石灰性土壤解磷細(xì)菌的鑒定及其對(duì)土壤無(wú)機(jī)磷形態(tài)的影響

潘 虹，曹翠玲，林雁冰，李 旭，王 莉

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌712100)

石灰性土壤解磷細(xì)菌的鑒定及其對(duì)土壤無(wú)機(jī)磷形態(tài)的影響

潘 虹，曹翠玲，林雁冰，李 旭，王 莉

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌712100)

【目的】 從北方石灰性土壤中分離篩選解磷細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行鑒定，并測(cè)定其解磷能力，為篩選高效穩(wěn)定的解磷菌株提供參考?！痉椒ā?采集陜西楊凌地區(qū)白菜、葡萄、獼猴桃3種植物根際土樣，采用稀釋涂布法分離土壤解磷細(xì)菌，對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌落形態(tài)及顏色，測(cè)定其生理生化性質(zhì)，并結(jié)合16S rRNA法對(duì)其進(jìn)行鑒定；測(cè)定各菌株在固體及液體培養(yǎng)基中的解磷能力大??；分析澆灌無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌發(fā)酵液后石灰性土壤中無(wú)機(jī)磷形態(tài)及其含量的變化?！窘Y(jié)果】 共分離篩選得到10株解磷細(xì)菌，其中2株為有機(jī)解磷細(xì)菌(Y1和Y2)，4株為無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌(W1、W2、W3和W4)，其余4株既能分解有機(jī)磷，也能分解無(wú)機(jī)磷，為雙解磷細(xì)菌(WY1、WY2、WY3和WY4)；分離到的10株解磷細(xì)菌為革蘭氏陰性菌，其中WY1和Y2為短桿菌，其余均為桿菌。生理生化性質(zhì)及16S rRNA序列分析結(jié)果表明，10株菌株中 8株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，其中WY2、W1、W2、W3與臘狀芽孢桿菌相似，WY3和W4與蘇云金芽孢桿菌相似，WY4與巨大芽孢桿菌相似，Y2與Bacillusaryabhattai相似；WY1和Y1分別與耐寒短桿菌、楊氏檸檬酸桿菌相似。不同類型解磷細(xì)菌在固、液體培養(yǎng)基中解磷能力不同；高效液相色譜分析結(jié)果表明，篩選得到的無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌部分分泌草酸，部分分泌酒石酸。石灰性土壤澆灌無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌發(fā)酵液后， Ca8-P、Ca2-P含量增加，F(xiàn)e-P含量減少，Al-P、Ca10-P、O-P含量變化不大。【結(jié)論】 石灰性土壤中解磷細(xì)菌具有物種多樣性，無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌能使石灰性土壤中可利用有效磷含量增加。

解磷細(xì)菌；石灰性土壤；16S rRNA鑒定；無(wú)機(jī)磷形態(tài)

磷是僅次于氮素的植物第二大營(yíng)養(yǎng)元素[1]，磷缺乏是限制植物生長(zhǎng)的重要因素，農(nóng)業(yè)上往往以施用大量的磷肥來(lái)獲得最大產(chǎn)量[2-3]。然而施入土壤中的磷肥，極易被土壤固定而不能被作物利用[4-5]。我國(guó)有75%的土壤缺磷，特別是石灰性土壤，雖然其全磷含量較高，但能被作物吸收利用的有效磷含量卻很低[6-7]。土壤中存在解磷微生物，其能夠?qū)⑼寥乐械墓虘B(tài)磷分解或礦化成植物可吸收利用的可溶性磷[8]。解磷微生物包括細(xì)菌、真菌和放線菌[9]，其中以細(xì)菌的解磷效果較好[10]。解磷細(xì)菌(Phosphate-solubilizing bacteria，PSB)多為假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)細(xì)菌[11]。當(dāng)前常用的細(xì)菌鑒定方法為16S rRNA鑒定法，該法具有準(zhǔn)確、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，將其與理化性質(zhì)結(jié)合，可有效地對(duì)細(xì)菌菌種進(jìn)行鑒定[12]。磷細(xì)菌在我國(guó)已應(yīng)用多年，但發(fā)展較為緩慢，究其原因主要是磷細(xì)菌種類多、解磷機(jī)制不盡相同且較為復(fù)雜。目前，關(guān)于解磷細(xì)菌的研究多局限于菌種的篩選和解磷能力的比較，對(duì)其解磷機(jī)理并不十分明晰，關(guān)于解磷細(xì)菌發(fā)揮作用的條件、菌種生長(zhǎng)最適條件及施入土壤后的活動(dòng)和消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)等研究較少[13]。

為了明確石灰性土壤中的解磷細(xì)菌類型，進(jìn)一步探究解磷細(xì)菌的解磷機(jī)制，開發(fā)利用微生物資源，本試驗(yàn)從石灰性土壤中種植的獼猴桃、葡萄、小白菜根際土中分離篩選解磷細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行鑒定[14]，比較其在固體、液體培養(yǎng)基中的解磷能力，并進(jìn)一步探究其中4株無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌對(duì)石灰性土壤無(wú)機(jī)磷形態(tài)的影響，以期為篩選高效穩(wěn)定的解磷細(xì)菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 土 樣 從陜西楊凌(N34°17′9.81″，E108°04′9.61″)采集白菜、葡萄、獼猴桃3種植物的根際土，取5～10 cm土層的土樣，用塑料袋裝好密封帶回實(shí)驗(yàn)室，備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 無(wú)機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，磷酸鈣10 g，瓊脂18～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0[15]。

有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基(卵黃培養(yǎng)基)：制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基(牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂 18～20 g，蒸餾水1 000 mL)，分裝(每瓶100 mL)，121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻至50 ℃，每瓶?jī)?nèi)加入500 g/L葡萄糖溶液2 mL和500 g/L卵黃鹽水懸液10～15 mL，搖勻，傾注平板[16]。

1.2 解磷細(xì)菌的篩選

采用梯度稀釋法進(jìn)行試驗(yàn)，篩選無(wú)機(jī)解磷和有機(jī)解磷細(xì)菌時(shí)分別采用無(wú)機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基和有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基。樣品于30 ℃培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果，選擇出現(xiàn)溶磷圈的菌落，繼續(xù)劃線分離，直至得到單菌落為止。然后進(jìn)行3次繼代培養(yǎng)，篩選出溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值(D/d)大于2的菌株。

1.3 解磷細(xì)菌的鑒定

1.3.1 菌落形態(tài)及其革蘭氏染色 將無(wú)機(jī)及有機(jī)解磷細(xì)菌分別接種到無(wú)機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基和卵黃培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落形狀、顏色，測(cè)量菌落直徑，并對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色[17]后，在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)并拍照。

1.3.2 生理生化性質(zhì)的測(cè)定 按照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第9版)》進(jìn)行糖醇發(fā)酵、淀粉降解、明膠液化、甲基紅試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)等，檢測(cè)解磷細(xì)菌的理化性質(zhì)[18]。

1.3.3 解磷細(xì)菌16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 1)DNA的提取。采用CTAB法[19]提取解磷細(xì)菌基因組DNA。

2)PCR反應(yīng)。用于16S rRNA擴(kuò)增的通用引物為：P1，5′-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′；P6，5′-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。

PCR擴(kuò)增解磷細(xì)菌16S rRNA, 反應(yīng)體系為50 μL：模板1 μL,dNTP 0.5 μL，上下游引物各0.45 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，10×buffer 5 μL，ddH2O 42.1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 45 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共45個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。

3)測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)定由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。將得到的序列在GenBank網(wǎng)站用Clustal X進(jìn)行多序列比對(duì)，選擇相似性較高的典型菌株的序列，用MEGA 5.1軟件中的Neighbor-joining(NJ) Algorithm方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

1.4 無(wú)機(jī)解磷菌發(fā)酵液有機(jī)酸的測(cè)定

將無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌及雙解磷細(xì)菌分別接種到無(wú)機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至發(fā)酵液OD600為0.5時(shí)取樣，8 000 r/min離心10 min，取上清液。采用Waters 液相色譜儀測(cè)定發(fā)酵液中有機(jī)酸的種類與含量，色譜條件：C18色譜柱4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液(pH 2.0),流速0.61 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.5 解磷細(xì)菌液體解磷能力的測(cè)定

將能分解無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷的解磷細(xì)菌(無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌和有機(jī)解磷細(xì)菌)分別接種到無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基中，將可分解有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷的解磷細(xì)菌(雙解磷細(xì)菌)分別接種有機(jī)、無(wú)機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基及混合培養(yǎng)基(有機(jī)磷與無(wú)機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基按體積比1∶1混合配制)中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至其發(fā)酵液OD600為0.5時(shí)(菌體數(shù)量為109mL-1)取樣，用鉬銻抗比色法測(cè)定發(fā)酵液中有效磷質(zhì)量濃度[20]。以不接菌的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.6 無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)石灰性土壤中磷形態(tài)的影響

將4株無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌接種到無(wú)機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至發(fā)酵液OD600為0.5(菌體數(shù)量為109mL-1)時(shí)取樣，8 000 r/min 離心10 min，取上清液備用。用花盆裝風(fēng)干低磷石灰性土壤500 g，盆底放一直徑5 cm定性濾紙透氣并防止土壤漏出。將上述各上清液稀釋10倍后，按每100 g土加12 mL的比例與土壤拌勻，稱質(zhì)量控水使土壤絕對(duì)含水量為20%，每處理重復(fù)5次。以澆灌等體積未接種細(xì)菌的無(wú)機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基的土樣作為對(duì)照(CK)。土樣在室內(nèi)23 ℃下培養(yǎng)4 d(每d補(bǔ)充1次蒸散的水分)后，將土晾干，碾碎混勻后，按照蔣柏藩等[21]的石灰性土壤無(wú)機(jī)磷分級(jí)體系，采用連續(xù)提取法，分級(jí)測(cè)定Ca2-P、Ca8-P、Ca10-P、Fe-P、Al-P、O-P及土壤總磷(TP)含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷細(xì)菌的篩選

本試驗(yàn)共篩選到了10株解磷細(xì)菌，其中4株為無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌，記作W1、W2、W3、W4；2株為有機(jī)解磷細(xì)菌，記作Y1、 Y2；其余4株為雙解磷細(xì)菌，記作WY1、WY2、 WY3、WY4。

2.2 解磷細(xì)菌的形態(tài)及其菌落特征

培養(yǎng)后，10株解磷細(xì)菌菌落顏色及形狀呈現(xiàn)多樣性。有機(jī)解磷細(xì)菌菌落多為圓形(圖1-A)，少數(shù)形狀不規(guī)則，顏色為淡黃色或黃色，表面光滑；直徑較大，Y1和Y2菌落直徑分別為6和7.5 mm。雙解磷細(xì)菌菌落形態(tài)及直徑在不同培養(yǎng)基中存在差異，在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中與無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌相似，在有機(jī)磷培養(yǎng)基中與有機(jī)解磷細(xì)菌相似(圖1-B，C)。無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌菌落均為圓形，白色或黃色，表面光滑；菌落直徑較小，為2.4～2.7 mm(圖1-D)。

經(jīng)革蘭氏染色可知，本試驗(yàn)分離得到的10株細(xì)菌均為革蘭氏陰性菌。光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示，WY1和Y2為短桿菌，其余均為桿菌。

2.3 解磷細(xì)菌的生理生化性質(zhì)

試驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示，10株解磷細(xì)菌均能利用葡萄糖、甘露醇、果糖、蔗糖，接觸酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性；除WY1和W3外，其余8株可利用淀粉；除W4外，其他菌株均能將明膠液化；除W1外，其余菌株均能還原硝酸鹽。除W3和Y1外，其余菌株檸檬酸鹽試驗(yàn)均呈陽(yáng)性；WY4、W2及Y2甲基紅試驗(yàn)為陰性，其余菌株為陽(yáng)性。通過與伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)比對(duì)，WY2可鑒定為蠟狀芽孢桿菌，WY4可鑒定為巨大芽孢桿菌，其他菌株待鑒。

圖1 解磷細(xì)菌在有機(jī)磷及無(wú)機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)A、B.分別為有機(jī)磷培養(yǎng)基培養(yǎng)的有機(jī)解磷細(xì)菌Y1和雙解磷細(xì)菌WY2；C、D.分別為無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基培養(yǎng)的雙解磷細(xì)菌WY2和無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌W2

表1 解磷細(xì)菌的生理生化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of PSB

注：“+”代表陽(yáng)性，“-”代表陰性，“+/+”代表產(chǎn)酸產(chǎn)氣，“+/-”代表產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

Note：“+” Represents positive，“-” Represents negative，“+/+” Represents acidogenicity and aerogenesis，“+/-” Represents acidogenicity and anaerogenic

2.4 解磷細(xì)菌的16S rRNA鑒定

10株解磷細(xì)菌中，WY2、WY3、WY4、W1、W2、W3、W4均屬于芽孢桿菌屬(圖2)，且WY4與巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)聚在一起，其相似度高達(dá)100%，WY3和W4與蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringensis)處于同一分支中，相似度為90%，其余幾株與蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)最為相似，相似度89%；WY1與耐寒短桿菌(Brevibacteriumfrigoritolerans)最為相似(圖3)，相似度為89%；Y1與楊氏檸檬酸桿菌(Citrobacteryoungae)聚在一起(圖4)，相似度為71%；Y2與Bacillusaryabhattai、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)聚在一起(圖5)，相似度為73%。從GenBank中獲得10株菌的登錄號(hào)分別是WY1：KF641919；WY2：KF641920；WY3：KF641918；WY4：KF641921；W1：KF641923；W2：KF641924；W3：KF641925；W4：KF641926；Y1：KF641927；Y2：KF641928。

2.5 無(wú)機(jī)和雙解磷細(xì)菌發(fā)酵液中的有機(jī)酸種類及其含量

表2顯示，無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌W3和W4分泌酒石酸，無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌W1和W2及4株雙解磷細(xì)菌均分泌草酸，且W3和W4分泌的酒石酸質(zhì)量濃度遠(yuǎn)大于其他菌株分泌的草酸。

2.6 解磷細(xì)菌菌株在不同培養(yǎng)基中的解磷能力

2.6.1 固體培養(yǎng)基 菌株解磷能力的定性檢驗(yàn)以其在固體培養(yǎng)基中溶磷圈直徑、菌落直徑及二者的比值(D/d)來(lái)表示。表3表明，總體來(lái)看，有機(jī)解磷細(xì)菌的溶磷圈直徑大于無(wú)機(jī)和雙解磷細(xì)菌。有機(jī)解磷細(xì)菌Y1和Y2的D/d值分別是9.2和8，顯然Y1比Y2解磷能力強(qiáng)。無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌中，W1的D/d值最大(4.8)，其次是W3和W4，W2的最小，說明W1在固體培養(yǎng)基中分解無(wú)機(jī)磷的能力最強(qiáng)，W3，W4次之，W2最小。雙解磷細(xì)菌的D/d值比較復(fù)雜，除WY4外，其余3株在有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基中D/d值均大于無(wú)機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基，說明雙解磷細(xì)菌部分適合分解有機(jī)磷，部分適合分解無(wú)機(jī)磷。

圖2 基于16S rRNA的解磷細(xì)菌菌株WY2～WY4、W1～W4與其他菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于16S rRNA的解磷細(xì)菌菌株WY1與其他菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 基于16S rRNA的有機(jī)解磷細(xì)菌菌株Y1與其他菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 基于16S rRNA的有機(jī)解磷細(xì)菌菌株Y2與其他菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 無(wú)機(jī)和雙解磷細(xì)菌菌株發(fā)酵液中的有機(jī)酸種類及其質(zhì)量濃度Table 2 Type and quantity of organic acids secreted by inorganic and dual function PSB

表3 解磷細(xì)菌菌株在不同固體培養(yǎng)基中的菌落直徑和溶磷圈直徑Table 3 Size of colony and phosphate-solubilizing zone of PSB

注：Y1和WY1的菌落和溶磷圈為不規(guī)則形狀，故其直徑用范圍表示；同一指標(biāo)不同菌株相比數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Shapes of colony and phosphate-solubilizing zone of Y1 and WY are irregularity and showed as diameter range.Compare the same indicator of different strains,letters after the figures representative significant difference (P<0.05).

2.6.2 液體培養(yǎng)基 解磷細(xì)菌液體發(fā)酵后發(fā)酵液中有效磷質(zhì)量濃度可以用來(lái)定量表示解磷細(xì)菌解磷能力的大小。圖6顯示，4株無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌處理的無(wú)機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基中有效磷質(zhì)量濃度差異顯著，W1發(fā)酵后發(fā)酵液有效磷質(zhì)量濃度最高，為 14.86 μg/mL； W2中有效磷質(zhì)量濃度最低，僅為1 μg/mL，W3和W4中有效磷質(zhì)量濃度介于二者之間。有機(jī)解磷細(xì)菌Y1和Y2處理的有機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基中有效磷質(zhì)量濃度相差不大，分別為9.84 和9.53 μg/mL。在有機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，4個(gè)雙解磷細(xì)菌發(fā)酵液有效磷質(zhì)量濃度均最高，其中WY1的解磷能力最強(qiáng)，其發(fā)酵液中有效磷質(zhì)量濃度為20 μg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其余3株菌，其次是WY3和WY4，而WY2最小，有效磷質(zhì)量濃度僅為8 μg/mL；在無(wú)機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，有效磷質(zhì)量濃度由高到低依次為WY4>WY3、WY1>WY2。在有機(jī)與無(wú)機(jī)混合液體培養(yǎng)基中，WY3有效磷質(zhì)量濃度最大，其次為WY2和WY4，WY1最小。由此可知，雙解磷細(xì)菌的解磷能力可能與其分解的有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷比例有關(guān)。

圖6 10株解磷細(xì)菌發(fā)酵液中有效磷質(zhì)量濃度的比較 圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著
Fig.6 Content of available phosphorus in the fermentation broth of 10 PSB strains Different letters on bars indicate significant difference

2.7 無(wú)機(jī)解磷菌發(fā)酵液對(duì)石灰性土壤無(wú)機(jī)磷形態(tài)的影響

從圖7和8可以看出，加入4種無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌發(fā)酵液后，Ca2-P、Ca8-P含量均有不同程度增加。Ca2-P是作物最容易利用的磷，而W3和W4能較大幅度地提高其含量，說明W3和W4是適宜溶解石灰性土壤難溶磷的菌株。對(duì)于Fe-P而言，只有W2菌株發(fā)酵液明顯提高了Fe-P含量，而其他3個(gè)菌株發(fā)酵液都使Fe-P降低，說明不同無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌分解磷的機(jī)制可能有所不同。4種無(wú)機(jī)磷解磷細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)土壤Al-P、O-P、Ca10-P和TP含量影響不大，這可能是由于Al-P、O-P、Ca10-P和的有效性都很低，是植物的潛在磷源[20]。此外，石灰性土壤中O-P比較穩(wěn)定，由于被氧化鐵膠膜包被，這類磷酸鹽在弱酸下很難被分解出來(lái)，故無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌對(duì)其影響比較小。

圖7 無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)石灰性土壤中Ca2-P、Ca8-P、Al-P、Fe-P含量的影響
Fig.7 Different PSB strains of dissolving ability of limy soil phosphorus Ca2-P,Ca8-P,Al-P,Fe-P

比較表2和圖6發(fā)現(xiàn)，含草酸的W1和W2發(fā)酵液溶解石灰性土壤無(wú)機(jī)磷的能力遠(yuǎn)大于含酒石酸的W3和W4發(fā)酵液，說明草酸溶磷能力大于酒石酸，這與前人的研究結(jié)果[22]一致。

圖8 無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)石灰性土壤O-P、Ca10-P含量的影響

3 討 論

本試驗(yàn)從3種植物根際土壤中篩選得到10株解磷細(xì)菌，其中有無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌4株，有機(jī)解磷細(xì)菌2株，雙解磷細(xì)菌4株；革蘭氏染色表明，分離得到的解磷細(xì)菌主要以革蘭氏陰性桿菌為主，少數(shù)是短桿菌；生理生化性質(zhì)及16S rRNA 鑒定結(jié)果表明，10株解磷細(xì)菌中，8株是芽孢桿菌屬，且分別與巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和Bacillusaryabhattai相似；1株與耐寒短桿菌相似，1株與楊氏檸檬酸桿菌相似。這與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的多數(shù)解磷細(xì)菌為假單胞菌屬、芽孢桿菌屬細(xì)菌的結(jié)果相似[21]。

D/d值是傳統(tǒng)的衡量解磷細(xì)菌分解磷能力大小的定性指標(biāo)。一般認(rèn)為D/d值越大，細(xì)菌分解磷的能力越強(qiáng)[23]。李娟等[22]的研究結(jié)果表明，有些菌株在平板上溶磷圈很大，但在液體培養(yǎng)時(shí)解磷能力卻不強(qiáng)，反之亦然。本研究結(jié)果顯示，4株無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌和2株有機(jī)解磷細(xì)菌在固體與液體培養(yǎng)基中解磷能力基本一致；但是雙解磷細(xì)菌在液體與固體培養(yǎng)基中的解磷能力相差較大，這可能是由于不同菌株分解磷的機(jī)理不同所致，具體哪一種機(jī)理起主導(dǎo)作用，還有待于進(jìn)一步研究。同時(shí)也說明雙解磷細(xì)菌解磷特性可能會(huì)因環(huán)境中難溶性有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷的比例不同而發(fā)生改變，因此值得對(duì)其解磷機(jī)制作深入研究。

對(duì)比4株無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌在固體和液體培養(yǎng)基中的解磷能力，W1菌株固體培養(yǎng)基中D/d值最大，為4.8，在液體培養(yǎng)基中，其發(fā)酵液中有效磷質(zhì)量濃度最高，達(dá)15 μg/mL。高效液相測(cè)定結(jié)果表明，W1和W2發(fā)酵液中的有機(jī)酸主要是草酸，W3和W4發(fā)酵液中的有機(jī)酸則主要是酒石酸；從數(shù)量上看，W1和W2發(fā)酵液中有機(jī)酸草酸的質(zhì)量濃度較低，而W3和W4發(fā)酵液中酒石酸的質(zhì)量濃度較高。Ca2-P是有效磷庫(kù)的主體，也是植物最易利用的磷形態(tài)，Ca8-P對(duì)有效磷庫(kù)起著重要的調(diào)節(jié)作用[24]，本試驗(yàn)結(jié)果表明，解磷細(xì)菌發(fā)酵液可使石灰性土壤中的Ca2-P和Ca8-P增加，能有效調(diào)節(jié)植物根系周圍的磷庫(kù)。

解磷細(xì)菌對(duì)土壤中磷的分解能力應(yīng)該能真實(shí)反映其解磷能力的大小。由本研究結(jié)果可以看出，以單位有機(jī)酸土壤解磷量來(lái)衡量，土壤解磷效果以W2最好。高效液相色譜分析結(jié)果表明，W2分泌草酸，解磷細(xì)菌分泌的草酸可能是其攝取石灰性土壤磷素的必然機(jī)制，是解磷細(xì)菌長(zhǎng)期適應(yīng)此類土壤的自然選擇。有研究表明，在施用不同有機(jī)酸時(shí)，草酸對(duì)石灰性土壤的解磷效果最好[25-26]，這是因?yàn)椴菟釣楦唑匣钚杂袡C(jī)酸，適合于溶解石灰性土壤中的難溶性無(wú)機(jī)磷。本研究中，W1和W2分泌的草酸溶磷能力遠(yuǎn)大于W3和W4分泌的酒石酸，進(jìn)一步驗(yàn)證了以上研究結(jié)果。

本研究結(jié)果初步表明，將無(wú)機(jī)解磷細(xì)菌的發(fā)酵液直接施用到石灰性土壤中，可提高土壤有效磷含量。對(duì)于無(wú)機(jī)解磷菌的解磷機(jī)制，尚需做深入的研究，才能充分發(fā)揮土著微生物的解磷優(yōu)勢(shì), 為生產(chǎn)有機(jī)菌肥菌株的選育提供理論依據(jù)。

[1] 范丙全,金繼運(yùn),葛 誠(chéng).溶磷草酸青霉菌篩選及其溶磷效果的初步研究 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,35(5):525-530.

Fan B Q,Jin J Y,Ge C.Screening and preliminary researching of phosphate-solubilizing effect of phosphorus dissolving penicillium oxalicum [J].Scientia Agricultura Sinica,2002,35(5):525-530.(in Chinese)

[2] Delgado A,Madrid A,Kassem S,et al.Phosphorus fertilizer recovery from calcareous soils amended with humic and fulvic acids [J].Plant and Soil,2002,245(2):277-286.

[3] Rajakar P N,Tambekar D H,Wate S R.Study of phosphate solubilization efficiencies of fungi and bacteria isolated from saline belt of Purna river basin [J].Research Journal of Agriculture and Biological Sciences,2007，3(6):701-703.

[4] Goldstein H.Restricted unbiased iterative generalized least-sq-uares estimation [J].Biometrika,1989,76(3):622-623.

[5] Takahashi S,Anwar M R.Wheat grain yield,phosphorus upta-ke and soil phosphorus fraction after 23 years of annual fertilizer application to an andosol [J].Field Crops Research,2007,101(2):160-171.

[6] Chalfie M,Tu Y,Euskirchen G,et al.Green fluorescent protein as a marker for gene expression [J].Science,1994,263:802-805.

[7] Suarez A,Guttler A,Stratz M,et al.Green fluorescent protein-based reporter systems for genetic analysis of bacteria including monocopy applications [J].Gene,1997,196:69-74.

[8] 梁紹芬,阮祥穩(wěn)．解磷微生物肥料的作用和應(yīng)用 [J].土壤肥料,1994,6(2)：46-48.

Liang S F,Ruan X W.The role and application of phosphate-solubilizing microorganisms fertilizer [J].Soil Fertilizer,1994,6(2)：46-48.(in Chinese)

[9] 覃金麗,王真輝,陳秋波.根際解磷微生物研究進(jìn)展 [J].華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,12(2):44-49.

Qin J L,Wang Z H,Chen Q B.Review of rhizosphere phosphate-solubilizing microorganisms [J].Journal of South China University of Tropical Agriculture,2006,12(2):44-49.(in Chinese)

[10] Alam S,Khalil S,Ayub N,et al.Invitrosolubilization of inorganic phosphate by phosphate solubilizing microorganisms (PSM) from maize rhizosphere [J].Int J Agric Biol,2002,4:454-458.

[11] 胡曉峰,郭晉云,張 楠,等.一株溶磷抑病細(xì)菌的篩選及其溶磷特性 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(11):2253-2260.

Hu X F,Guo J Y,Zhang N，et al.Screening and studying of phosphate-solubilizing characteristics of a disease suppression PSB [J].Scientia Agricultura Sinica,2010,43(11):2253-2260.(in Chinese)

[12] 別小妹,陸兆新,房耀維,等.利用 16S rDNA 序列分析鑒定一株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的微生物菌株 [J].食品科學(xué),2006,27(11):466-470.

Bie X M,Lu Z X,Fang Y W,et al.Identification of a microbial strain producing antimicrobial substances by 16S rDNA sequence analysis [J].Food Science,2006,27(11):466-470.(in Chinese)

[13] 葉國(guó)平,梁錦鋒.解磷細(xì)菌 (PSB) 解磷機(jī)理及應(yīng)用研究進(jìn)展 [J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2007,13(9):53-54.

Ye G P,Liang J F.Phosphate-solubilizing bacteria (PSB) solubilization mechanism and application progress [J].Anhui Agricultural Science Bulletin,2007,13(9):53-54.(in Chinese)

[14] Wang Y K,Yu F,Tang C R.Screening and molecular identification of a phosphate-solubilizing bacteria in the plant rhizosphere of Hainan ecological zone [J].Journal of Microbiology,2009,49(1):64-71.

[15] 程麗娟,薛泉宏.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) [M].西安：世界圖書出版公司，2000.

Cheng L J,Xue Q H.Microbiology laboratory technology [M].Xi’an:World Publishing Company,2000.(in Chinese)

[16] 趙小蓉,林啟美,孫焱鑫,等.玉米根際與非根際解磷細(xì)菌的分布特點(diǎn) [J].生態(tài)學(xué)雜志,2001,20(6):62-64.

Zhao X R,Lin Q M,Sun Y X,et al.Distribution of maize rhizosphere and non-rhizosphere solubilizing bacteria [J].Journal of Ecology,2001,20(6):62-64.(in Chinese)

[17] Liu Y F.Improvement of gram stain method [J].Journal of Anshan Teachers College,2002,4(1):67-68.

[18] 布坎南R E,吉本斯N E.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè) [M].8版.劉復(fù)金，譯.北京:科學(xué)出版社,1984.

Bucana R E,Jibens N E.Berger’s manual of bacteria identification [M].8th ed.Liu F J,translated.Beijing：Science Press，1984.(in Chinese)

[19] 曲士松,劉憲華,黃寶勇,等.CTAB法提取大蒜、白菜基因組RNA [J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2000,31(4)：427-429.

Qu S S,Liu X H,Huang B Y,et al.Extraction of garlic, cabbage genomic RNA by CTAB method [J].Journal of Shandong Agriculture University:Natural Science Edition,2000,31(4)：427-429.(in Chinese)

[20] 張祥勝.鉬銻抗比色法測(cè)定磷細(xì)菌發(fā)酵液中有效磷含量測(cè)定值的影響因素分析 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(12):4822-4823.

Zhang X S.Colorimetric determination of phosphorus molybdenum,antimony anti-bacterial fermentation broth phosphorus content measured values influencing factors analysis [J].Anhui Agricultural Sciences,2008,36(12):4822-4823.(in Chinese)

[21] 蔣柏藩,顧益初.石灰性土壤無(wú)機(jī)磷分級(jí)體系的研究 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),1989,22(3):58-66.

Jiang B F,Gu Y C.Study of inorganic phosphorus classification system in calcareous soil [J].Scientia Agricultura Sinica,1989,22(3):58-66.(in Chinese)

[22] 李 娟,趙秉強(qiáng),李秀英,等.長(zhǎng)期有機(jī)無(wú)機(jī)肥料配施對(duì)土壤微生物學(xué)特性及土壤肥力的影響 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,41(1):144-152.

Li J,Zhao B Q,Li X Y,et al.Effects of long-term organic and inorganic fertilizers on microbial characteristics and soil fertility [J].Scientia Agricultura Sinica,2008,41(1):144-152.(in Chinese)[23] Rodriguez H,Fraga R.Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion [J].Biotechnology Advances,1999,17(4):319-339.

[24] 江 晶.長(zhǎng)期施肥對(duì)土壤無(wú)機(jī)磷形態(tài)及其剖面分布的影響 [D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2007:1-4.

Jiang J.The impact of long-term fertilization on soil inorganic phosphorus fractions and profile distribution [D].Lanzhou:Gansu Agricultural University Press,2007:1-4.(in Chinese)

[25] Gyaneshwar P,Kumar G N,Parekh L J.Effect of buffering on the phosphate-solubilizing ability of microorganisms [J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,1998,14(5):669-673.

[26] 楊紹瓊,黨廷輝,戚瑞生,等.低分子量有機(jī)酸對(duì)石灰性土壤有機(jī)磷組成及有效性的影響 [J].水土保持學(xué)報(bào),2012,26(4):167-171.

Yang S Q,Dang T H,Qi R S,et al.Effects of low molecular organic acids on calcareous soil organic phosphorus composition and effectiveness [J].Journal of Soil and Water Conservation,2012,26(4):167-171.(in Chinese)

Identification of PSB and their impact on soil inorganic phosphorus

PAN Hong,CAO Cui-ling,LIN Yan-bing,LI Xu,WANG Li

(CollegeofLifeScience,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study isolated phosphate-solubilizing bacteria (PSB) from northern calcareous soils,investigated their species, and detected their ability of solubilizing fixed phosphorus to provide reference for screening highly efficient and stable solubilizing strains.【Method】 Soil samples were collected from the rhizosphere ofBrassicarapachinensis,ActinidiachinensisandVitisviniferain Yangling,Shaanxi province.The soil bacteria were isolated by dilution plate method.Gram stain was employed to observe the bacteria appearance.Physicochemical properties of strains were also measured and combined with the 16S rRNA gene sequencing and blasting to identify the strains.Then the phosphate-solubilizing ability of each strain on solid and liquid medium was detected.After being cultured in liquid medium,inorganic phosphorus morphologies were determined in calcareous soil.【Result】 Ten PSB strains were obtained with 2 of them were organic phosphate-solubilizing bacteria:Y1 and Y2,4 strains were inorganic phosphate-solubilizing bacteria:W1,W2,W3 and W4,and 4 strains with capacity of dissolving both inorganic and organic phosphorus:WY1,WY2,WY3,and WY4.Eight of 10 strains were bacillus while the other 2 strains were bacillus brevisthe.Based on physicochemical properties and 16S rRNA sequence analysis,1 strain belonged toCitrobacteryoungae,1 belonged toBrevibacteriumfrigoritolerans,while the other 8 wereBacillus.Among the 8Bacillusstrains,4 were similar toBacilluscereus,1 belonged toBacillusmegaterium,1 wasBacillusaryabhattai,and 2 wereBacillusthuringiensis.After the inoculation of inorganic phosphate-solubilizing bacteria,the contents of Ca8-P and Ca2-P increased,the content of Fe-P decreased,while the contents of Al-P,Ca10-P and O-P changed slightly.【Conclusion】 PSB of calcareous soil were diverse,and inorganic PSB of calcareous soil increased available phosphorus.

phosphate-solubilizing bacteria;calcareous soil;16S rRNA identification;inorganic phosphorus fractionation

時(shí)間:2015-09-09 15:41

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.10.015

2014-03-05

陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2013K01-38)

潘 虹(1988-)，女，陜西咸陽(yáng)人，碩士，主要從事微生物資源利用及植物養(yǎng)分研究。E-mail：441595837@qq.com

曹翠玲(1960-)，女，陜西寶雞人，教授，博士，主要從事植物養(yǎng)分與水分生理研究。E-mail：cuilingcao@tom.com

Q939.96

A

1671-9387(2015)10-0114-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150909.1541.030.html