慢性間歇性缺氧狀態(tài)舌下神經(jīng)核5-HT及5-HT 2A受體的變化*

張敏娟焦成嚴(yán)降雨李靜殷敏程雷

慢性間歇性缺氧狀態(tài)舌下神經(jīng)核5-HT及5-HT 2A受體的變化*

張敏娟1焦成1嚴(yán)降雨1李靜1殷敏1程雷1

目的觀察慢性間歇性缺氧（chronic intermittent hypoxia,CIH）大鼠舌下運動神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)變化，及其相應(yīng)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT及5-HT 2A受體和C-fos表達(dá)量的變化。方法將12只雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（8周齡，體重180～200 g）隨機(jī)均分為CIH組和常氧對照組。CIH組低氧條件為艙內(nèi)氧濃度在5%-21%之間循環(huán)，對照組氧濃度維持在21%。5周后觀察舌下運動神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)改變、舌下神經(jīng)核神經(jīng)遞質(zhì)5-HT及5-HT 2A受體和C-fos的表達(dá)量。結(jié)果尼氏染色顯示CIH組尼氏小體崩解，細(xì)胞質(zhì)著色變淺。免疫組化顯示CIH組5-HT、5-HT 2A受體和C-fos的表達(dá)量均高于對照組（P＜0.05）。結(jié)論CIH導(dǎo)致5-HT及其結(jié)合位點5-HT 2A受體表達(dá)上調(diào)，使得舌下神經(jīng)核對頦舌肌支配加強(qiáng)，頦舌肌活性增高，從而在清醒狀態(tài)下維持咽腔開放。

阻塞性睡眠呼吸暫停；慢性間歇性缺氧；5-HT；5-HT 2A受體

阻塞性睡眠呼吸暫停（Obstructive Sleep Apnea，OSA）是以夜間反復(fù)發(fā)生上氣道狹窄或塌陷為特征，導(dǎo)致上氣道通氣量減少或呼吸暫停、血氧飽和度下降和睡眠片段化[1-3]。在覺醒狀態(tài)下,通過磁共振成像技術(shù)以及纖維喉鏡檢查結(jié)合Müller檢查法發(fā)現(xiàn),與正常人相比OSA患者的腭咽、舌咽橫截面積相對較小，狹窄平面主要位于軟腭后區(qū)以及舌后區(qū)[4,5]。由于咽部主要由肌肉和結(jié)締組織組成,缺少足夠的骨性結(jié)構(gòu)支撐，這部分氣道的開放主要依賴咽部擴(kuò)張肌的收縮,尤其是頦舌肌。頦舌肌是上氣道中最大的也是最主要的擴(kuò)張肌，對OSA患者維持上氣道開放起著重要作用[4]。

有研究證實在清醒狀態(tài)下，OSA患者與健康正常人相比產(chǎn)生更高的上氣道擴(kuò)張肌活性[3,6,7]。Saboisky等[8]比較了OSAHS患者與正常人覺醒時頦舌肌的肌電活動,發(fā)現(xiàn)OSAHS患者的頦舌肌運動單位的動作電位區(qū)域較正常人大,維持時間也更久,得出OSAHS患者在覺醒狀態(tài)時的確存在增大的頦舌肌肌肉活性，而且指出舌下神經(jīng)核對頦舌肌的神經(jīng)支配可能發(fā)生了改變。在睡眠呼吸暫停患者中，頦舌肌電活性的增高被認(rèn)為是上氣道解剖性狹窄狀態(tài)的代償機(jī)制，用來維持上氣道的開放[1,9]。而在睡眠時頦舌肌活性的的喪失是OSA患者上氣道塌陷進(jìn)展過程中的主要因素[1,10]。那么為什么OSA患者在清醒狀態(tài)下上氣道肌肉的活動性會升高，答案還不是很明確。如果頦舌肌的活性下降，那么將導(dǎo)致咽腔狹窄，咽腔狹窄會導(dǎo)致上呼吸道狹窄，則最終會導(dǎo)致OSA。解剖學(xué)顯示頦舌肌主要由舌下神經(jīng)核發(fā)出的傳出纖維舌下神經(jīng)（hypoglossal nerve）支配，舌下神經(jīng)運動核的興奮會使頦舌肌收縮而開放咽腔。同時有研究證實5-HT能興奮舌下運動神經(jīng)核[11,12]，增強(qiáng)舌下運動神經(jīng)核對頦舌肌的支配而使頦舌肌活動性增加，5-HT對舌下神經(jīng)核的支配具有狀態(tài)依賴性，覺醒時活性最高，非快動眼睡眠期活性居中，在快動眼睡眠期活性最小甚至缺失[13,14]。慢性間歇性低氧（CIH）是OSA的主要病理生理特征[15]。在CIH動物模型中，動物出現(xiàn)了OSA患者典型癥狀以及動脈高血壓、代謝紊亂、警覺性下降和認(rèn)知功能損害。在本次實驗中，我們檢測在CIH后，清醒大鼠舌下神經(jīng)運動核興奮性神經(jīng)遞質(zhì)5-HT及其相關(guān)物質(zhì)變化，探討代償性上呼吸道擴(kuò)張肌活性增加的可能中樞神經(jīng)肌肉機(jī)制。

材料和方法

1 動物和造模

12只清潔級健康成年雄性 Sprague Dawley（SD）大鼠（8周齡，體重180～200g），由江蘇省動物實驗中心提供，采用隨機(jī)數(shù)字法均分為間歇性低氧組（CIH組）和常氧對照組（Control組）。每天8:30至16:30將CIH組實驗動物置于低氧艙中飼養(yǎng)， 循環(huán)交替給予氮氣和壓縮空氣，同時用測氧儀檢測艙內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)變化。每一循環(huán)120s：前60s給予氮氣，使艙內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)逐漸降至5%，接著60s給予壓縮空氣，使艙內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)逐漸恢復(fù)至21%，保證艙內(nèi)氧濃度在5%～21%之間循環(huán)。對照組在常壓、大氣環(huán)境培養(yǎng)艙中飼養(yǎng)，艙內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)維持在21%。實驗結(jié)束將動物取出，送入常規(guī)飼養(yǎng)箱中，自由進(jìn)食、水，生活環(huán)境及飼養(yǎng)條件相同。每天實驗8小時，持續(xù)35天。本實驗方案由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2 實驗取材和標(biāo)本保存

造模結(jié)束后，兩組動物在規(guī)定時間點以2%戊巴比妥鈉（4mg/100g）麻醉后固定于手術(shù)木板上，置于解剖盤中，暴露胸腔并游離出心臟，灌流針經(jīng)左心室插入升主動脈，剪開右心房，先用生理鹽水（37℃）快速灌注5min（60ml）左右以移除血液，直到肝臟發(fā)白（防止殘留的血液導(dǎo)致非特異性染色）。然后用4%多聚甲醛(pH7.4)（4℃）400ml－500ml灌注固定，直到動物的肝臟發(fā)硬，尾巴僵直，完成灌注。動物放置4度冰箱保存2小時，然后取腦干延髓部，繼續(xù)保存在4%多聚甲醛中4度冰箱過夜（不要超過24h），第二天轉(zhuǎn)移至20%蔗糖脫水至沉底，再轉(zhuǎn)移至30%蔗糖脫水至沉底，然后做病理實驗。

3 病理實驗

3.1 尼氏染色

4 %多聚甲醛固定24小時的腦干在自動脫水機(jī)脫水后，行石蠟包埋（將腦干橫斷面朝下放入蠟?zāi)Ｖ?，使之與模具底平齊）。然后行常規(guī)石蠟切片，將腦干切為 4μm厚的橫斷面。根據(jù) Paxinos and Watson圖譜選取舌下神經(jīng)核所在的橫斷面。將切好的片子按順序標(biāo)記好，放入60℃烘箱中烘烤2小時，以防脫片。尼氏染色前再在60℃烘箱中烘片30min，立即將切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各10min，然后放入無水乙醇、95%酒精Ⅰ、95%酒精Ⅱ、80%酒精、70%酒精中各5min，再放入蒸餾水中5min。切片放入硫堇染色液30min，用蒸餾水漂去浮色。切片再放入70%酒精30s，再置于無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3-5 min，再次將切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5 min，然后使用中性樹膠封片。最后在顯微鏡下觀察，留片。

3.2 免疫組織化學(xué)

腦干經(jīng)蔗糖脫水沉底后，-80℃速凍，在冰凍切片機(jī)中將腦干切成30μm厚的橫斷面，根據(jù)Paxinos and Watson圖譜，以腦干背側(cè)“閂”為界，向上、向下分別連續(xù)切取30μm厚的腦片各6張（A-P Level：距離前囟為-4.50mm至-4.86mm），每一只大鼠共留取腦片12張，按順序標(biāo)記好。1、4、7、10號腦片用于c-fos免疫組織化學(xué)，2、5、8、11號腦片用于5-HT 2A受體免疫組化，剩余的3、6、9、12號腦片用于5-HT免疫組化。為減少實驗誤差，CIH組和對照組配對同時染色。嚴(yán)格按照SP法進(jìn)行染色。一抗4℃下孵育24h，用相同稀釋比的PBS替代一抗作陰性對照，DAB溶液顯色，鏡下觀察陽性物質(zhì)呈深棕色。最后采用IPP圖像分析系統(tǒng)分析其平均光密度值（平均光密度值=累積光密度/面積），陽性細(xì)胞免疫反應(yīng)性的強(qiáng)弱采用相對值累積光密度（integrated option density，IOD）表示。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t-test。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 對照組和CIH組舌下神經(jīng)核尼氏染色結(jié)果比較（圖1）

CIH組舌下運動神經(jīng)元與對照組相比，神經(jīng)元出現(xiàn)尼氏體崩解，細(xì)胞質(zhì)淡染。

2 5-HT免疫組化結(jié)果比較（圖2）

CIH組舌下神經(jīng)核腹側(cè)5-HT陽性末端數(shù)量為：337±71，背側(cè)為：214±53，對照組舌下神經(jīng)核腹側(cè)5-HT陽性末端數(shù)量為：160±47，背側(cè)為：104± 23。慢性間歇性低氧組腹側(cè)、背側(cè)5-HT陽性末端數(shù)量分別與對照組相比均顯著升高（P<0.05），CIH組和對照組各自腹側(cè)與背側(cè)相比，腹側(cè)高于背側(cè)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 5-HT 2A受體免疫組化結(jié)果比較（圖3）

慢性間歇性低氧組舌下神經(jīng)核腹側(cè)5-HT 2A受體平均光密度與對照組相比顯著升高（P<0.05），CIH組背側(cè)5-HT 2A受體平均光密度與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

4 C-fos免疫組化結(jié)果（圖4）

CIH組舌下神經(jīng)核腹側(cè)、背側(cè)C-fos表達(dá)量均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖 舌下神經(jīng)核尼氏染色結(jié)果的比較

圖2 5-HT免疫組化結(jié)果

圖3 5-HT 2A受體免疫組化結(jié)果比較

圖4 C-fos免疫組化染色結(jié)果

討論

實驗結(jié)果顯示，與健康動物相比慢性間歇性低氧動物舌下運動神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)尼氏體崩解，細(xì)胞質(zhì)淡染現(xiàn)象。免疫組化研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對照組動物比較，在CIH動物中，作用于舌下神經(jīng)核的5-HT陽性末端及其5-HT 2A受體以及C-fos表達(dá)均增高。

尼氏體主要由平行排列的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體組成，主要功能是合成蛋白質(zhì)，供神經(jīng)活動時所需，軸突端的蛋白質(zhì)大都來自胞體的尼氏體。神經(jīng)元在興奮傳導(dǎo)過程中，不斷消耗某些蛋白質(zhì)物質(zhì)，尼氏體可合成新的蛋白質(zhì)以補(bǔ)充這種消耗。尼氏體崩解，胞質(zhì)淡染，提示慢性間歇性低氧導(dǎo)致舌下運動神經(jīng)元損傷，可能導(dǎo)致舌下運動神經(jīng)元活性下降，致使舌下神經(jīng)對頦舌肌的支配減弱，進(jìn)而咽腔進(jìn)一步狹窄，缺氧加重，形成惡性循環(huán)。在實驗中我們還發(fā)現(xiàn)CIH組動物舌下運動神經(jīng)元C-fos的表達(dá)量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。間歇低氧后C-fos被激活，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織對損傷刺激的信號傳導(dǎo)及應(yīng)答[16]，目前C-fos基因的表達(dá)情況已作為受損神經(jīng)細(xì)胞活性及反應(yīng)性的標(biāo)記物之一[17]。這間接地反映慢性間歇性低氧大鼠舌下運動神經(jīng)元細(xì)胞活性增強(qiáng)。這與尼氏染色得出的結(jié)果相反。猜測這可能與低氧程度、低氧持續(xù)時間有關(guān)，可能是機(jī)體在一定程度缺氧條件下，部分細(xì)胞受到損傷，細(xì)胞功能下降，但還未完全損傷的細(xì)胞代償性功能加強(qiáng)，活性增高。

舌下神經(jīng)核是由支配舌肌的運動神經(jīng)元胞體集合而成背、腹方向的兩大縱列細(xì)胞柱,可分為背側(cè)組和腹側(cè)組。背側(cè)組發(fā)出的軸突經(jīng)舌下神經(jīng)的外側(cè)支而支配縮舌??；腹側(cè)組發(fā)出的軸突經(jīng)舌下神經(jīng)內(nèi)側(cè)支而支配伸舌肌，主要為頦舌肌。有研究發(fā)現(xiàn)OSA患者睡眠時頦舌肌活動下降較正常人更明顯，而在覺醒時OSA患者頦舌肌活性明顯高于正常人。研究證實5-羥色胺能神經(jīng)通過與舌下神經(jīng)元的5-HT受體結(jié)合，增強(qiáng)上呼吸道擴(kuò)張肌收縮功能。當(dāng)5-羥色胺能神經(jīng)元激活時可引起頦舌肌收縮，上呼吸道擴(kuò)張，而當(dāng)5-羥色胺能神經(jīng)元受抑制時，上呼吸道擴(kuò)張度減小。在睡眠過程中5-羥色胺能神經(jīng)元功能減弱，5-HT傳遞減少，對舌下神經(jīng)元的驅(qū)動減少，從而舌下神經(jīng)向頦舌肌發(fā)放電活動減少，最終導(dǎo)致頦舌肌收縮降低，進(jìn)而引起上氣道阻塞。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)慢性間歇性低氧大鼠腹側(cè)舌下運動神經(jīng)元的5-HT陽性末端表達(dá)量顯著高于正常對照組大鼠腹側(cè)表達(dá)量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；同時CIH組大鼠背側(cè)舌下運動神經(jīng)元的5-HT陽性末端表達(dá)量也高于正常對照組大鼠其背側(cè)表達(dá)量。提示慢性間歇性低氧導(dǎo)致5-HT能細(xì)胞對舌下神經(jīng)運動核的腹側(cè)、背側(cè)核團(tuán)興奮性支配增強(qiáng)了。與此同時，CIH組大鼠舌下神經(jīng)核腹側(cè)神經(jīng)元細(xì)胞表面5-HT 2A受體表達(dá)明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，CIH組大鼠而背側(cè)舌下神經(jīng)元細(xì)胞表面5-HT 2A受體表達(dá)與對照組無顯著性差異。說明CIH組大鼠通過5-HT作用于興奮性受體-5-HT 2A受體，使得舌下神經(jīng)核腹側(cè)神經(jīng)元細(xì)胞興奮性增高，舌下神經(jīng)對頦舌肌發(fā)放的電活性增高，頦舌肌活性增強(qiáng)，進(jìn)而引起上氣道開放。這可能是一種機(jī)體為適應(yīng)上氣道解剖性狹窄的代償機(jī)制。

總的來說，本研究提示慢性間歇性缺氧致使5-HT能神經(jīng)元對舌下神經(jīng)核的支配加強(qiáng)，從而導(dǎo)致OSA患者在覺醒狀態(tài)下上氣道頦舌肌活性較正常人高，以此適應(yīng)上氣道的解剖性狹窄。

1 Remmers JE,DegrootWJ,Sauerland EK,etal. Pathogenesis of upper airway occlusion during sleep.J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol,1978,44(6): 931-938.

2 White DP.The pathogenesis of obstructive sleep apnea: advances in the past 100 years.Am J Respir Cell Mol Biol,2006,34(1):1-6.

3 Suratt PM,Mctier RF,Wilhoit SC.Upper airway muscle activation is augmented in patients with obstructive sleep apnea compared with that in normal subjects.Am Rev Respir Dis,1988,137(4):889-894.

4 高雪梅，黃席珍.阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征患者上氣道大小的磁共振研究.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1999,31(5): 450-453.

5 葉京英，韓德民.阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征患者上氣道的形態(tài).中華耳鼻咽喉科雜志,2000,35(4):278-281.

6 Mezzanotte WS,Tangel DJ,White DP.Waking genioglossal electromyogram in sleep apnea patients versus normal controls (a neuromuscular compensatory mechanism).J Clin Invest,1992,89(5):1571-1579.

7 Hendricks JC,Petrof BJ,Panckeri K,et al.Upper airway dilating muscle hyperactivity during non-rapid eye movement sleep in English bulldogs.Am Rev Respir Dis, 1993,148(1):185-194.

8 Saboisky JP,Butler JE,Mckenzie DK,et al.Neural drive to human genioglossus in obstructive sleep apnoea.J Physiol,2007,585(Pt 1):135-146.

9 Schwab RJ,Gefter WB,Hoffman EA,et al.Dynamic upper airway imaging during awake respiration in normal subjects and patients with sleep disordered breathing.Am Rev Respir Dis,1993,148(5):1385-1400.

10 Mezzanotte WS,Tangel DJ,White DP.Influence of sleep onset on upper-airway muscle activity in apnea patients versus normal controls.Am J Respir Crit Care Med,1996, 153(6 Pt 1):1880-1887.

11 Jacobs BL,Azmitia EC.Structure and function of the brain serotonin system.Physiol Rev,1992,72(1):165-229.

12 Bayliss DA,Viana F,Talley EM,et al.Neuromodulation of hypoglossal motoneurons:cellular and developmental mechanisms.Respir Physiol,1997,110(2-3):139-150.

13 Aston-Jones G,Bloom FE.Activity of norepinephrinecontaining locus coeruleus neurons in behaving rats anticipates fluctuations in the sleep-waking cycle.J Neurosci,1981,1(8):876-886.

14 Trulson ME,Trulson VM.Activity of nucleus raphe pallidus neurons across the sleep-waking cycle in freely moving cats.Brain Res,1982,237(1):232-237.

15 DematteisM,Godin-RibuotD,Arnaud C,etal. Cardiovascular consequences of sleep -disordered breathing:contribution of animal models to understanding the human disease.ILAR J,2009,50(3):262-281.

16 Itoh H,Yagi M,Fushida S,et al.Activation of immediate early gene,c-fos,and c-jun in the rat small intestine after ischemia/reperfusion.Transplantation,2000,69(4): 598-604.

17 王政偉，尹彥玲，趙春平，等.腦血管痙攣后血管平滑肌細(xì)胞中c-fos基因表達(dá)及意義.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2002,1(2):173-175.

（收稿:2014-04-25 修回：2014-08-15）

The changes on density of serotonin terminals and receptors in hypoglossal motor nucleus under chronic intermittent hypoxia

ZHANG Minjuan,JIAO Cheng,YAN Jiangyu,LI Jing,YIN Min,CHENG Lei
Department of Otorhinolaryngology,The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing,Jiangsu, 210029,China

ObjectiveTo study CIH-induced damage on neurochemical markers of 5-HT,5-HT receptors and c-fos protein of hypoglossal nucleus in rat and the morphological changes of motoneurons of the hypoglossal.MethodsAdult male Sprague-Dawley (SD)rats(n=12)were randomly and meanly divided into two groups(the CIH group and the control group).The rats of CIH group were fed in low oxygen cabins(60s/N2,the fraction of oxygen volume reduced to 5%under hypoxia;and 60s/air alternately,the fraction of oxygen volume increased to 21%;between 8:30~16:30 each day)for 35 days.The control group was fed in atmospheric environment cabins.We study the morphology of hypoglossal nucleus by Nissal stain and the expression of c-fos protein,5-HT and receptors were detected by immunohistochemical method.ResultsNeurons in the hypoglossal nucleus of the CIH group became swollen,and Nissal bodies had collapsed and were stained lightly.The relative quantity of c-fos protein and neurochemical markers of 5-HT and receptors in CIH groups were significantly higher than that of the control group(P<0.05).ConclusionCIH-induced excessive expression of neurochemical markers of 5-HT and receptors in hypoglossal nucleus result in hypoglossal nerves activity raised and then led to genioglossus electroactive?increased.It is may play an important role in maintaining open pharyngeal in OSA patients.

Obstructive sleep apnea;Chronic intermittent hypoxia;5-HT;5-HT 2A

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2015.02.003

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程（JX10231801）；江蘇省人民醫(yī)院創(chuàng)新團(tuán)隊（IRT-016）

1 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 江蘇省人民醫(yī)院耳鼻咽喉科（南京，210029）

殷敏，副教授. Email:simisodo@hotmail.com