高效液相色譜法同時測定眠安寧合劑中橙皮苷和丹酚酸B 的含量

張玲昂 ，張松亮，劉 弘 (解放軍第15 中心醫(yī)院藥械科，河南 平頂山 467000)

眠安寧合劑為丹參、熟地黃、遠志( 制) 、陳皮、首烏藤、白術(shù)( 麩炒) 和大棗七味中藥組成的復(fù)方制劑，具有養(yǎng)血安神之功效，臨床用于神經(jīng)衰弱性失眠、多夢，心神不寧，貧血頭?！，F(xiàn)收載于中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑( 第十三冊)［1］，現(xiàn)有質(zhì)量標準只有薄層色譜鑒別，為更好控制該藥質(zhì)量，需對其標準進一步研究提高。經(jīng)文獻檢索發(fā)現(xiàn)，尚無對方中兩種成分同時測定的報道，因此，本研究采用高效液相色譜法( high performance liquid chromatography，HPLC) 法同時測定橙皮苷、丹酚酸B 兩種成分的含量，現(xiàn)報告如下。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT 高效液相色譜儀; LC solution 色譜工作站;LC-20ATvp 溶劑輸送泵; SPD-M20A 二極管陣列檢測器; SIL-20A 自動進樣器;SCIENCE AT-330 柱溫箱;島津AUW120D 電子分析天平。丹酚酸B 對照品( 中國藥品生物制品檢定所，批號：111562-200807) ;橙皮苷對照品( 中國藥品生物制品檢定所，批號110721-200613) ;眠安寧合劑自制［批準文號：濟制字(2012) B11003］;甲醇、乙腈均為色譜醇，水為純化水，磷酸、醋酸和甲酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：inertsil ODS-3 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm) ，流動 相： 乙 腈-0.1% 磷 酸 溶 液( V： V = 23： 77) ; 流 速 為1.0 ml/min;柱溫：30 ℃;檢測波長：284 nm;進樣量：10 μl。

2.2 對照品溶液的制備

分別取橙皮苷、丹酚酸B 對照品適量，精密稱定，加甲醇制得濃度分別為360、377.6 μg/ml 的橙皮苷、丹酚酸B 對照品儲備液，分別精密量取兩種儲備液2.5 ～10 ml 的容量瓶中，甲醇定容，搖勻、即為混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取眠安寧合劑5 支，混勻，精密量取1 ml，置50 ml 量瓶中，加甲醇適量，超聲處理5 min，放冷，甲醇定容，搖勻，離心，上清液用0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.4 陰性溶液的制備

按處方比例分別稱取缺丹參與陳皮其他藥材，按制備工藝制備缺丹參、陳皮的陰性樣品，按“2.3”項方法制備陰性樣品溶液。

2.5 干擾試驗

取上述混合對照品溶液、供試品及缺丹參、陳皮陰性對照溶液，按上述色譜條件HPLC 法測定，記錄色譜圖，供試品與對照品在相同保留時間處有目標峰，陰性無干擾，見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

圖1 混合對照品溶液、供試品及缺丹參、陳皮陰性對照溶液的HPLC 圖Fig 1 HPLC of mixed reference substance solution，teat samples and nulli-pericarpium citri reticulatae，nulli-salviae miltiorrhizae negative control solution

精密量取橙皮苷、丹酚酸B混合對照品溶液2、6、10、14、18、22、26 μl，按上述的色譜條件進樣測定，記錄其峰面積。以對照品進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，繪制標準曲線，結(jié)果如下為： 橙皮苷回歸方程為Y=1 310 679X-9 182(r=0.999 7) ，表明橙皮苷進樣量在0.180 ～2.340 μg 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;丹酚酸B 回歸方程為Y=1 170 147X-19 643(r=0.999 9) ，表明丹酚酸B 進樣量在0.189 ～2.454 μg范圍內(nèi)，其線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗

取橙皮苷、丹酚酸B 混合對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)自動進樣5 次，每次10 μl，記錄峰面積，結(jié)果橙皮苷積分值RSD為1.28%(n=5) ，丹酚酸B 積分值RSD為1.08%(n=5) ，表明本方法精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一批號( 批號：140819) 制備成供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，每次10 μl，記錄其峰面積。結(jié)果橙皮苷積分值RSD 為1.24%，丹酚酸B 積分值RSD 為0.93%，表明本方法穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗

取同一批自制樣品( 批號：140819) ，制備供試品溶液，按色譜條件自動進樣6 次。每次10 μl，記錄其峰面積。結(jié)果橙皮苷含量為2.452 3 mg/ml，RSD為1.23%，丹酚酸B 含量為8.287 5 mg/ml，RSD為0.96%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗

精密吸取已知橙皮苷、丹酚酸B 含量的眠安寧合劑( 批號：140819) 樣品0.1 ml，分別精密加入橙皮苷儲備液0.7 ml、丹酚酸B 儲備液2.5 ml，照“2.3”項制備樣品溶液，按上述色譜條件測定橙皮苷、丹酚酸B 含量，計算回收率，見表1。

表1 加樣回收率試驗(n=6)Tab 1 Test results of recovery rate(n=6)

2.11 樣品含量測定

取3 個批號自制樣品，制備供試品溶液，分別吸取供試品和對照品溶液各10 μl 進樣，以外標法測定橙皮苷和丹酚酸B含量，見表2。

3 討論

3.1 指標成分的選擇

丹參方中為君藥，丹酚酸B 為丹參中水溶性成分之一，具有清自由基、抗氧化、抑制血小板聚集等作用［2］，臨床對腦缺血導(dǎo)致的失眠療效較好［3］，且含量較高;橙皮苷為陳皮中主要成分，有降低血管脆性，維持正常血管滲透壓等作用［4］，在臨床上用于抗抑郁治療［5］，陳皮在制備工藝中為70%乙醇浸漬提取，不同于其他六味藥材為水煎。為反映制劑整體質(zhì)量，選擇橙皮苷和丹酚酸B 兩種成分為指標進行分析。

表2 3 批樣品中橙皮苷、丹酚酸B 的含量測定結(jié)果Tab 2 Determination of hesperidin and salvianolic acid B in three batches of samples

3.2 檢測波長的選擇

通過紫外掃描，橙皮苷在284 nm 處有最大吸收，丹酚酸B在286 nm 處有最大吸收，經(jīng)對284 nm 和286 nm 兩波長下丹酚酸B 積分值進行偏差分析，二者無顯著差異，且在284 nm 波長下兩峰形更好，故選擇在284 nm 單波長下檢測。

3.3 色譜條件選擇

經(jīng)查閱文獻，在預(yù)試驗過程中曾考察以下流動相體系： 甲醇-水-醋酸，乙腈-水-磷酸，甲醇-乙腈-甲酸-水; 綜合比較，乙腈-水-磷酸流動相體系，色譜圖峰形良好，目標峰達到良好分離，陰性無干擾［6-12］。

［1］ 中華人民共和國衛(wèi)生部. 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑( 第十三冊) ［S］. 1998：166.

［2］ 袁春平，侯惠民，區(qū)淑蘊. 丹酚酸B 的藥動學(xué)及相關(guān)研究進展［J］.中國新藥雜志，2015，24(7) ：791-799.

［3］ 陳昌勇.HPLC 法測定棗仁安神膠囊中丹酚酸B 的含量［J］. 海峽藥學(xué)，2015，27(3) ：61-63.

［4］ 徐寧寧.正交試驗法優(yōu)化陳皮中橙皮苷的提取工藝研究［J］.景德鎮(zhèn)學(xué)院學(xué)報，2014，29(6) ：40-41.

［5］ 王萌，任曉亮，劉虹.橙皮苷在水溶液中的降解動力學(xué)研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2014，25(9) ：2088-2090.

［6］ 李玉琴，陳磊.高效液相色譜法同時測定通宣理肺丸中橙皮苷和柚皮苷的含量［J］. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31( 23) ：1978-1980.

［7］ 李銘.HPLC 法測定女金片中橙皮苷和黃芩苷的含量［J］. 中國藥師，2012，15(7) ：1032-1033.

［8］ 黃良永，鄭江萍，雷震，等.HPLC 法同時測定利膽排毒口服液中綠原酸、梔子苷和丹酚酸B 的含量［J］. 中國藥師，2012，15(11) ：1562-1564.

［9］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典1 部［S］. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社，2010：959.

［10］ 張新軍，梁瑞雪，侯文靜，等.HPLC 法測定痛經(jīng)停膏中丹酚酸B的含量［J］.藥學(xué)研究，2014，33(12) ：689-690，695.

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