產(chǎn)蛋白酶的上述特性表明，該酶屬于典型的低溫蛋白酶，具有一定的研究及開發(fā)價(jià)值.本課題組還將對該低溫蛋白酶的編碼基因進(jìn)行分離與克隆，并進(jìn)一步嘗試在其他宿主菌中實(shí)現(xiàn)其高效異源表達(dá).

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