骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對局灶性腦缺血大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響Δ

楊曉帆 ，韓鵬飛，臧兆萍，陳 培 (1.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157011; .牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江牡丹江 157011; .齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江齊齊哈爾 16101; .牡丹江醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

帕金森綜合征是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，患者中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元會發(fā)生變性壞死，紋狀體多巴胺含量也會出現(xiàn)顯著減少，對人體的危害極大。隨著神經(jīng)干細(xì)胞的成功分離、純化以及體外擴(kuò)增和定向誘導(dǎo)分化等技術(shù)的成熟，其已成為研究治療帕金森綜合征的熱點(diǎn)。通過對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，可以得到相應(yīng)的神經(jīng)干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后能分化為功能性的紋狀體多巴胺能神經(jīng)元，細(xì)胞替代治療通過移植可分泌多巴胺的細(xì)胞到腦內(nèi)，對患者的大腦功能予以重建，達(dá)到治療疾病的目的［1］。本研究中探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對局灶性腦缺血大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，為臨床治療提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 材料

SD 大鼠30 只，均為雄性、成年，體質(zhì)量180 ～200 g，均由南京君科生物工程有限公司提供。本次研究相關(guān)內(nèi)容和方法均經(jīng)本院倫理部門審核并批準(zhǔn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案、使用動物品種品系規(guī)格、處死動物的方法、項(xiàng)目進(jìn)行中設(shè)計(jì)動物福利和倫理問題等均符合要求，試驗(yàn)試藥與儀器情況見表1。

表1 試驗(yàn)試藥與儀器Tab 1 Experimental drugs，reagent and instrument

1.2 方法

30 只SD 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、觀察組和對照組，每組10 只。構(gòu)建局灶性腦缺血模型，采用全細(xì)胞貼壁法進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠進(jìn)行頸部切開并分離頸內(nèi)動脈，且不做任何處理;觀察組大鼠進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療;對照組大鼠給予等量磷酸鹽緩沖液。干細(xì)胞移植之后利用多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，死亡后取腦，常規(guī)制成石蠟塊并切片。進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)檢測，檢測GFAP 與二脒基苯基吲哚( 4'6-diamidino-2-phenylindole，DAPI) 以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白4( bonemorphogeneticprotein4，BMP4) 與DAPI 的雙陽性表達(dá)情況。具體方法為： 修復(fù)后利用正常山羊血清進(jìn)行封閉處理，添加鼠抗人GFAP 單克隆抗體或兔抗BMP4，4 ℃并向過夜，過夜PBD 洗滌，添加山羊抗小鼠IgG 進(jìn)行孵育，置熒光顯微鏡下觀察GFAP+DAPI+與BMP4+DAPI+細(xì)胞數(shù)目，并進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)缺血側(cè)腦神經(jīng)元。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本次研究過程中得到的所有研究數(shù)據(jù)均錄入SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，并進(jìn)行處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的予以t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的予以單因素方差分析，并進(jìn)行相關(guān)性分析。檢測P值，如果經(jīng)檢測P＜0.05，則提示2 組數(shù)據(jù)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠神經(jīng)元數(shù)目比較

局灶性腦缺血模型大鼠的神經(jīng)細(xì)胞均呈現(xiàn)出排列不整齊的情況。假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)元數(shù)目為(1 125.12±75.13)個(gè)/mm2，對照組大鼠的神經(jīng)元數(shù)目為(655.12 ±53.15) 個(gè)/mm2，觀察組大鼠的神經(jīng)元數(shù)目為(815.12 ±55.65) 個(gè)/mm2。與假手術(shù)組比較，觀察組和對照組大鼠的神經(jīng)元數(shù)目明顯偏少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) 。

2.2 3 組大鼠免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果比較

對照組大鼠可觀察到大量的GFAP+DAPI+細(xì)胞和BMP4+DAPI+，且數(shù)量明顯多于假手術(shù)組和觀察組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ，見表2。

表2 3 組大鼠免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果比較(個(gè)/mm2，ˉx±s)Tab 2 Comparison of double-labelling immunofluorescence between three group of rats(neurons/mm2，xˉ±s)

2.3 BMP4 蛋白和GFAP 蛋白相關(guān)性分析

BMP4 蛋白和GFAP 蛋白之間具有一定的相關(guān)性。其中，GFAP+DAPI+細(xì)胞數(shù)和BMP4+DAPI+細(xì)胞數(shù)之間呈現(xiàn)出直線回歸，見圖1。

圖1 BMP4 蛋白和GFAP 蛋白現(xiàn)回歸分析圖Fig 1 Regression analysis diagram of BMP4 and GFAP protein

3 討論

人體內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞一樣屬于永久細(xì)胞，即不可再生細(xì)胞，因此，神經(jīng)細(xì)胞死亡所導(dǎo)致的疾病對人體損害不可逆轉(zhuǎn)，目前的治療手段只能延緩疾病進(jìn)展，或恢復(fù)尚未完全壞死的神經(jīng)細(xì)胞功能［2］。

帕金森病為臨床較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，在中老年群體中具有較高的發(fā)病率?；颊咧心X黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性壞死和紋狀體多巴胺含量明顯減少，臨床大多表現(xiàn)出不同程度的靜止性震顫、肌強(qiáng)直、動作遲緩、姿勢及步態(tài)異常等運(yùn)動癥狀，并伴有各種非運(yùn)動癥狀，包括焦慮、抑郁、癡呆、睡眠障礙、體位性體血壓等。帕金森病起病時(shí)多為一個(gè)或一側(cè)肢體發(fā)病，隨時(shí)間推移波及對側(cè)。常規(guī)治療方法包括保護(hù)神經(jīng)以及改善微循環(huán)，左旋多巴治療等。常規(guī)治療在控制癥狀方面雖然可以取得一定的療效，但長期用藥后會出現(xiàn)藥物失效或運(yùn)動障礙等不良作用。隨著干細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床開始積極的嘗試?yán)貌煌母杉?xì)胞對帕金森患者進(jìn)行治療［3］。目前，應(yīng)用較多的干細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。

神經(jīng)干細(xì)胞是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細(xì)胞，能夠分化產(chǎn)生神經(jīng)組織中不同細(xì)胞類型的細(xì)胞，具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力。神經(jīng)干細(xì)胞對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、神經(jīng)組織穩(wěn)態(tài)的維持和損傷的修復(fù)起著重要的作用，其功能失調(diào)與許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［4］。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的主要組成部分之一便是星形膠質(zhì)細(xì)胞，在出現(xiàn)腦缺血后，星形膠質(zhì)細(xì)胞會被激活，并發(fā)揮出重要的作用，對神經(jīng)干細(xì)胞的分化予以調(diào)控，以達(dá)到修復(fù)腦損傷的目的［5］。星形膠質(zhì)細(xì)胞并不是神經(jīng)細(xì)胞，而是以支持神經(jīng)細(xì)胞作用為主要目的，包括提供營養(yǎng)、做為神經(jīng)細(xì)胞之間的絕緣體，以免神經(jīng)細(xì)胞之間電傳導(dǎo)過程傳遞訊息時(shí)出錯(cuò)、如架子一般支撐起神經(jīng)細(xì)胞、引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞延伸生長等等［6］。

干細(xì)胞是人體發(fā)育進(jìn)化的最小單位，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞即為一種重要的干細(xì)胞類型［7］。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的能力，在一定的體外條件下，經(jīng)一定的誘導(dǎo)可以獲得神經(jīng)細(xì)胞等，并被應(yīng)用于各種治療之中［8］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的特點(diǎn)，在一定的體外環(huán)境下，可以發(fā)生分離和擴(kuò)增，然后對其進(jìn)行回輸，可以定位于骨髓，并隨著時(shí)間的推移發(fā)生自我更新，因此實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)長期的存活［9］。張海燕等［10］通過研究發(fā)現(xiàn)，在一定的體外誘導(dǎo)條件下，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化成神經(jīng)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞的可塑性。本次研究中可以觀察到局灶性腦缺血模型大鼠的神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)出排列不整齊的情況，且較之假手術(shù)組，神經(jīng)元數(shù)目明顯偏少。這一結(jié)果表明，本次研究區(qū)過程中局灶性腦缺血模型的制作是成功的。研究結(jié)果還顯示，觀察組大鼠的神經(jīng)元數(shù)目明顯多于對照組，表明經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞側(cè)腦室移植治療之后，可以有效減輕局灶性腦缺血性大鼠的腦損傷程度。對照組大鼠可觀察到大量的GFAP+DAPI+細(xì)胞，且數(shù)量明顯多于假手術(shù)組和觀察組。其原因可能為經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療可有效減少大鼠缺血側(cè)腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的形成，表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以及神經(jīng)干細(xì)胞均可在大鼠腦內(nèi)發(fā)生分化，形成神經(jīng)元和神經(jīng)元樣細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞等［11］。而這些細(xì)胞可以發(fā)生整合，并積極的參與多巴胺神經(jīng)的環(huán)路重建過程之中，達(dá)到改善腦損傷的目的［12］。BMP4 蛋白屬于形成蛋白家族，可以對神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化產(chǎn)生十分積極的促進(jìn)作用，并對膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的平衡予以有效的調(diào)控［13］。本次研究發(fā)現(xiàn)，BMP4 蛋白和GFAP 蛋白之間具有一定的相關(guān)性，BMP4 蛋白會對GFAP 蛋白的表達(dá)產(chǎn)生一定的影響，說明在經(jīng)過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植之后，對照組大鼠缺血側(cè)腦星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的減少和BMP4 蛋白表達(dá)水平的下降之間存在一定的關(guān)系。

綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后，可以有效減少局灶性腦缺血大鼠的腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的形成，發(fā)揮出細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，減輕腦損傷，且其機(jī)制與BMP4 蛋白表達(dá)水平的下降之間存在一定的關(guān)系。研究也為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療局灶性腦缺血疾病提供了一定的理論依據(jù)，具體問題尚需進(jìn)一步探討。

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