板栗花純露的抗氧化活性研究

邵明輝，王雪青*，宋文軍，趙國強(qiáng)，付慶偉

1天津市食品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134;2唐山遷西縣板栗產(chǎn)業(yè)研究發(fā)展中心，唐山 064300

紫外線輻射能引起皮膚變黑、紅斑和光敏等急性反應(yīng)或?qū)е缕つw干燥、起皺失去彈性和色素沉著等慢性反應(yīng)，甚至有可能誘發(fā)皮膚癌［1］，由紫外線輻射引起的皮膚氧化是導(dǎo)致皮膚損傷、老化的重要原因［2，3］。因此，在陽光充足的夏季，護(hù)膚產(chǎn)品的抗氧化和防紫外線功能顯得越來越重要。目前在醫(yī)療、食品和化妝品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的多為化學(xué)合成抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)等。研究發(fā)現(xiàn)，長期使用合成抗氧化劑，對(duì)生物體有潛在的毒副作用［4］。因此，開發(fā)以天然植物成分為主的抗氧化產(chǎn)品是近年來的研究熱點(diǎn)。

板栗花為殼斗科(Fagceae)栗屬植物栗(Castanea mollissima Blume)的雄性花序，香氣怡人、柔和、開闊，形狀為圓柱狀葇荑花序［5］。近年來，伴隨著板栗種植面積的不斷增加，其副產(chǎn)物板栗花的產(chǎn)量也十分可觀，但大多被當(dāng)作廢物丟棄或燃料燃燒，造成資源的極大浪費(fèi)。據(jù)報(bào)道，板栗花中含有豐富的活性物質(zhì)，不僅具有顯著的抗氧化作用［6］，而且還有比較明顯的驅(qū)蚊效果［7］。目前，針對(duì)板栗花抗氧化性研究主要集中在黃酮類化合物上，其揮發(fā)性成分的抗氧化性研究甚少。因此，本研究選取提取板栗花精油過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物純露為研究對(duì)象，研究其抗氧化性并與夏季常用的花露水產(chǎn)品作對(duì)比，為板栗花的天然抗氧化性研究提供理論依據(jù)，為開發(fā)抗氧化新型花露水提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

板栗花純露，由河北省唐山市遷西縣板栗研究發(fā)展中心提供(在蒸汽壓力為0.04 MPa，液固比為6，蒸餾2.5 h 條件下制得)。板栗花純露通過復(fù)蒸的方式經(jīng)油水分離器得揮發(fā)油，約占板栗花純露的0.0621%，所獲得的板栗花精油為淺黃色油狀液體，具有濃郁的板栗花的特殊香氣。揮發(fā)油經(jīng)GC-MS分析，鑒定出19 種化合物，占揮發(fā)油總量的98.21%，其中主要成分為α-甲基苯甲醇(11.88%)、芳樟醇(9.46%)、壬醛(11.73%)、松油醇(5.42%)、棕櫚酸(10.69%)和9，12-十八碳二烯酸(8.01%)等;隆力奇驅(qū)蚊花露水，其主要成分為乙醇、二乙基甲苯甲酰胺(5%)、二苯酮-4、三乙醇胺、蛇膽提取物、CI42090 等;六神驅(qū)蚊花露水，其主要成分為乙醇、丁基乙酰氨基丙酸乙酯(4.5%)、薄荷醇、EDTA 二鈉、蛇膽提取物、CI42090 等，均購于當(dāng)?shù)爻?DPPH，Sigma 公司;實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha-1500 型紫外可見分光光度計(jì)，上海譜元儀器有限公司;722N 型可見分光光度計(jì)，北京晶弘精密儀器有限公司;ZK-82A 型真空干燥箱，天津遠(yuǎn)方實(shí)驗(yàn)儀器廠;KQ2200B 型超聲波清洗機(jī)，南京市超聲儀器有限公司;Perkin Elmer UV/VIS，Spectrometer Lambda 25。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 板栗花純露清除DPPH 自由基能力的測定［8，9］

將板栗花純露稀釋成不同濃度的溶液，同樣將六神、隆力奇花露水和Vc 稀釋成相同濃度作為樣品溶液。分別向一系列10 mL 比色管中加入3.5 mL 用乙醇稀釋濃度為1.0 ×10-4mol/L 的DPPH 溶液和0.5 mL 樣品液，搖勻，避光反應(yīng)30 min，以乙醇作為參比，測定517 nm 下的吸光度A，同樣方法測定3.5 mL 無水乙醇和0.5 mL 樣品液混合后在517 nm 下的吸光度A0，再測定3.5 mL DPPH 溶液和0.5 mL 無水乙醇混合后在517 nm 下的吸光度A1，平行測定三次，取平均值，并按以下公式計(jì)算不同濃度的樣品液對(duì)DPPH 自由基的清除率。利用不同濃度樣品溶液的清除率繪制曲線圖，由曲線擬合回歸方程計(jì)算DPPH 自由基清除率為50%時(shí)所需板栗花純露濃度，記為IC50，以IC50值表示板栗花純露清除DPPH 自由基能力。

1.3.2 板栗花純露還原能力的測定［10］

分別配制不同濃度的板栗花純露，同樣方法配制相同濃度的Vc 溶液、隆力奇和六神樣品液作為對(duì)陽性照組。分別加入0.2 mol/L 的磷酸緩沖液2 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀［K3Fe(CN)6］溶液2 mL，混合均勻，50 ℃水浴下保溫20 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸(TCA)溶液2 mL，震蕩混勻后離心。取離心后的上清液2 mL，加入2 mL 去離子水和0.4 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% 的氯化鐵(FeC13)溶液，震蕩混勻后在50 ℃水浴下保溫10 min，體系溶液由黃色變?yōu)樗{(lán)色，在700 nm 下測定吸光度，進(jìn)行比色。以去離子水代替樣品作為空白對(duì)照。平行測定三次，取平均值。

1.3.3 板栗花純露清除羥基自由基能力的測定［11］

以板栗花純露作為樣品液，配制好的Vc 溶液、隆力奇和六神樣品液作為對(duì)陽性對(duì)照組。在一系列10 mL 比色管中分別加入0.3 mL 濃度為0.4 mmol/L 的結(jié)晶紫溶液、1.2 mL 濃度為1.0 mmol/L 的硫酸亞鐵(FeSO4)溶液和0.6 mL 濃度為2.0 mmol/L 過氧化氫(H2O2)溶液，用pH=4.0 的磷酸檸檬酸緩沖溶液將上述溶液定容至10 mL，搖勻后靜置30 min，在580 nm 處，測其吸光度Ab，同時(shí)測定以上體系加過氧化氫之前，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的樣品液后體系在580 nm 處的吸光度Ax，測定不加過氧化氫前體系在580 nm 處的吸光度A0。平行測定三次，取平均值。按以下公式計(jì)算清除率。

1.3.4 板栗花純露對(duì)亞硝酸鹽清除率的測定［12］

取已知濃度的板栗花純露2 mL 于25 mL 容量瓶中，加入0.005 mg/mL 的亞硝酸鈉(NaNO2)標(biāo)準(zhǔn)溶液3 mL，加入pH=3.0 的磷酸檸檬酸緩沖溶液5 mL，37 ℃下反應(yīng)30 min，立即加入2 mL 質(zhì)量濃度為0.4%的對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后，加入1 mL 質(zhì)量濃度為0.2%的鹽酸萘已二胺溶液，加蒸餾水至刻度，混勻，靜置15 min，以5 mL 樣品液為空白組，在544 nm 處，測定吸光度為A，測定NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度為A0，按以下公式計(jì)算樣品液對(duì)NO-2 的清除率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與討論

2.1 板栗花純露清除DPPH 自由基的能力

不同濃度的板栗花純露、六神、隆力奇和Vc 樣品液清除DPPH 自由基能力見圖1。由圖1 可以看出，樣品液對(duì)DPPH 自由基的清除率隨濃度的增加而增大，當(dāng)樣品液濃度達(dá)到0.5 mg/mL 時(shí)，清除率趨于穩(wěn)定。此時(shí)板栗花純露的清除率為80.64%;六神樣品液的清除率為70.21%;隆力奇樣品液的清除率為60.14%;Vc 溶液的清除率為90.04%。

許多學(xué)者對(duì)天然產(chǎn)物中的黃酮類［13，14］和多酚類［15］化合物清除DPPH 自由基能力進(jìn)行了研究，而鮮見對(duì)其他類物質(zhì)的研究報(bào)道，特別是植物純露清除DPPH 自由基方面的研究僅見2014 年孟慧報(bào)道［16］，她在研究四種芳香植物純露體外抗氧化活性中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度為0.376 mg/mL 時(shí)，薰衣草純露、肉豆蔻純露、沉香純露和降香純露對(duì)DPPH 自由基的清除率分別為58.217%、52.098%、9.016% 和8.525%。由DPPH 自由基清除率/樣品液濃度曲線的擬合回歸方程可知，當(dāng)板栗花純露的濃度為0.376mg/mL時(shí)，DPPH自由基的清除率為66.325%，而且當(dāng)板栗花純露濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，與六神、隆力奇樣品液相比，DPPH 自由基的清除率分別提高了15%(P＜0.01)和34%(P＜0.01)，由此可見，板栗花純露較報(bào)道的其他植物純露抗氧化性更強(qiáng)，顯示出板栗花純露具有較強(qiáng)的清除DPPH 自由基能力。

圖1 板栗花純露對(duì)DPPH 自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging ability of the hydrosol from chestnut flower

由板栗花純露、六神、隆力奇和Vc 樣品液的擬合線性回歸方程計(jì)算各個(gè)樣品液清除DPPH 自由基的IC50值分別為0.25、0.32、0.38 mg/mL 和0.21 mg/mL。板栗花純露清除DPPH 自由基的IC50為0.25 mg/mL，明顯優(yōu)于兩種市售花露水但略小于Vc(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)各組樣品清除DPPH 自由基能力大小順序依次為:Vc ＞板栗花純露＞六神樣品液＞隆力奇樣品液。

2.2 板栗花純露的還原能力

不同濃度的板栗花純露、六神、隆力奇和Vc 樣品液的還原能力見圖2。由圖2 可知，板栗花純露的吸光度隨濃度的增大而增加，當(dāng)濃度為1.5 mg/mL 時(shí)，吸光度達(dá)到最大值為0.88，之后略有下降，即板栗花純露的還原能力隨濃度也是先增加后降低，濃度為1.5 mg/mL 時(shí)，還原能力最強(qiáng)。同樣，隆力奇和六神樣品液的吸光度隨濃度呈現(xiàn)相同的趨勢，但沒有板栗花純露還原力那樣穩(wěn)定，同等濃度下，板栗花純露的還原能力相對(duì)較大，抗氧化能力相對(duì)較強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映出板栗花純露的還原能力雖然不及同濃度的Vc 但卻遠(yuǎn)大于六神、隆力奇樣品液(P＜0.01)，這可能是板栗花純露中存在某些具有抗氧化活性的多酚類物質(zhì)，充當(dāng)了供電子的還原劑，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力［17］。

圖2 板栗花純露的還原能力Fig.2 Reducing power of the hydrosol from chestnut flower

2.3 板栗花純露清除羥基自由基的能力

不同濃度的板栗花純露、六神、隆力奇和Vc 樣品液清除羥基自由基能力見圖3。由圖3 可知，樣品液對(duì)羥基自由基的清除率隨濃度的增大而增加，當(dāng)濃度為0.1 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)到最大值，之后保持穩(wěn)定。此時(shí)，板栗花純露的清除率為74.03%，六神樣品液的清除率為61.24%，隆力奇樣品液的清除率為64.84%，Vc 的清除率為29.98%。相比，板栗花純露對(duì)羥基自由基的清除率最大且分別提高了21%(P＜0.01)、14%(P＜0.01)和147(P＜0.01)。

生物體在氧化呼吸過程中，伴隨著能量的產(chǎn)生，會(huì)形成一定量的活性氧(ROS)，然而生物在進(jìn)化過程中，自身擁有一套完整的抗氧化防御體系，能及時(shí)清除產(chǎn)生的ROS，從而保證細(xì)胞正常的能量和物質(zhì)代謝的順利進(jìn)行［18］。當(dāng)細(xì)胞受到紫外線等射線的輻射脅迫時(shí)，能誘導(dǎo)產(chǎn)生超氧陰離子(O-·2)、過氧化氫(H2O2)和羥基自由基(OH·)等活性氧［19］，使細(xì)胞內(nèi)ROS 不斷積累，當(dāng)超過自身清除能力時(shí)，過多的ROS 積累則導(dǎo)致迸發(fā)現(xiàn)象的發(fā)生。同時(shí)ROS 能氧化細(xì)胞膜中有多個(gè)不飽和雙鍵的脂類物質(zhì)，形成丙二醛(MDA);MDA 與蛋白質(zhì)、核酸或脂類發(fā)生交聯(lián)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能，造成細(xì)胞的氧化損傷［20］。在體外實(shí)驗(yàn)體系中，環(huán)境中的Fe3+和Fe2+能催化過氧化氫和超氧陰離子反應(yīng)生成羥基自由基，羥基自由基是活性氧中反應(yīng)能力最強(qiáng)的一種，它幾乎可以和細(xì)胞內(nèi)的一切有機(jī)物反應(yīng)，它能殺死紅細(xì)胞，降解細(xì)胞膜、DNA 和多糖類化合物，引起組織細(xì)胞病變，導(dǎo)致疾病發(fā)生和加速機(jī)體衰老［21］。本實(shí)驗(yàn)利用此原理，測定板栗花純露清除羥基自由基能力，以反映板栗花純露的抗氧化性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)板栗花純露具有較強(qiáng)的抗氧化性，可作為潛在的防曬產(chǎn)品。

許多天然抗氧化劑常顯示出強(qiáng)有力的清除羥基自由基能力，其原因可能正是由于天然產(chǎn)物中含有化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜且濃度很低的多種物質(zhì)，如板栗花純露中包含精油的一些組分，如芳樟醇、香葉醇等?；旌系目寡趸瘎┹^單一的合成抗氧化劑有更多的還原基團(tuán)，具有提供氫質(zhì)子的能力，可使具有高度氧化性的自由基還原，從而終止自由基連鎖反應(yīng)，起到清除或抑制自由基反應(yīng)的目的。李榮［22］等在研究肉豆蔻精油抗氧化性能時(shí)，發(fā)現(xiàn)天然抗氧化劑的羥基自由基清除能力強(qiáng)于2，6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)和沒食子酸丙酯(PG)等合成抗氧化劑。這一結(jié)果與我們的一致。

2.4 板栗花純露清除亞硝酸鹽的能力

圖3 板栗花純露對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging ability of the hydrosol from chestnut flower

不同濃度的板栗花純露、六神、隆力奇和Vc 樣品液清除亞硝酸鹽的能力見圖4。由圖4 可見，板栗花純露對(duì)亞硝酸鹽清除率隨著濃度的增大而增加，當(dāng)濃度為4 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)到最大值為84.77%，之后略有降低。

人攝食亞硝酸鹽含量高的食物后，患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)顯著增加，這是由于胃中的食物處在酸性條件下，亞硝酸鹽可與食物中的仲胺、叔胺和酰胺等反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物亞硝胺，該物質(zhì)具有較強(qiáng)的致癌作用［23］。板栗花純露對(duì)亞硝酸鹽的清除能力明顯優(yōu)于其他三種樣品液，這說明了板栗花純露不僅具有開發(fā)成為新型防曬花露水的潛力，同時(shí)也具備作為一種天然抗氧化劑應(yīng)用于食品行業(yè)的可能性。

圖4 板栗花純露對(duì)亞硝酸鹽的清除能力Fig.4 Nitrite scavenging ability of the hydrosol from chestnut flower

3 結(jié)論

板栗花純露在一定濃度范圍內(nèi)具有良好的抗氧化活性，當(dāng)板栗花純露濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，清除DPPH 自由基能力最強(qiáng)，清除率為80.64%，IC50為0.25 mg/mL;濃度為1.5 mg/mL 時(shí)，還原能力最強(qiáng);濃度為0.1 mg/mL 時(shí)，清除羥基自由基能力最強(qiáng)，清除率為74.03%;濃度為4 mg/mL 時(shí)，清除亞硝酸鹽能力最強(qiáng)，清除率為84.77%。在實(shí)驗(yàn)各處理組相同濃度下，板栗花純露清除羥基自由基和亞硝酸鹽能力最好;而清除DPPH 自由基能力和還原能力弱于Vc。板栗花純露抗氧化機(jī)理復(fù)雜，還有待進(jìn)一步地討論和研究。

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