玉米芯誘導(dǎo)里氏木霉Rut C30 產(chǎn)纖維素酶的分析

馬立娟，蔡 瑞，崔有志，赫榮琳，陳樹林，肖冬光

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308)

里氏木霉(Trichoderma reesei)是一種噬溫的腐生真菌，被廣泛應(yīng)用于纖維素和半纖維素水解酶類的生產(chǎn)和研究中[1].T.reesei 產(chǎn)生的纖維素酶是一類誘導(dǎo)酶類，其合成和表達(dá)必須在誘導(dǎo)物的作用下才能進(jìn)行.已報道的誘導(dǎo)T.reesei 產(chǎn)纖維素酶的物質(zhì)主要是一些糖類，包括聚糖、寡糖和單糖，其中，以纖維素、槐糖的誘導(dǎo)效果最好，但是，由于槐糖價格昂貴無法作為工業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)原料[2–4].作為纖維素酶分解的底物，天然纖維素本身即是良好的誘導(dǎo)劑[5].目前，關(guān)于T.reesei 纖維素酶誘導(dǎo)方面的研究大部分針對乳糖和纖維素開展[6–9].對于復(fù)合誘導(dǎo)物木質(zhì)纖維素誘導(dǎo)T.reesei 產(chǎn)纖維素酶的過程分析方面的報道較少.2013 年，Bischof 等[10]比較分析了天然纖維素小麥秸稈和乳糖誘導(dǎo)里氏木霉合成纖維素酶的轉(zhuǎn)錄組，揭開了天然纖維素誘導(dǎo)T.reesei 合成纖維素酶的分子機(jī)理研究的序幕.

本研究以T.reesei 為研究對象，分別比較了不同誘導(dǎo)碳源誘導(dǎo)T.reesei 的產(chǎn)酶水平.以玉米芯為誘導(dǎo)物得到的酶液對玉米芯進(jìn)行水解，采用高效液相色譜(HPLC)法分析水解過程中糖的組成及變化.最后分析比較水解得到的部分糖對T.reesei 纖維素酶誘導(dǎo)合成的影響.

1 材料與方法

1.1 菌種

里氏木霉(T.reesei)Rut C30 ATCC56765 由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)購得.

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

1.2.1 斜面培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯的煮汁200，葡萄糖20，瓊脂20，115,℃滅菌20,min.將保存菌種接入PDA 培養(yǎng)基，28,℃恒溫培養(yǎng)6,d.

1.2.2 菌絲體培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

菌絲體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖3，(NH4)2,SO41.4，KH2,PO42，CaCl2·2H2O 0.3，MgSO4·7H2O 0.3，多聚蛋白胨1，酵母提取物0.5，吐溫80 1,mL/L，微量元素溶液1,mL/L，用pH 4.8 的50,mmol/L 檸檬酸鈉緩沖液體系配制.微量元素溶液(mg/L)：FeSO4·7H2O 5，MnSO4·H2O 1.6，ZnSO4·7H2O 1.4，CoCl22，115,℃滅菌20,min.

將斜面上培養(yǎng)好的新鮮孢子制備成孢子懸液，接種于裝有50,mL 培養(yǎng)基的250,mL 三角瓶中，孢子的接種量為108,L–1，28,℃、180,r/min 恒溫培養(yǎng)24,h.

1.2.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)培養(yǎng)方法

誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO40.35，KH2PO40.5，CaCl2·2H2O 0.075，MgSO4·7H2O 0.075，吐溫80 0.25,mL/L，微量元素溶液0.25,mL/L，誘導(dǎo)物10(其中，玉米芯粒度為80 目)，用pH 5.0 的50,mmol/L 檸檬酸鈉緩沖液體系配制.微量元素溶液組成同上.121,℃滅菌20,min.

將上述預(yù)培養(yǎng)好的菌絲體過濾，用0.9%的NaCl溶液洗滌2 次后，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，接種量(以干質(zhì)量計)為2.0,mg/mL，26,℃、200,r/min 條件下恒溫培養(yǎng)，并于不同誘導(dǎo)時刻取樣進(jìn)行酶活測定.

1.3 玉米芯水解

水解所用粗酶液為T.reesei Rut C30 以玉米芯為底物發(fā)酵所得.底物玉米芯質(zhì)量濃度為100,g/L，酶的轉(zhuǎn)載量為10,FPU/g；水解過程在50,℃、150,r/min的水浴搖床中進(jìn)行；水解體系為30,mL，0.05,mol/L pH 4.8 檸檬酸鈉緩沖液為緩沖體系，同時添加0.02‰疊氮化鈉抑制雜菌生長.分別于不同水解時刻取樣進(jìn)行糖組分的測定.

1.4 分析方法

1.4.1 酶活測定

濾紙酶活(filter paper activity，F(xiàn)PA)的測定采用國際理論與應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(IUPAC)推薦的標(biāo)準(zhǔn)測定方法[11].以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，F(xiàn)PA 酶活力單位定義：在pH 4.8、溫度為50,℃的條件下，1,mL 酶液1,min 水解50,mg Waterman No.1 濾紙條(1,cm×6,cm)產(chǎn)生1,μmol 葡萄糖當(dāng)量的還原糖的酶用量為1個酶活力單位，用FPU/mL 表示.

β–葡萄糖苷酶酶活的測定也采用IUPAC 推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法[11]，其酶活力單位定義：在pH 4.8、50,℃條件下，1,mL 酶液1,min 水解1,μmol 纖維二糖產(chǎn)生2,μmol 葡萄糖當(dāng)量的還原糖的酶用量為1 個酶活力單位，用IU/mL 表示.

木聚糖酶的活力單位定義：在0.05,mol/L pH 5.3檸檬酸鈉緩沖液、溫度為50,℃的條件下，1,mL 酶液1,min 水解木聚糖產(chǎn)生1,μmol 葡萄糖當(dāng)量的還原糖的酶用量為1 個酶活力單位，用IU/mL 表示.

1.4.2 可溶性蛋白的測定

可溶性蛋白的測定采用Bradford 法[12]，以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線.將誘導(dǎo)上清液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛龋∠♂尯蟮拿敢?00,μL 加入2,mL Bradford 工作液并振蕩混勻，5～10,min 內(nèi)于595,nm 處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度.

1.4.3 玉米芯水解液糖的分析

玉米芯水解液中各種糖的測定采用高效液相色譜分析儀結(jié)合示差檢測器進(jìn)行測定，色譜柱分別為Aminex HPX-87(300,mm×7.8,mm)碳水化合物分析柱和Aminex HPX-42A(300,mm×7.8,mm)碳水化合物分析柱，流動相均為去離子水，流量為0.6,mL/min，柱溫為75,℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同誘導(dǎo)物對T.reesei Rut C30 產(chǎn)酶的影響

2.1.1 對主要木質(zhì)纖維素降解酶產(chǎn)量的影響

分別比較了木質(zhì)纖維素類誘導(dǎo)碳源纖維素、玉米芯、麩皮、小麥秸稈、玉米秸稈誘導(dǎo)T.reesei Rut C30的產(chǎn)酶情況.誘導(dǎo)120,h 后，主要木質(zhì)纖維素降解酶纖維素酶、β–葡萄糖苷酶和木聚糖酶的產(chǎn)量(分別以濾紙酶活、β–葡萄糖苷酶酶活和木聚糖酶活計)見表1.

由表1 可知：在相同的誘導(dǎo)濃度(10,g/L)下，以玉米芯為誘導(dǎo)物時，120,h 后誘導(dǎo)液中纖維素酶、β–葡萄糖苷酶和木聚糖酶的酶活分別達(dá)到1.53,FPU/mL、0.61,IU/mL 和72.86,IU/mL，三者的產(chǎn)量均高于其他幾種誘導(dǎo)物.以纖維素為誘導(dǎo)碳源時3 種酶的產(chǎn)量僅次于玉米芯.文獻(xiàn)[7]報道，槐糖是誘導(dǎo)里氏木霉合成纖維素酶最好的碳源，但是，對于不可溶性的誘導(dǎo)碳源，一般認(rèn)為纖維素是最好的選擇，但都是在誘導(dǎo)濃度較高的時候，與本研究前期的結(jié)果一致[13].然而，在低的誘導(dǎo)濃度時，有半纖維素成分的玉米芯卻表現(xiàn)出較好的誘導(dǎo)能力，這在劉超綱等[14]用玉米芯誘導(dǎo)產(chǎn)木聚糖酶的研究中也有類似的結(jié)論，這可能與玉米芯的組成成分和結(jié)構(gòu)有關(guān).

2.1.2 對可溶性蛋白產(chǎn)量的影響

不同誘導(dǎo)碳源對T.reesei Rut C30 分泌的可溶性蛋白的影響如圖1 所示.

圖1 不同誘導(dǎo)物對T.reesei Rut C30 分泌蛋白的影響Fig.1 Effects of different inducers on protein secretion with T.reesei Rut C30

由圖1 可知：誘導(dǎo)120,h 后，以玉米芯為誘導(dǎo)碳源時T.reesei Rut C30 分泌到胞外的可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度最高，為2.09,g/L；其次為纖維素、小麥秸稈和玉米秸稈；麩皮誘導(dǎo)所產(chǎn)生的分泌蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度最低.該結(jié)果與產(chǎn)酶結(jié)果一致.玉米芯、小麥秸稈和玉米秸稈均為含有半纖維素類的木質(zhì)纖維素原料，由于半纖維素成分可誘導(dǎo)半纖維素酶的表達(dá)，因此以該類碳源為誘導(dǎo)物時T.reesei Rut C30 合成的蛋白的種類較以純纖維素為誘導(dǎo)碳源時多.Bischof 等[10]比較分析了不同誘導(dǎo)碳源小麥秸稈和乳糖誘導(dǎo)里氏木霉合成纖維素酶的轉(zhuǎn)錄組，1,619 個基因在以小麥秸稈為底物時表達(dá)，而以乳糖為底物時不表達(dá)，這些基因主要編碼木聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和甘露糖苷酶等.同時，由于玉米芯與秸稈類纖維素原料相比較在結(jié)構(gòu)上的疏松性以及其高含量的半纖維素成分，導(dǎo)致以其為碳源時更容易被T.reesei Rut C30 利用分解為可溶性誘導(dǎo)糖進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶.

2.2 玉米芯水解過程糖組分及含量分析

經(jīng)HPLC 檢測玉米芯水解液中的糖，可檢測到的單糖包括：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖；寡糖包括：槐糖、纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖、木二糖、木三糖等.由于標(biāo)準(zhǔn)品原因，該過程中只定量分析了纖維二糖和單糖，結(jié)果如圖2所示.

圖2 玉米芯水解過程中單糖和纖維二糖的含量Fig.2 Cotents of monosaccharide and cellobiose during the enzymatic hydrolysis of corn cob

由圖2 可知：葡萄糖和木糖的質(zhì)量濃度均是隨著水解時間的延長不斷增加直至水解50,h，質(zhì)量濃度分別達(dá)到19.3,g/L 和14.6,g/L.但是，其他幾種單糖如半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖的質(zhì)量濃度隨水解時間的延長增加不明顯.對于纖維二糖，則是隨著水解時間的延長其質(zhì)量濃度先上升后下降，這是由于水解生成纖維二糖的同時，其又被β–葡萄糖苷酶水解為葡萄糖.

2.3 玉米芯水解物對T.reesei Rut C30 產(chǎn)纖維素酶的影響

以玉米芯經(jīng)酶水解后得到的不同組分為誘導(dǎo)物對T.reesei Rut C30 進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，結(jié)果如圖3 和圖4 所示.

由于以玉米芯水解物誘導(dǎo)里氏木霉時β–葡萄糖苷酶產(chǎn)量特別小，計算酶活誤差較大，因此這里在β–葡萄糖苷酶酶活測定方法的基礎(chǔ)上，以1,mL 酶液30,min 水解15,μmol 纖維二糖底物所釋放的葡萄糖的質(zhì)量濃度來表示誘導(dǎo)過程中產(chǎn)生的β–葡萄糖苷酶.單獨(dú)以木聚糖、甘露糖和阿拉伯糖為誘導(dǎo)物時，不能直接誘導(dǎo)纖維素酶和β–葡萄糖苷酶的合成.而以低濃度的半乳糖為誘導(dǎo)物時，纖維素酶和β–葡萄糖苷酶均可得到低水平的誘導(dǎo)表達(dá).這與文獻(xiàn)[15]報道“以乳糖為誘導(dǎo)物時添加低水平的半乳糖可以誘導(dǎo)外切酶CBH1 和CBH2 的表達(dá)”的結(jié)果一致.但是，其誘導(dǎo)合成纖維素酶和β–葡萄糖苷酶的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于以纖維素和玉米芯為誘導(dǎo)物時的產(chǎn)量.

圖3 不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)T.reesei Rut C30 產(chǎn)纖維素酶情況Fig.3 Effects of different inducers on cellulase production with T.reesei Rut C30

圖4 不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)T.reesei Rut C30 產(chǎn)β–葡萄糖苷酶的情況Fig.4 Effects of different inducers on β-glucosidase production with T.reesei Rut C30

為了進(jìn)一步研究玉米芯水解物對T.reesei Rut C30 產(chǎn)酶的影響，將幾種單糖和木聚糖以相同的濃度與1%的纖維素混合作為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，結(jié)果如圖5 和圖6 所示.添加甘露糖和阿拉伯糖時，纖維素酶和β–葡萄糖苷酶的產(chǎn)量均下降，結(jié)合前面的結(jié)果可知，甘露糖和阿拉伯糖抑制T.reesei Rut C30 產(chǎn)酶.而添加半乳糖時，纖維素酶產(chǎn)量上升，但β–葡萄糖苷酶的產(chǎn)量下降.添加木聚糖時，60,h 后纖維素酶和β–葡萄糖苷酶的產(chǎn)量高于纖維素誘導(dǎo).同時，各種誘導(dǎo)物以相同濃度誘導(dǎo)T.reesei Rut C30 時，玉米芯誘導(dǎo)產(chǎn)纖維素酶、β–葡萄糖苷酶和木聚糖酶的水平是最高的.由此結(jié)果可以進(jìn)一步證實(shí)，含有半纖維素成分的玉米芯誘導(dǎo)T.reesei Rut C30 產(chǎn)纖維素酶的過程是一個非常復(fù)雜的過程，并且其調(diào)控過程可能呈復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀.

圖5 添加不同水解物對T.reesei Rut C30 產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.5 Effects of different hydrolysate addition on cellulase production with T.reesei Rut C30

圖6 添加不同水解物對T.reesei Rut C30 產(chǎn)β–葡萄糖苷酶的影響Fig.6 Effects of different hydrolysate addition on β-glucosidase production with T.reesei Rut C30

3 結(jié)論

比較不同木質(zhì)纖維素類誘導(dǎo)碳源誘導(dǎo)里氏木霉Rut C30 產(chǎn)酶的情況，結(jié)果表明：以玉米芯為誘導(dǎo)碳源誘導(dǎo)120,h 后，纖維素酶、β–葡萄糖苷酶和木聚糖酶的酶活分別為 1.53,FPU/mL、0.61,IU/mL 和72.86,IU/mL.采用HPLC 法分析玉米芯酶解過程中單糖的組成為葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖等.誘導(dǎo)產(chǎn)酶實(shí)驗表明半乳糖可誘導(dǎo)纖維素酶的合成，甘露糖和阿拉伯糖抑制T.reesei Rut C30 產(chǎn)纖維素酶和β–葡萄糖苷酶.而木聚糖與纖維素混合時有助于誘導(dǎo)產(chǎn)酶.由此可見，玉米芯誘導(dǎo)的實(shí)質(zhì)仍然是其水解后的可溶性寡糖及半乳糖的共同作用，并且該過程是一個非常復(fù)雜的過程.因此，需要進(jìn)一步從酶的基因表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子表達(dá)的水平上對其誘導(dǎo)機(jī)理進(jìn)行研究.

［1］Peterson R，Nevalainen H.Trichoderma reesei RUTC30：Thirty years of strain improvement[J].Microbiology，2012，158(1)：58-68.

［2］Schuster A，Schmoll M.Biology and biotechnology of Trichoderma[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2010，87(3)：787-799.

［3］Zhang Y H P，Himmel M E，Mielenz J R.Outlook for cellulase improvement：Screening and selection strategies[J].Biotechnology Advances，2006，24(5)：452-481.

［4］謝天文，劉曉風(fēng)，袁月祥，等.真菌產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物及其調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2010，16(3)：440-444.

［5］Suto M，Tomita F.Induction and catabolite repression mechanisms of cellulase in fungi[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2001，92(4)：305-311.

［6］李輝，王義強(qiáng)，陳介南，等.里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)和合成機(jī)理研究進(jìn)展[J].中國釀造，2011(6)：8-12.

［7］張曉萍.低聚糖和纖維類碳源對里氏木霉合成纖維素酶的誘導(dǎo)作用[D].南京：南京工業(yè)大學(xué)，2010.

［8］Sternberg D，Mandels G R.Induction of cellulolytic enzymes in Trichoderma reesei by sophorose[J].Journal of Bacteriology，1979，139(3)：761-769.

［9］Morikawa Y，Ohashi T，Mantani O.Cellulase induction by lactose in Trichoderma reesei PC-3-7[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1995，44(1/2)：106-111.

［10］Bischof R，F(xiàn)ourtis L，Limbeck A，et al.Comparative analysis of the Trichoderma reesei transcriptome during growth on the cellulase inducing substrates wheat straw and lactose[J].Biotechnology for Biofuels，2013，6(1)：127-141.

［11］Ghose T K.Measurement of cellulase activities[J].Pure and Applied Chemistry，1987，59(2)：257-268.

［12］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of micro-gram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72(1/2)：248-254.

［13］Ma L J，Li C，Yang Z H，et al.Kinetic studies on batch cultivation of Trichoderma reesei and application to enhance cellulase production by fed-batch fermentation[J].Journal of Biotechnology，2013，166(4)：192-197.

［14］劉超綱，勇強(qiáng)，余世袁.里氏木霉誘導(dǎo)合成木聚糖酶的調(diào)控[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，23(3)：29-32.

［15］Karaffa L，F(xiàn)ekete E，Gamauf C，et al.D-Galactose induces cellulase gene expression in Hypocrea jecorina at low growth rates[J].Microbiology，2006，152(5)：1507-1514.