• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    MGMT 與腦膠質(zhì)瘤相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究

    2015-01-08 08:11:38張露勇羅菲亞胡培麗中國食品藥品檢定研究院食品化妝品所北京00050中日友好醫(yī)院神經(jīng)外科北京00029
    關(guān)鍵詞:膠質(zhì)瘤甲基化腦組織

    張露勇 ,羅菲亞,胡培麗,單 純,李 銳(.中國食品藥品檢定研究院食品化妝品所,北京 00050;2.中日友好醫(yī)院神經(jīng)外科,北京 00029)

    腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤,來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,起源于神經(jīng)外胚層。膠質(zhì)瘤發(fā)病率高,約占顱內(nèi)腫瘤的35%~61%[1],且近年來還有不斷增加的趨勢[2]。膠質(zhì)瘤呈彌漫性浸潤性生長,與周圍正常腦組織無明顯界限,難以手術(shù)切除,因而術(shù)后的復(fù)發(fā)率高。以手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)藥物治療等組成的綜合治療體系是目前腦膠質(zhì)瘤治療的主要方法[3]。由于其復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn),化療對于抑制腫瘤的復(fù)發(fā)具有十分重要的作用[4],但并非所有的患者均可獲得很好的化療效果,化療藥物的耐藥是膠質(zhì)瘤治療失敗的原因之一。因此,克服耐藥性是提高腦膠質(zhì)瘤患者生存率的關(guān)鍵。

    DNA 修復(fù)蛋白O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine DNA-methyltransferase,MGMT)基因是常見的針對烷類化療藥的耐藥基因,它在腦膠質(zhì)瘤組織中的增多與腫瘤耐藥性有關(guān)。MGMT 蛋白是一種DNA 直接修復(fù)酶,能修復(fù)DNA 序列中的O6-甲基鳥嘌呤損傷。但是有研究證實(shí),如果其DNA 修復(fù)能力增強(qiáng),腫瘤易感性降低,則對化療可能存在抵抗作用[5]。MGMT 蛋白的表達(dá)主要受啟動子甲基化的調(diào)控,啟動子甲基化可以下調(diào)其基因轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MGMT 蛋白表達(dá)的下降,反之啟動子去甲基化則可以增加蛋白的表達(dá),從而使得腫瘤細(xì)胞對烷類化療藥產(chǎn)生耐藥性[6]。由此可以提出假設(shè),若能在化療前檢測腦膠質(zhì)瘤的耐藥基因,則能識別化療有效的人群,從而提高膠質(zhì)瘤的療效。

    本研究采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)方法檢測MGMT 在膠質(zhì)瘤及正常腦組織中的表達(dá);采用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR,MSP)測定的方法檢測MGMT 基因啟動子甲基化與MGMT 蛋白表達(dá)的相關(guān)性,系統(tǒng)分析MGMT 與腫瘤惡性程度的關(guān)系,與膠質(zhì)瘤患者的年齡、性別之間的關(guān)系,以期為腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、腫瘤耐藥性機(jī)制及臨床診治提供一定的理論依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    隨機(jī)收集中日友好醫(yī)院神經(jīng)外科2010 年7 月至2014 年7 月術(shù)中切除的病理診斷為腦膠質(zhì)瘤的石蠟包埋組織標(biāo)本共計45 例,并按照2007 年WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(Ⅰ~Ⅳ),所有病例術(shù)前均未行放化療,也無身體其他部位的腫瘤。45 例標(biāo)本中,男性25 例,年齡20~71 歲,平均年齡42.48 歲;女性20 例,年齡19~72 歲,平均年齡40.21歲。正常腦組織11 例,均為因腦動靜脈畸形行手術(shù)切除的正常腦組織以及腫瘤周圍正常腦組織,作為對照組。

    1.2 研究方法

    1.2.1 免疫組織化學(xué)(IHC)檢測:本研究采用S-P 免疫組織化學(xué)染色法對腦膠質(zhì)瘤組及正常腦組織組進(jìn)行染色,其步驟大致分為石蠟切片的制備、HE 染色及IHC 檢測。其染色結(jié)果按照Krajewska 法進(jìn)行半定量分析:高倍鏡(×400)下隨機(jī)計數(shù)5 個視野陽性細(xì)胞,陽性細(xì)胞≤4%為0 分、5%~24%為1 分、25%~49%為2 分、50%~74%為3 分、≥75%為4 分;染色強(qiáng)度:無色為0 分、1~4 分為弱陽性(+)、5~8 分為中等陽性(+ +)、9~12 分為強(qiáng)陽性(+ + +)。

    1.2.2 甲基化特異性PCR(MSP)測定: 其步驟大致分為DNA 的提取、DNA 亞硫酸氫鈉的修飾及甲基化特異性PCR。其結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為:MGMT 甲基化基因(MGMT methylation gene,MGMT-M)表達(dá)陽性或MGMT-M 和MGMT 去甲基化基因(MGMT demethylation gene,MGMT-D)同時表達(dá)陽性為甲基化;MGMT-D 表達(dá)陽性為去甲基化。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    本研究所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理,采取χ2檢驗(yàn)分析的方法,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 MGMT 在腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達(dá)情況

    45 例腦膠質(zhì)瘤中20 例MGMT 蛋白表達(dá)為陽性,陽性表達(dá)率為44.44%(20/45),而11 例腦動靜脈畸形腦組織中只有1 例MGMT 的表達(dá)為陽性,陽性表達(dá)率為9.09%(1/11)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,二者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.714,P=0.030,即P<0.05)。

    2.2 MGMT 在不同級別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況

    MGMT 在不同級別的腦膠質(zhì)瘤中均有表達(dá),具體表達(dá)情況如下:Ⅰ級陽性率為57.14%(4/7),Ⅱ級陽性率為40.00%(4/10),Ⅲ級陽性率為43.75% (7/16),Ⅳ級陽性率為50.00%(6/12)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),不同級別膠質(zhì)瘤之間的MGMT 表 達(dá) 差 異 無 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義(χ2= 0.596,P= 0.897 >0.05)。

    2.3 腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT 的表達(dá)與性別及年齡的相關(guān)性

    MGMT 在男性中表達(dá)陽性率為56.00%(14/25),在女性中表達(dá)陽性率為45.00%(9/20),經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析男、女性別組間MGMT 表達(dá)陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.538,P=0.463,即P>0.05);MGMT 在≥40 歲年齡組中表達(dá)陽性率為54.17%(13/24),在<40 歲年齡組中表達(dá)陽性率為47.62%(10/21),經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析上述不同年齡組間MGMT 表達(dá)陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.192,P=0.661 >0.05)。

    2.4 MGMT 基因啟動子甲基化與蛋白表達(dá)的相關(guān)性

    MGMT 基因啟動子甲基化發(fā)生率為57.78%(26/45),其中蛋白表達(dá)陽性組中,甲基化的發(fā)生率為38.89%(7/18),蛋白表達(dá)陰性組中,甲基化的發(fā)生率為70.37%(19/27),2 組比較,MGMT 基因啟動子甲基化發(fā)生率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.388,P=0.036 <0.05)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),MGMT 蛋白表達(dá)與MGMT 基因啟動子甲基化存在負(fù)相關(guān),見表1。

    表1 MGMT 基因啟動子甲基化與蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析Tab 1 Correlation of MGMT gene promoter methylation with protein expression

    2.5 不同級別腦膠質(zhì)瘤中MGMT 基因啟動子甲基化的表達(dá)

    腦膠質(zhì)瘤MGMT 基因啟動子甲基化發(fā)生率及不同腫瘤級別甲基化陽性率見表2。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),不同級別膠質(zhì)瘤之間的MGMT 基因啟動子甲基化的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.277,P=0.153 >0.05)。

    3 討論

    膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤,來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,具有高度侵襲性,呈彌漫性浸潤生長,約占顱內(nèi)腫瘤的50%~60%,國內(nèi)報道占原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的40%[7]。世界衛(wèi)生組織2007 年根據(jù)腫瘤的組織學(xué)及病理學(xué)因素將腫瘤分為Ⅰ~Ⅳ級,低級別膠質(zhì)瘤的治療方法以手術(shù)切除為主,術(shù)后輔以放療。高級別膠質(zhì)瘤手術(shù)切除后容易復(fù)發(fā),且難以大范圍地切除,對射線的敏感性低,普通化療藥物也難以通過血腦屏障。即使聯(lián)合治療,其中未復(fù)發(fā)時間也僅有21 個月[8]?;熓菒盒阅z質(zhì)瘤常規(guī)治療手段之一,在延長患者的生存方面有十分重要的作用。替莫唑胺是第2 代烷化劑,目前被作為膠質(zhì)瘤化療的一線用藥。其作用靶點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞的DNA 上,當(dāng)腫瘤細(xì)胞的DNA 修復(fù)能力增強(qiáng)時,就會產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象,耐藥性的產(chǎn)生限制了烷化劑的臨床應(yīng)用,所有膠質(zhì)瘤化療效果不佳的根本原因是腫瘤耐藥[9]。MGMT 是DNA修復(fù)基因中的一部分,其在體內(nèi)是否表達(dá)及表達(dá)的強(qiáng)度影響著療效,而MGMT 蛋白的表達(dá)強(qiáng)度又與MGMT 啟動子甲基化有關(guān)[10]。本研究通過檢測腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT 的表達(dá)情況,為腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和耐藥機(jī)制提供依據(jù),為腫瘤患者個體化治療選擇合理的方案提供參考。

    表2 不同級別腦膠質(zhì)瘤中MGMT 基因啟動子甲基化的表達(dá)Tab 2 MGMT gene promoter methylation expression in different grade of gliomas

    MGMT 蛋白是一種高效的DNA 直接修復(fù)酶,能修復(fù)DNA序列中的O6-甲基鳥嘌呤,正常組織中有一定水平的MGMT 表達(dá),其存在可抑制突變的發(fā)生和原癌基因的活化,是機(jī)體抵抗烷化劑損傷的主要因素[11]。MGMT 既是抗癌基因又是耐藥基因,如果其DNA 修復(fù)能力增強(qiáng),腫瘤易感性降低,則對化療可能存在抵抗作用。在本研究中,11 例正常腦組織中有1 例MGMT 表達(dá)陽性,陽性率為9.09%。45 例腦膠質(zhì)瘤中有20 例MGMT 蛋白有陽性表達(dá),陽性率為44.44%,顯著高于正常腦組織(P<0.05)。有研究表明,MGMT 在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與腫瘤耐藥性有一定聯(lián)系,可能影響患者的預(yù)后,MGMT 表達(dá)陰性的患者烷化劑藥物的近期療效和生存時間明顯優(yōu)于MGMT 表達(dá)陽性的患者[12]。

    由本研究可以看出,MGMT 在不同級別的膠質(zhì)瘤中表達(dá)雖然有所不同,Ⅰ級陽性率為57.14%,Ⅱ級陽性率為40.00%,Ⅲ級陽性率為43.75%,Ⅳ級陽性率為50.00%,但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),因此可以粗略得出,MGMT 的表達(dá)與腫瘤的惡性程度之間并無關(guān)系,這與Esteller 等[13]研究得出的結(jié)論相一致。但是也有學(xué)者認(rèn)為,腦膠質(zhì)瘤MGMT 的表達(dá)與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)[14-15]。造成這些不同結(jié)論的原因可能與免疫組織化學(xué)的檢測方法、樣本量的多少等因素有關(guān),進(jìn)一步證實(shí)尚需大樣本的臨床研究支持。

    本研究也分析了性別及年齡的因素與MGMT 表達(dá)的相關(guān)性,結(jié)果顯示,MGMT 在男性中表達(dá)陽性率為56.00%,在女性中表達(dá)陽性率為45.00%,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析2 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);MGMT 在≥40 歲年齡組中表達(dá)陽性率為54.17%,在<40 歲年齡組中表達(dá)陽性率為47.62%,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析2 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這與Esteller M等[16]報道的結(jié)果相一致。因此本組認(rèn)為,臨床上為腦膠質(zhì)瘤患者制訂個體化化療方案時,性別及年齡不能作為單獨(dú)的參考因素。

    有研究指出,MGMT 基因啟動子去甲基化會導(dǎo)致MGMT 蛋白表達(dá)的增加,這是烷化劑耐藥的主要原因。由此可以推斷出,基因啟動子甲基化的檢測可能成為預(yù)測腫瘤對烷化劑化療藥敏感性的標(biāo)志[17]。本研究的45 例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中,18 例MGMT 蛋白表達(dá)陽性,其中甲基化的7 例;27 例MGMT 蛋白表達(dá)陽性,其中甲基化的19 例。MGMT 蛋白表達(dá)與MGMT 基因啟動子甲基化存在負(fù)相關(guān)(P<0.05)。MGMT 基因啟動子甲基化發(fā)生率為57.78%,且不同級別膠質(zhì)瘤中甲基化的表達(dá)無明顯差異(P<0.05)。有研究報道[18]腦膠質(zhì)瘤組織與血清中MGMT 基因啟動子甲基化的情況具有一致性,因此測量血清中MGMT 基因啟動子甲基化的情況,既可以避免穿刺活檢的有創(chuàng)風(fēng)險,又可以達(dá)到對腫瘤早期診斷的目的。

    腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織中MGMT 的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。MGMT 在不同膠質(zhì)瘤中的表達(dá)不同,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明MGMT 的表達(dá)與腫瘤的惡性程度無相關(guān)性,但與烷化劑耐藥有關(guān)。MGMT 在性別及年齡之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,故臨床上為患者制訂個性化治療方案時,不能單獨(dú)考慮性別、年齡的因素。MGMT 基因啟動子甲基化與MGMT的表達(dá)關(guān)系密切,使用烷化劑化療前測定腫瘤細(xì)胞的MGMT活性具有一定的指導(dǎo)意義。

    [1] Hargrave DR,Zacharoulis S. Pediatrie CNS tumors:current treatment and future directions[J]. Expert Rev Neurother,2007,7(8):1029-1042.

    [2] Ohgaki H,Kleihues P. Epidemiology and etiology of gliomas[J].Acta Neuropathologica,2005,109(1):93-108.

    [3] Kesari S,Ramakrishna N,Sauvageot C,et al. Targeted molecular therapy of malignant gliomas[J].Curr Neurol Neurosci Rep,2005,5(3):186-197.

    [4] Westphal M,Hilt DC,Bortey E,et al. A phase 3 trial of local chemotherapy with biodegradable carmustine (BCNU) wafers(Gliadel wafers)in patients with primary malignant glioma[J].Neuro Oncol,2003,5(2):79-88.

    [5] Wei Q,F(xiàn)razier ML,Levin B. DNA Repair:a double-edged sword[J].J Natl Cancer Inst,2000,92(6):440-441.

    [6] 鄭長青,季守平,宮鋒,等. MGMT 基因啟動子甲基化檢測在腦膠質(zhì)瘤化療中的意義[J].癌癥,2009,28(6):575-580.

    [7] 陳忠平.神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤[M].北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,2009:1-11.

    [8] 傅浩,楊靈,萬林林.放療聯(lián)合替莫唑胺治療惡性膠質(zhì)瘤術(shù)后患者的臨床研究[J].實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床,2010,10(4):8-10.

    [9] 徐麗,崔云,李桂林,等.腦膠質(zhì)瘤組織MGMT 和Ki-67 表達(dá)對患者預(yù)后的影響[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2009,30(3):285-288.

    [10] Liu L,Gerson SL. Targeted modulation of MGMT:clinical implications[J].Clin Cancer Res,2006,12(2):328-331.

    [11] Belanich M,Randall T,Pastor MA,et al. Intracellular localization and interacellular heterogeneity of the human DNA repair protein O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase[J]. Cancer Chemother Pharmacol,1996,37(6):547-555.

    [12] 鄭長青,季守平,宮鋒,等. MGMT、hML H1 和Hmsh2 基因啟動子甲基化狀態(tài)對腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響[J]. 山東醫(yī)藥,2009,49(1):23-25.

    [13] Esteller M,Garcia-Foncillas J,Andion E,et al. Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents[J].N Engl J Med,2000,343(19):1350-1354.

    [14] Sun YH,Zhang YZ,Wang ZC,et al. Relationship between the expression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase in glioma and the survival time of patients[J].Ai Zheng,2004,23(9):1052-1055.

    [15] Tanaka S,Kobayashi I,Oka H,et al.Drug-resistance gene expression and progression of astrocytic tumors[J].Brain Tumor Pathol,2001,18(2):131-137.

    [16] Esteller M,Hamilton SR,Burger PC,et al. Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is a common event in primary human neoplasia[J].Cancer Res,1999,59(4):793-797.

    [17] 李杰飛,孫彥輝,劉福生,等. 腦膠質(zhì)瘤O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶啟動區(qū)甲基化及表達(dá)異質(zhì)性的研究[J]. 中國腫瘤臨床與康復(fù),2011,18(5):385-389.

    [18] 高薇,王之敏,周岱,等.DNA 修復(fù)基因MGMT 啟動子區(qū)過甲基化與腦膠質(zhì)瘤[J].江蘇醫(yī)藥,2008,34(1):26-28.

    猜你喜歡
    膠質(zhì)瘤甲基化腦組織
    小腦組織壓片快速制作在組織學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用
    芒果苷對自發(fā)性高血壓大鼠腦組織炎癥損傷的保護(hù)作用
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    DCE-MRI在高、低級別腦膠質(zhì)瘤及腦膜瘤中的鑒別診斷
    磁共振成像(2015年8期)2015-12-23 08:53:14
    DNA雙加氧酶TET2在老年癡呆動物模型腦組織中的表達(dá)及其對氧化應(yīng)激中神經(jīng)元的保護(hù)作用
    P21和survivin蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義
    Sox2和Oct4在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及意義
    2,4-二氯苯氧乙酸對子代大鼠發(fā)育及腦組織的氧化損傷作用
    鼻咽癌組織中SYK基因啟動子區(qū)的甲基化分析
    胃癌DNA甲基化研究進(jìn)展
    99mTc-HL91乏氧顯像在惡性腦膠質(zhì)瘤放療前后的變化觀察
    中文天堂在线官网| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久久色成人| 成年av动漫网址| 中国美白少妇内射xxxbb| 日本免费在线观看一区| 少妇丰满av| 欧美一区二区国产精品久久精品| 99九九线精品视频在线观看视频| 日本欧美国产在线视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲色图av天堂| 边亲边吃奶的免费视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产精品福利在线免费观看| 国产三级中文精品| 国产三级中文精品| 日本与韩国留学比较| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲av免费在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 免费看光身美女| 少妇熟女aⅴ在线视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲欧美日韩无卡精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美精品一区二区大全| 中文亚洲av片在线观看爽| 欧美日韩综合久久久久久| 欧美区成人在线视频| 欧美精品一区二区大全| 日本与韩国留学比较| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲av男天堂| 九色成人免费人妻av| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久人人爽人人爽人人片va| 男女国产视频网站| 插阴视频在线观看视频| 欧美3d第一页| 女人被狂操c到高潮| 18+在线观看网站| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 天堂√8在线中文| 老司机影院成人| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 国产精品永久免费网站| 在线天堂最新版资源| 七月丁香在线播放| 久久国内精品自在自线图片| 久久久精品大字幕| 国产免费福利视频在线观看| 高清av免费在线| 1024手机看黄色片| av专区在线播放| ponron亚洲| 男女边吃奶边做爰视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 日韩视频在线欧美| 欧美一区二区精品小视频在线| 99在线人妻在线中文字幕| 男人和女人高潮做爰伦理| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 小说图片视频综合网站| 精品久久久久久电影网 | 国产伦理片在线播放av一区| 日本色播在线视频| 日本av手机在线免费观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产伦一二天堂av在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 99久久人妻综合| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品一及| 国产淫片久久久久久久久| 99热精品在线国产| 只有这里有精品99| 两个人视频免费观看高清| 成人鲁丝片一二三区免费| av专区在线播放| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品福利在线免费观看| 两个人视频免费观看高清| 亚洲人成网站在线播| 99久久九九国产精品国产免费| 最新中文字幕久久久久| 一边摸一边抽搐一进一小说| 夜夜爽夜夜爽视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美3d第一页| 99久久九九国产精品国产免费| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 我要搜黄色片| 欧美极品一区二区三区四区| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产亚洲91精品色在线| 在线免费观看不下载黄p国产| 91狼人影院| av免费观看日本| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产成人a区在线观看| 22中文网久久字幕| 免费大片18禁| 国产乱人偷精品视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲国产欧美在线一区| 99热6这里只有精品| 国产伦理片在线播放av一区| 成人国产麻豆网| 最后的刺客免费高清国语| 国产成人a区在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美性感艳星| 色尼玛亚洲综合影院| 国产极品精品免费视频能看的| 床上黄色一级片| 一级黄片播放器| 免费看光身美女| 免费av毛片视频| 1024手机看黄色片| 国产午夜精品论理片| 久久久久精品久久久久真实原创| 99久久精品国产国产毛片| 成人欧美大片| 成人三级黄色视频| 午夜福利视频1000在线观看| 免费av观看视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 免费搜索国产男女视频| 成人综合一区亚洲| 神马国产精品三级电影在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 国产av一区在线观看免费| 国产免费福利视频在线观看| 青青草视频在线视频观看| 午夜福利成人在线免费观看| av在线蜜桃| 国产高清国产精品国产三级 | 我的女老师完整版在线观看| 能在线免费观看的黄片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 寂寞人妻少妇视频99o| 99热网站在线观看| 国产av不卡久久| 高清av免费在线| 视频中文字幕在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 又爽又黄无遮挡网站| 成人一区二区视频在线观看| 日本熟妇午夜| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久99热这里只有精品18| 成人漫画全彩无遮挡| av女优亚洲男人天堂| videos熟女内射| 免费看光身美女| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产成人精品婷婷| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 国产av在哪里看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 啦啦啦韩国在线观看视频| 免费看a级黄色片| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产色婷婷99| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品人妻久久久久久| 在线观看一区二区三区| 在线免费十八禁| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲精品色激情综合| 秋霞在线观看毛片| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 久久久久九九精品影院| 91狼人影院| 七月丁香在线播放| 成人鲁丝片一二三区免费| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 国产人妻一区二区三区在| 国产免费男女视频| 久久精品影院6| 久久草成人影院| 全区人妻精品视频| 免费观看人在逋| 久久人妻av系列| 国产av在哪里看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 日韩成人伦理影院| 亚洲精品乱久久久久久| 极品教师在线视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 一区二区三区四区激情视频| 99热精品在线国产| eeuss影院久久| 精品欧美国产一区二区三| 国产成人精品一,二区| 高清在线视频一区二区三区 | 欧美成人午夜免费资源| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产av码专区亚洲av| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久久久久久午夜电影| 男人的好看免费观看在线视频| 免费看日本二区| 在线播放无遮挡| 国产亚洲5aaaaa淫片| 一级毛片电影观看 | 亚洲成av人片在线播放无| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品一区二区三区四区久久| 99久国产av精品国产电影| 精品久久久噜噜| 日韩欧美 国产精品| 国产一区二区在线观看日韩| 99九九线精品视频在线观看视频| 嘟嘟电影网在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 国产高清有码在线观看视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 中文字幕制服av| 国产乱人视频| 久久久久九九精品影院| 大香蕉久久网| 一级二级三级毛片免费看| 观看免费一级毛片| 国产不卡一卡二| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 中文亚洲av片在线观看爽| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | av视频在线观看入口| 可以在线观看毛片的网站| 久久久久精品久久久久真实原创| 日本黄色片子视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲四区av| 欧美激情久久久久久爽电影| 最近视频中文字幕2019在线8| videos熟女内射| 美女大奶头视频| 久久久久网色| 国产黄片美女视频| 一级毛片久久久久久久久女| 麻豆一二三区av精品| 免费av毛片视频| 婷婷色av中文字幕| 欧美又色又爽又黄视频| 99在线视频只有这里精品首页| h日本视频在线播放| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 十八禁国产超污无遮挡网站| 日韩制服骚丝袜av| 老司机福利观看| 91久久精品电影网| 天天躁日日操中文字幕| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产亚洲最大av| 观看免费一级毛片| 99久久精品热视频| 欧美极品一区二区三区四区| 国产一区二区三区av在线| av女优亚洲男人天堂| 夫妻性生交免费视频一级片| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久久久久久久中文| 国产私拍福利视频在线观看| 国产久久久一区二区三区| 午夜福利在线在线| 久99久视频精品免费| 人体艺术视频欧美日本| 久久精品久久精品一区二区三区| av在线亚洲专区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲不卡免费看| 亚洲精品,欧美精品| 久久久久网色| 国内精品美女久久久久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产免费男女视频| 深爱激情五月婷婷| 青春草视频在线免费观看| 亚洲伊人久久精品综合 | 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 男人的好看免费观看在线视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 一夜夜www| kizo精华| 男女国产视频网站| 赤兔流量卡办理| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 美女大奶头视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 91精品一卡2卡3卡4卡| 日本熟妇午夜| 久久这里有精品视频免费| 高清午夜精品一区二区三区| 久久久精品94久久精品| 日本三级黄在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产精品熟女久久久久浪| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产高潮美女av| 中文字幕熟女人妻在线| 嘟嘟电影网在线观看| 久久久欧美国产精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲内射少妇av| 久久久久九九精品影院| 秋霞伦理黄片| 久久精品国产自在天天线| 禁无遮挡网站| 欧美日本视频| 久久这里只有精品中国| 亚洲最大成人手机在线| 日韩欧美在线乱码| 久久亚洲精品不卡| 国产麻豆成人av免费视频| 黄色一级大片看看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美日韩在线观看h| 99热6这里只有精品| 精品人妻偷拍中文字幕| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品综合久久久久久久免费| 午夜爱爱视频在线播放| 日韩一本色道免费dvd| 男人和女人高潮做爰伦理| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| av国产久精品久网站免费入址| 国产精品国产高清国产av| 搡老妇女老女人老熟妇| 看免费成人av毛片| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲欧美日韩东京热| 偷拍熟女少妇极品色| 国产精品不卡视频一区二区| 国国产精品蜜臀av免费| kizo精华| 综合色丁香网| 国产毛片a区久久久久| 天美传媒精品一区二区| 亚洲在久久综合| 成人漫画全彩无遮挡| 国产精品不卡视频一区二区| 综合色丁香网| 精品酒店卫生间| 亚洲国产精品成人综合色| 一个人看视频在线观看www免费| 久久久精品欧美日韩精品| 免费av观看视频| or卡值多少钱| 亚洲无线观看免费| 天美传媒精品一区二区| 精品酒店卫生间| 亚洲欧洲国产日韩| 精品无人区乱码1区二区| 男人舔奶头视频| 99热全是精品| 少妇人妻一区二区三区视频| 99久国产av精品| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产亚洲一区二区精品| 深夜a级毛片| 色视频www国产| 蜜臀久久99精品久久宅男| 麻豆乱淫一区二区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 91精品国产九色| 精华霜和精华液先用哪个| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产成人精品婷婷| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 欧美bdsm另类| av黄色大香蕉| 精品午夜福利在线看| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日韩欧美在线乱码| 一夜夜www| 国产毛片a区久久久久| 男女视频在线观看网站免费| 日本免费在线观看一区| 国产真实乱freesex| 久久精品人妻少妇| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久精品久久久久久久性| 美女大奶头视频| 国产91av在线免费观看| 亚洲综合色惰| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 亚洲av熟女| 国产精品一区二区在线观看99 | 国产精品嫩草影院av在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| a级毛色黄片| 美女大奶头视频| 99热这里只有精品一区| 国产私拍福利视频在线观看| 成人欧美大片| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 免费大片18禁| 国产成人一区二区在线| 床上黄色一级片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日韩欧美三级三区| 日韩一区二区视频免费看| 久久久精品欧美日韩精品| 国产探花极品一区二区| 国模一区二区三区四区视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 午夜福利成人在线免费观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 成人综合一区亚洲| 乱人视频在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲色图av天堂| 男人的好看免费观看在线视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 99热6这里只有精品| 国产 一区精品| 国产91av在线免费观看| 久久久久久久久久黄片| 波多野结衣巨乳人妻| 视频中文字幕在线观看| 亚洲成人av在线免费| 毛片女人毛片| 日韩av在线免费看完整版不卡| 超碰97精品在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 99热这里只有是精品50| 最近视频中文字幕2019在线8| 看免费成人av毛片| 午夜福利视频1000在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲av免费在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 校园人妻丝袜中文字幕| 简卡轻食公司| 中文欧美无线码| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品一区二区三区四区久久| 久久亚洲国产成人精品v| 一区二区三区四区激情视频| 成年女人看的毛片在线观看| 三级毛片av免费| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲av成人精品一区久久| 日韩强制内射视频| 黄色一级大片看看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 成人美女网站在线观看视频| 成人漫画全彩无遮挡| 看十八女毛片水多多多| 麻豆成人午夜福利视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| av黄色大香蕉| 91久久精品国产一区二区三区| 看免费成人av毛片| 午夜精品在线福利| 日本五十路高清| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产亚洲91精品色在线| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产精品久久视频播放| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 一级av片app| 美女黄网站色视频| 久久亚洲国产成人精品v| 性插视频无遮挡在线免费观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久久久性生活片| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品野战在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 国内精品美女久久久久久| 欧美丝袜亚洲另类| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美潮喷喷水| 一二三四中文在线观看免费高清| 身体一侧抽搐| 免费看日本二区| 亚州av有码| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲18禁久久av| 一级毛片aaaaaa免费看小| 七月丁香在线播放| 99久久人妻综合| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 午夜激情欧美在线| 久久久午夜欧美精品| 国产乱来视频区| 日韩av不卡免费在线播放| 久久久久网色| 亚洲av日韩在线播放| 99在线视频只有这里精品首页| 国产免费一级a男人的天堂| 在现免费观看毛片| 免费观看在线日韩| 久久午夜福利片| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲国产色片| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 亚洲av福利一区| 日韩视频在线欧美| 亚洲内射少妇av| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美精品国产亚洲| 久久这里有精品视频免费| 丰满乱子伦码专区| 在线播放无遮挡| 观看美女的网站| 亚洲欧美日韩东京热| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲成色77777| 午夜福利视频1000在线观看| 精品一区二区三区人妻视频| 成人性生交大片免费视频hd| 蜜臀久久99精品久久宅男| av黄色大香蕉| 偷拍熟女少妇极品色| 精品熟女少妇av免费看| 国产精品伦人一区二区| 天堂√8在线中文| 大香蕉久久网| 最近的中文字幕免费完整| 精品一区二区免费观看| 日韩欧美在线乱码| 亚洲精品国产av成人精品| 久久99蜜桃精品久久| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产黄片视频在线免费观看| 身体一侧抽搐| 99热这里只有精品一区| 综合色av麻豆| 全区人妻精品视频| 国产精品伦人一区二区| 变态另类丝袜制服| 少妇高潮的动态图| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲av.av天堂| 色5月婷婷丁香| 2021少妇久久久久久久久久久| 日本午夜av视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 毛片一级片免费看久久久久| 精品人妻偷拍中文字幕| 级片在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 日本免费一区二区三区高清不卡| 高清在线视频一区二区三区 | 国产精品野战在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| av播播在线观看一区| 日韩视频在线欧美| 天天躁日日操中文字幕| 只有这里有精品99| 国产免费又黄又爽又色| 99久久无色码亚洲精品果冻| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产成人a区在线观看| 一夜夜www| 久久久亚洲精品成人影院| 久久久久久久久久久丰满| 免费大片18禁| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产乱人偷精品视频| 观看美女的网站| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 观看美女的网站| 亚洲,欧美,日韩| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产一区二区在线观看日韩| 国产又色又爽无遮挡免| 久久久久九九精品影院| 国产一区二区在线观看日韩| 日韩欧美在线乱码| 在现免费观看毛片| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美成人a在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 国产欧美日韩精品一区二区| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲精品,欧美精品| 成人一区二区视频在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 精品久久久久久久久亚洲| 日韩在线高清观看一区二区三区|