忍冬開花過程中花青苷組成及含量的變化

劉安成 ，尉 倩，王 慶，王亮生 ，龐長民

(1 陜西省西安植物園，陜西 西安 710061；2 中國科學院植物研究所 北京植物園，北京 100093)

忍冬開花過程中花青苷組成及含量的變化

劉安成1，尉 倩1，王 慶1，王亮生2，龐長民1

(1 陜西省西安植物園，陜西 西安 710061；2 中國科學院植物研究所 北京植物園，北京 100093)

【目的】 探討忍冬屬(LoniceraLinn.)植物花朵中花青苷的種類及開花過程中含量的變化，為忍冬花色育種提供依據(jù)。【方法】 以忍冬(L.japonicaThunb.)、‘火焰’忍冬(L.×heckrottiiRehd.‘Huoyan’)、‘格雷姆’忍冬(L.periclymenumL.‘Geleimu’)、貫月忍冬(L.sempervirensL.) 和‘臺爾曼’忍冬(L.×tellmanniana)5種藤本植物為材料，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測技術(shù)(HPLC-DAD)、高效液相色譜-電噴霧離子化-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ESI-MSn)，對各材料開花過程中的花青苷進行定性及定量分析?！窘Y(jié)果】 在開花過程中，5種忍冬屬植物花色變化明顯，但在忍冬花朵中未檢測到花青苷存在，在‘火焰’忍冬、貫月忍冬、‘格雷姆’忍冬和‘臺爾曼’忍冬中共檢測到4種花青苷，分別為矢車菊素3,5-二葡萄糖苷、矢車菊素3-葡萄糖苷、芍藥花素3,5-二葡萄糖苷和芍藥花素3-葡萄糖苷，其中矢車菊素3,5-二葡萄糖苷為主要花色素成分。5種忍冬屬植物在不同開花階段花青苷種類基本一致，但含量均有較為明顯的變化。【結(jié)論】 5種忍冬屬植物的花青苷組成及含量變化與其花色轉(zhuǎn)變相一致，可為忍冬花色育種提供參考。

忍冬；花青苷；液質(zhì)聯(lián)用

忍冬屬(LoniceraLinn.)隸屬于忍冬科(Caprifoliaceae)，該屬植物約有200種，在北美洲、歐洲、亞洲和非洲北部的溫帶和亞熱帶地區(qū)均有分布，但亞洲種類最多，多樣性尤以中國為最。我國忍冬屬植物有97種、5亞種、18變種，廣布于全國各省區(qū)，但以西南部種類最多[1]，其中忍冬(L.japonicaThunb.)是中國著名中藥金銀花的藥源植物。迄今已對金銀花、山銀花及同屬其他植物的花、葉和藤中的綠原酸、木犀草苷、黃酮等化學成分及藥理進行了大量研究[2-6]。同時，本屬內(nèi)還有許多具有優(yōu)良觀賞價值的種類，如從國外引種的貫月忍冬(L.sempervirensL.) 、‘臺爾曼’忍冬(L.×tellmanniana)及中國科學院植物研究所北京植物園自育的‘火焰’忍冬(L.×heckrottiiRehd.‘Huoyan’)和‘格雷姆’忍冬(L.periclymenumL.‘Geleimu’)等優(yōu)良品種，這4種植物花色多樣，并富于變化，觀賞價值較高，在園林綠化中可發(fā)揮重要的作用[7]。

花青苷(Anthocyanins)是植物花色形成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，因此對花青苷成分和含量進行分析是花色研究的重要內(nèi)容之一[8]。目前，對忍冬屬植物果實類黃酮的研究較多，Chavoanalikit 等[9]對藍靛果忍冬(L.caeruleavar.kamtschatica)果實進行了類黃酮化合物測定，共檢測到6種花青苷，分別為矢車菊素3-葡萄糖苷(Cyanidin 3-glucoside)、矢車菊素3，5-二葡萄苷(Cyanidin 3,5-diglucoside)、矢車菊素3-蕓香糖苷(Cyanidin 3-rutinoside)、天竺葵素3-葡萄糖苷(Pelargonidin 3-glucoside)、芍藥花素3-葡萄糖苷(Peonidin 3-glucoside)和芍藥花素3-蕓香糖苷(Peonidin 3-rutinoside)。Jordheim 等[10]從7種忍冬屬植物的漿果或秋天葉片中檢測出5種花青苷。但目前國內(nèi)外針對忍冬屬植物開花過程中花青苷組成及變化的研究較少，劉安成等[11]對5種忍冬屬植物花朵不同開花階段的綠原酸種類及含量進行了分析，發(fā)現(xiàn)除初蕾期外，貫月忍冬其他不同開花時期的總綠原酸含量顯著高于忍冬。

為進一步探討不同忍冬屬植物的功能應用價值，并探討花青苷類物質(zhì)在其開花過程中的變化規(guī)律，本研究采用高效液相色譜-二極管陣列檢測技術(shù)(HPLC-DAD)和高效液相色譜-電噴霧離子化-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ESI-MSn)，對忍冬及其同屬4種植物不同開花階段花朵中的花青苷組成及含量變化進行了分析，以期為忍冬屬植物的功能應用及花色育種提供科學依據(jù)，也為闡明忍冬花色形成機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集與處理

選取具有典型花色、花型的5種忍冬屬藤本植物‘火焰’忍冬、‘格雷姆’忍冬、貫月忍冬、忍冬和‘臺爾曼’忍冬(圖1)為試驗材料，均采自中國科學院植物研究所北京植物園。在晴天上午 07:00-09:00，采集不同開花階段的花朵，裝入塑料自封袋內(nèi)，于室內(nèi)進行清理，并將忍冬屬植物開花過程分為初蕾期(Initial alabstrum period)、中蕾期(Meddle alabstrum period)、膨大期(Expand period)、初花期(Initial flowering period)和末花期(Final flowering period)5個階段[11]。

由圖1可見，各種(品種)忍冬從蕾期到末花期花色變化明顯，‘火焰’忍冬初蕾期為紫紅色，開花后轉(zhuǎn)為紅色；‘格雷姆’忍冬初蕾期為綠色，隨著花蕾膨大到開放由黃色變?yōu)榻瘘S色；貫月忍冬蕾期為紫色，開放后為紅色，花瓣內(nèi)部初花為黃色，到末花期轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色；忍冬初蕾期為綠色，隨著花蕾膨大，綠色褪掉而成白色，花后期由白色變?yōu)辄S色；‘臺爾曼’忍冬花蕾為橘紅色，花初開時花瓣內(nèi)部為橘黃色，到末期顏色加深變?yōu)榧t色。

1.2 花青苷成分的提取

稱取不同開花階段各種忍冬花蕾或花朵2 g，液氮研磨后轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加入V(甲醇)∶V(鹽酸)∶V(水)=70∶0.1∶29.9的提取液適量，4 ℃暗光下浸提24 h，冷凍離心機離心5 min(12 000 r/min，4 ℃)，轉(zhuǎn)出上清液后繼續(xù)加入適量提取液重復浸提，混合浸提液，取上清液用濾紙粗濾后，經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm) 過濾，保存于4 ℃冰箱中供花青苷定性、定量分析用。每個樣品重復3次。

1.3 花青苷的定性分析

1.3.1 HPLC-DAD 分析 所用儀器為戴安(Dionex HPLC-DAD)系統(tǒng)。液相色譜系統(tǒng)包括PDA-100光電二極管陣列檢測器、P680A LPG-4型二元梯度泵、UltiMate 3000 自動進樣器、TCC-100色譜柱控溫箱和Chameleon 6.60工作站。色譜柱為日本Tosoh株式會社生產(chǎn)的TSK gel ODS 280TsQA反相硅膠柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm)。

所用試劑有甲酸(分析純)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、水(雙蒸水，試驗室自制)。

圖1 5種忍冬屬植物不同開花階段的花朵形態(tài)
Fig.1 Flower morphologies of 5Loniceravarieties during different flowering periods

分析條件為：柱溫35 ℃，流速0.8 mL/min，進樣體積10 μL，花青苷的檢測波長為525 nm，200～800 nm 內(nèi)全波長掃描吸收光譜。流動相A液為甲酸水溶液(V(甲酸)∶V(水)=0.1∶99.9)；B液為甲酸-乙腈溶液(V(甲酸)∶V(乙腈)=85∶15)。

線性梯度洗脫程序為0 min，8%B；20 min，30%B； 30 min，8%B。

1.3.2 HPLC-ESI-MSn分析 對HPLC檢測出的峰較多的樣品提取液，采用安捷倫(Agilent 1100 LC/MSD Trap VL)液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進行HPLC-ESI-MSn分析。

液相色譜分析條件、流動相組成、洗脫程序與1.3.1節(jié)相同，進樣體積15 μL。質(zhì)譜分析條件：電噴霧離子化( ESI)，離子阱分析器，正離子檢測模式，全離子掃描，掃描范圍(m/z)100～1 000 nm。毛細管電壓3 500 V，噴霧器壓力241.3 kPa，毛細管出口電壓117.9 V，干燥溫度350 ℃，干燥氣(N2) 流速6.0 L/min。

1.4 花青苷的定量分析

運用HPLC-DAD方法，在波長525 nm條件下，采用標準品半定量法，分別計算新鮮花蕾和花朵中的花青苷含量(μg/g)，以錦葵素3,5-二葡萄糖苷(Malvidin-3,5-diglucoside，Mv3G5G， 購于法國Extrasynthese公司)標準品為參照[12]。每樣品3個重復，結(jié)果取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用LC/MSD Trap軟件(5.2版)分析質(zhì)譜結(jié)果，用SPSS 11.5對數(shù)據(jù)進行分析，用SigmaPlot 10.0 繪制花青苷HPLC色譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種忍冬屬植物花中花青苷成分的分析

對5種忍冬植物不同開花階段花蕾或花朵提取液在525 nm下進行HPLC-DAD檢測，結(jié)果表明，‘火焰’忍冬初蕾期出現(xiàn)峰a1和a3，中蕾期及之后檢測到a1、a2和a3；‘格雷姆’忍冬只檢測到a1；貫月忍冬不同時期都檢測到a1、a2和a3，在末花期還檢測到弱的峰a4(圖2)；忍冬在不同開花時期都未檢出特征峰；‘臺爾曼’忍冬均檢測到特征峰a1、a2和a3?；ㄇ嘬疹愇镔|(zhì)在紫外-可見吸收光下具有2個明顯的吸收峰,位于波長較長一側(cè)的500～540 nm處可見光區(qū)域稱為帶Ⅰ, 較短一側(cè)275 nm附近紫外光區(qū)域稱為帶Ⅱ。帶Ⅰ反映了B 環(huán)的取代情況，隨著B 環(huán)上羥基及甲基化數(shù)目的增加,帶Ⅰ有向短波長方向移動的趨勢。因此, 可通過紫外-可見吸收光譜判定特征峰是否為花青苷,也可以初步掌握苷元組成的大致類型[13]，本研究檢測到的a1～a4 4個特征峰在200～800 nm下的全波長掃描結(jié)果符合花青苷的色譜峰特征，故判定為花青苷。

圖2 貫月忍冬末花期花青苷定性分析的HPLC色譜圖(525 nm)
Fig.2 HPLC chromatograms of qualitative analysis on anthocyanins inL.sempervirensL.at final flowering period (525 nm)

為進一步確定這些色素的化學結(jié)構(gòu)，選取色素含量高、出峰多的樣本進行了HPLC-ESI-MSn分析。a1、a2、a3和a4等4種花青苷組分在440 nm與λvis-max2處的吸光值之比(A440/Avis-max)分別為 18.59%，31.89%，18.16%和30.83%，a2、a4的花青苷元3位及a1、a3的花青苷元3位和5位可能發(fā)生了糖苷化[14]，且a1～a4在紫外光區(qū)290～340 nm波長內(nèi)無特征吸收峰，表明無芳香酸?；痆15]。a1 經(jīng)一級質(zhì)譜得到分子離子m/z611([M]+)，分子離子裂解釋放出的碎片離子m/z287([Y0]+，其中Y0為苷元)，為矢車菊素(Cyanidin,簡稱Cy) 的特征質(zhì)荷比，中間碎片離子m/z449為[M]+失去1個己糖，且與Cy己糖苷一致， Cy 連有2個己糖，推定該物質(zhì)為矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷(Cy 3,5-di-O-glucoside)；a2 經(jīng)一級質(zhì)譜得到分子離子m/z449([M]+)，釋放出碎片離子m/z287([Y0]+)，Cy連有1個己糖，推定該物質(zhì)為矢車菊素-3-葡萄糖苷(Cy 3-O-glucoside)；a3 經(jīng)一級質(zhì)譜得到分子離子m/z625([M]+)，分子離子裂解釋放出的碎片離子m/z301([Y0]+)，為芍藥花素(Peonidin,簡稱Pn) 的特征質(zhì)荷比，中間碎片離子m/z463為[M]+失去1個己糖，并且與Pn己糖苷一致，Pn 連有2個己糖，推定該物質(zhì)為芍藥花素-3,5-二葡萄糖苷(Pn 3,5-di-O-glucoside)；a4經(jīng)一級質(zhì)譜得到分子離子m/z463([M]+)，釋放出碎片離子m/z301([Y0]+)，Pn連有1個己糖，推定該物質(zhì)為芍藥花素-3-葡萄糖苷(Pn 3-O-glucoside)。具體分析結(jié)果見表1。

表1 5種供試忍冬花中4種花色苷的HPLC-DAD、HPLC-ESI-MSn分析及其結(jié)構(gòu)推定Table 1 HPLC-DAD and HPLC-ESI-MSn analysis and identification of four anthocyanins from five Lonicera varieties

2.2 忍冬不同開花階段花青苷含量的變化

由表2可見，忍冬從花蕾到開花末期都未檢測到花青苷成分?！鹧妗潭趵倨诨ɡ傧掳氩糠譃榫G色，頂端部分紫色，到蕾膨大期全部呈紫紅色，與其花青苷成分含量高的結(jié)果相符，隨著花蕾的快速膨大到開花，色彩逐漸變淡，其總花青苷含量又呈下降趨勢?！窭啄贰潭ǘ錇辄S色，其花青苷含量較少，花器官發(fā)育不同時期僅含有少量的矢車菊素 3,5-二葡萄糖苷。貫月忍冬在所檢測的5個品種中花青苷含量最高，且隨著花器官的發(fā)育，其總花青苷含量呈上升趨勢，在末花期含量達到最大值(596.33 μg/g)?！_爾曼’忍冬花蕾膨大期時的花青苷含量顯著高于其他階段。從5種忍冬屬植物花中檢測到的4種花青苷的主成分都是矢車菊素 3,5-二葡萄糖苷；各種(品種)忍冬開花過程中花青苷含量都有明顯的變化，貫月忍冬和‘火焰’忍冬的花均為紅色，其花青苷含量總體高于其他3個品種。

表2 5種忍冬屬植物開花不同階段花青苷成分及含量的變化Table 2 Anthocyanins content in Lonicera at different flowering stages μg/g

注：a1.矢車菊素 3,5-二葡萄糖苷；a2.矢車菊素 3-葡萄糖苷；a3.芍藥花素 3,5-二葡萄糖苷；a4.芍藥花素 3-葡萄糖苷。同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示不同時期差異達顯著水平(P=0.05)。

Note:a1.Cy 3,5-di-O-glucoside;a2.Cy 3-O-glucoside;a3.Pn 3,5-di-O-glucoside;a4.Pn 3-O-hexoside.Different lowercase letters in each column mean significant difference among stages atP=0.05 level.

3 討 論

目前，針對忍冬屬植物果實化學成分的研究較多，特別是藍靛果忍冬[9]，證實其主要含Cy和Dp型花青苷。本試驗所測定的5種忍冬屬植物花朵中，忍冬從初蕾期一直到后期花色變黃過程中均未檢測到花青苷的存在；而其他4種忍冬屬植物花中的花青苷主要為Cy和Pn型花青苷，未檢測到Dp型花青苷。這是因為植物種類不同及研究部位不同，其花青苷種類存在一定差異。付林江等[16]研究發(fā)現(xiàn)，金銀花花色的變化是因為金銀花中葉綠素、類胡蘿卜素、木犀草苷含量變化引起的呈色變化，而花由白變黃主要是因為類胡蘿卜素含量的增加所致。

在開花過程中，忍冬屬植物花朵中的花青苷種類變化均不大，在‘火焰’忍冬(除初蕾期未檢測到矢車菊素 3-葡萄糖苷外)、貫月忍冬和‘臺爾曼’忍冬開花的不同階段均檢測到矢車菊素 3,5-二葡萄糖苷、矢車菊素 3-葡萄糖苷和芍藥花素 3,5-二葡萄糖苷3種花青苷；還在貫月忍冬末花期檢測到微量的芍藥花素 3-葡萄糖苷。有研究發(fā)現(xiàn)，花朵從蕾期到開放過程中，花瓣面積的擴大速度較色素的合成速度快，可能會導致單位面積色素含量的下降[17]?！窭啄贰潭?、‘火焰’忍冬和‘臺爾曼’忍冬總花青苷含量的變化趨勢與此結(jié)論一致，但貫月忍冬隨著花瓣的開放和衰敗，其總花青苷含量一直呈增加趨勢，‘臺爾曼’忍冬末花期的總花青苷含量仍高于初花期，這可能是由于花瓣衰敗時含水量減少，從而使同質(zhì)量鮮花瓣中的花青苷占比增加。在開黃花的‘格雷姆’忍冬中只檢測到1種花青苷，且含量相對較低，這主要是因為黃色花色素組成一般為類黃酮和類胡蘿卜素[18-19]。

忍冬屬植物在春季開放，花期較長，大多數(shù)種類具有2次或多次開花現(xiàn)象，但花色只有白色、黃色或紅色，如果能育成其他色調(diào)的新品種，將豐富忍冬花色，提高觀賞價值。忍冬屬植物在藥用方面具有悠久的歷史，具鮮艷花色的忍冬品種在花茶及其功能應用上更具開發(fā)價值，特別是貫月忍冬花朵，無論花青苷含量還是綠原酸含量均顯著高于金銀花，其藥理和功能應用值得進一步研究。

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Changes in composition and content of anthocyanins during flowering process ofLonicera

LIU An-cheng1,YU Qian1,WANG Qing1, WANG Liang-sheng2,PANG Chang-min1

(1Xi’anBotanicalGardenofShaanxiProvince,Xi’an,Shaanxi710061,China;2BeijingBotanicalGarden,InstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences,Beijing100093,China)

【Objective】 This study investigated the changes in anthocyanins composition and content inLoniceraduring flowering to provide theoretical basis for development and breeding of flower colors.【Method】 A high performance liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array detector (HPLC-DAD) and a HPLC-electrospray ionization-multiple mass spectrometry (HPLC-ESI-MSn) were employed for qualitative and quantitative analysis of anthocyanins fromL.japonicaThunb.,L.×heckrottiiRehd.‘Huoyan’,L.periclymenumL.‘Geleimu’,L.sempervirensL.andL.×tellmanniana. 【Result】 During flowering process,the colors of all varieties changed significantly.But no anthocyanins were detected in flowers ofL.japonicaduring flowering process.InL.×heckrottiiRehd.‘Huoyan’,L.sempervirensL.,L.periclymenumL.‘Geleimu’ andL.×tellmanniana,a total of 4 anthocyanins including Cy 3,5-di-O-glucoside,Cy 3-O-glucoside,Pn 3,5-di-O-glucoside,and Pn 3-O-hexoside were detected.Cy 3,5-di-O-glucoside was the main pigment.The types of anthocyanins from different varieties were almost same but their contents were significantly different.【Conclusion】 The transformation of flower colors was consistent with composition and content of anthocyanins inLoniceraflower.This study could provide reference for breeding and selection of special flower colors.

Lonicera;anthocyanins;HPLC-MS

時間:2015-09-09 15:41

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.10.023

2014-03-19

陜西省科學院應用基礎(chǔ)研究專項(2013K-08)；西安市農(nóng)業(yè)及區(qū)縣工業(yè)創(chuàng)新計劃-農(nóng)業(yè)技術(shù)研發(fā)項目(NC1407-1)

劉安成(1973-)，男，陜西山陽人，副研究員，主要從事觀賞植物資源開發(fā)與利用研究。 E-mail：anchengliu123@163.com

S682.39

A

1671-9387(2015)10-0169-06

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