紫蘇內(nèi)生真菌Penicillium sp.12Y25化學(xué)成分及抑菌活性研究

李曉君，陳 鐵，李夢雪，李會珍，張志軍

(中北大學(xué) 化工與環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030051)

紫蘇內(nèi)生真菌Penicilliumsp.12Y25化學(xué)成分及抑菌活性研究

李曉君，陳 鐵，李夢雪，李會珍，張志軍

(中北大學(xué) 化工與環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030051)

【目的】 研究紫蘇內(nèi)生真菌Penicilliumsp.12Y25的化學(xué)成分及其抑菌活性，為開發(fā)新型天然藥物提供參考?！痉椒ā?以分離自山西太原健康紫蘇莖稈的內(nèi)生真菌為研究對象，采用硅膠柱層析和Sephadex LH-20凝膠柱層析等分離手段和現(xiàn)代光譜學(xué)技術(shù)，對其液體發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯提取物進(jìn)行了分離和結(jié)構(gòu)鑒定；采用菌絲速率法，測試了分離化合物對番茄灰霉病菌、西瓜枯萎病菌和小麥赤霉病菌等植物病原菌的抗菌活性?！窘Y(jié)果】 從紫蘇莖稈內(nèi)生真菌Penicilliumsp.12Y25發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯提取物中分離鑒定了10個(gè)化合物，分別為麥角甾醇過氧化物麥角甾-4,6,8,22-四烯-3-酮、9(11)-去氫麥角甾醇過氧化物、22E,24R-7,22-麥角甾二烯-3β,5α,6β-三醇、22E,24R-7,22-麥角甾二烯-3β,5α,6β,9α-四醇、麥角甾醇、單油酸甘油酯、α-亞麻酸、對甲氧基苯乙酸和對氨基苯乙酸，均為首次從該菌種中分離得到，其中22E，24R-7，22-麥角甾二烯-3β，5α，6β-三醇和22E，24R-7，22-麥角甾二烯-3β，5α，6β，9α-四醇對番茄灰霉菌和西瓜枯萎菌有中等強(qiáng)度的抑制活性?！窘Y(jié)論】 紫蘇內(nèi)生真菌Penicilliumsp.12Y25化學(xué)成分多樣，部分化合物具有植物病原菌抗菌活性。

紫蘇；內(nèi)生真菌；化學(xué)成分；抗菌活性

植物內(nèi)生真菌是指寄生于健康植物中，并在其各種組織、器官和細(xì)胞間隙中度過全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現(xiàn)任何癥狀的一類真菌。目前已知的植物中幾乎都發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生真菌的存在，且從不同植物體內(nèi)或同一植物不同時(shí)期分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量差異性較大[1]。在長期的演化過程中，植物內(nèi)生真菌與寄主植物形成了互利共生關(guān)系，一方面植物內(nèi)生真菌可以利用寄主植物提供的生長環(huán)境，吸收寄主植物的營養(yǎng)物質(zhì)供自己生長；另一方面，內(nèi)生真菌在植物生長發(fā)育尤其是逆境生長過程中發(fā)揮著重要作用，而維持這種關(guān)系的物質(zhì)基礎(chǔ)最重要的就是由植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生和(或)由其誘導(dǎo)刺激宿主植物合成的次生代謝產(chǎn)物。因此，對于藥用植物資源而言，研究其內(nèi)生真菌既可以避免大規(guī)模采摘對植物資源的破壞，也可以解決某些植物生長周期漫長、資源緊缺等因素帶來的藥源緊張問題，利用植物內(nèi)生真菌進(jìn)行工業(yè)化發(fā)酵將為某些重要天然藥物的開發(fā)與研究提供新思路和新方法[1]。

紫蘇(Perillafrutescens)系唇形科紫蘇屬一年生草本植物，為我國傳統(tǒng)的藥食、油料作物，作為一種多用途的經(jīng)濟(jì)植物其在我國已有2 000余年的栽培歷史，現(xiàn)廣泛分布于東亞各國[2]。紫蘇是衛(wèi)生部第一批規(guī)定的既是藥物又是食品的60種作物之一，其環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，耐貧瘠耐寒，非常適于在土壤干旱和貧瘠地區(qū)大面積種植?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，紫蘇具有降血脂血壓、保護(hù)肝臟、抑制血小板凝集、預(yù)防癌變、減少血栓形成、提高記憶能力、抗過敏、抗炎、抗微生物和保護(hù)視力等功效[2]。本課題組已經(jīng)對分離自健康紫蘇葉子的曲霉屬真菌Aspergillussp.12Y03的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，鑒定出的化合物包括環(huán)肽、甾醇和脂肪酸3種類型，并測試了相關(guān)化合物的海蝦致死活性[3]。本研究對另一株紫蘇內(nèi)生真菌Penicilliumsp.12Y25的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離鑒定研究，并分析了所分離化合物對部分植物病原菌的抑制活性，以期為該內(nèi)生真菌的開發(fā)利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫蘇內(nèi)生真菌Penicilliumsp.12Y25自山西太原的健康紫蘇(P.frutescens)莖稈中分離得到，經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定為曲霉屬，菌種保藏于中北大學(xué)生物資源化工研究所。

主要儀器有Avance Ⅲ 500MHz核磁共振波譜儀、Thermo DSQ-Ⅱ和Thermo Fisher LTQ Fleet型質(zhì)譜儀、Rudolph Autopol Ⅲ型旋光儀、XRG-1顯微熔點(diǎn)儀(溫度計(jì)未校正)、柱層析硅膠和薄層層析硅膠(均購自青島海洋化工廠)、Sephadex LH-20和RP-18(均為Merk公司產(chǎn)品)。

1.2 內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的提取與分離

將保藏菌種在PDA培養(yǎng)基(土豆 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂粉 16 g，用水定容至1 L)上進(jìn)行活化。將活化好的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基(土豆 200 g，葡萄糖 20 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，用水定容至1 L，pH 6.5～7.0)，28 ℃、120 r/min 培養(yǎng)7 d，總計(jì)發(fā)酵30 L。發(fā)酵結(jié)束后，過濾得菌絲體與發(fā)酵液。將菌絲體用甲醇超聲(15 min)提取3次，濃縮有機(jī)相得甲醇浸膏，適量溫水溶解后用等體積乙酸乙酯萃取3次，回收有機(jī)相得乙酸乙酯浸膏10.8 g；發(fā)酵液用等體積乙酸乙酯萃取3次，回收有機(jī)相得乙酸乙酯浸膏8.3 g，合并兩部分浸膏。浸膏經(jīng)過硅膠粗分、氯仿-甲醇梯度洗脫，得到6個(gè)組分(Fr.A～F)。其中Fr.A組分經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析、Sephadex LH-20甲醇凝膠柱層析和重結(jié)晶，得到化合物1(30 mg)、2(35 mg)、3(30 mg)、4(50 mg)；Fr.B組分經(jīng)過硅膠柱層析和重結(jié)晶得到化合物5(30 mg)和6(60 mg)；Fr.C組分經(jīng)Sephadex LH-20甲醇凝膠柱層析和硅膠柱層析得到化合物7(100 mg)和8(150 mg)；Fr. E組分經(jīng)硅膠柱層析和PTLC制備得到化合物9(10 mg)和10(15 mg)。

1.3 分離化合物的抗菌活性測試

采用菌絲生長速率法，測定了10種化合物在100 μg/mL質(zhì)量濃度下對番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporiumf.sp.Niveum)和小麥赤霉病菌(Gibberellasaubinetti)3種植物病原菌的抗菌活性。用PDA培養(yǎng)基配制含測試樣品(丙酮溶解)的無菌帶藥平板，用直徑4 mm的打孔器在預(yù)先培養(yǎng)好的植物病原真菌菌落邊緣制取菌餅，分別接種到帶藥平板，每皿接種3個(gè)，每處理重復(fù)3次，以等量溶解化合物所用的丙酮為空白對照，以相同質(zhì)量濃度的多菌靈為陽性對照。(28±0.5) ℃下培養(yǎng)3 d，十字交叉法測定菌落直徑，計(jì)算相對抑制率(I)[4]。計(jì)算公式為：

I=[(C-T)/C]×100%。

式中：I為菌絲生長相對抑制率，C為空白對照的菌落直徑，T為處理的菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

通過正相硅膠、反相硅膠和凝膠柱層析等分離技術(shù)，從紫蘇內(nèi)生真菌Penicilliumsp.12Y25發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯提取物中共分離得到10個(gè)化合物，借助核磁共振(NMR)和質(zhì)譜(MS)等波譜學(xué)方法，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-14]對化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，具體鑒定結(jié)果如下：

圖1 化合物1～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)

化合物8:黃色油狀物；1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ2.33 (2H,t,J=7.4 Hz,H-2),1.70～1.56 (2H,m,H-3),1.40～1.15 (8H,m,H-4～H-7),1.93 (4H,m,H-8,17),5.59～5.13 (6H,m,H-9,10,12,13,15,16),2.85 (4H,m,H-11,14),0.97 (3H,t,J=7.3 Hz,H-18);13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ180.1 (C-1),34.2 (C-2),24.5 (C-3),29.1 (C-4),29.2 (C-5),29.3 (C-6),30.0 (C-7),27.5 (C-8),130.5 (C-9),127.9 (C-10),25.5 (C-11),128.6 (C-12,13),26.0 (C-14),127.7 (C-15),132.7 (C-16),20.4 (C-17),14.6 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致，鑒定化合物8為α-亞麻酸(圖1-(8))。

化合物9:白色粉末；mp.84～86 ℃；ESI-MS (negative)m/z165 [M-H]-；1H-NMR (500 MHz,CDCl3) δ 7.20 (2H,d,J=8.5 Hz,H-2,6),6.75 (2H,d,J=8.5 Hz,H-3,5),3.70 (3H,s,OMe),3.60 (2H,s,H-7);13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ130.5 (C-1),125.6 (C-2,6),115.5 (C-3,5),155.0 (C-4),40.5 (C-7),173.0 (C-8),52.0 (OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，將化合物9鑒定為對甲氧基苯乙酸(圖1-(9))。

化合物10:白色結(jié)晶；mp.200～202 ℃；ESI-MS (positive)m/z152 [M+H]+,174 [M+Na]+；1H-NMR (500 MHz,C5D5N) δ 7.40 (2H,d,J=8.5 Hz,H-2,6),7.15 (2H,d,J=8.5 Hz, H-3,5),3.72 (2H,s,H-7),7.78 (2H,s,NH);13C-NMR (125 MHz,C5D5N) δ 127.5 (C-1),131.0 (C-2,6),116.5 (C-3,5),157.7 (C-4),43.0 (C-7),174.3 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，鑒定化合物10為對氨基苯乙酸(圖1-(10))。

2.2 化合物1～10的生物活性測試

采用菌絲生長速率法測試化合物1～10對3種植物病原菌的生物活性，結(jié)果(表1)顯示，與陽性對照多菌靈相比，10個(gè)化合物(100 μg/mL)對3種植物病原菌菌絲生長的抑制作用都較低。6個(gè)甾醇類化合物(化合物1～6)中，化合物4和5對番茄灰霉病菌和西瓜枯萎病菌菌絲生長的相對抑制率分別為52.3%，55.1%和55.6%，50.8%；而其余4個(gè)化合物的抗菌活性較弱，對上述2種病菌菌絲生長的相對抑制率為15.1%～18.1%和13.4%～21.3%。分析其結(jié)構(gòu)可知，在甾體母環(huán)上化合物4和5均連有羥基，而其他4個(gè)化合物則沒有，由此可以推測羥基的存在對甾醇類化合物的抗植物病原菌活性有增強(qiáng)作用。

表1 100 μg/mL化合物1～10對3種植物病原菌的抗菌活性Table 1 Inhibitory effects of compounds 1-10 against three phytopathogenic fungi (100 μg/mL) %

3 討 論

本研究從紫蘇內(nèi)生真菌Penicilliumsp.12Y25液體發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯提取物中分離鑒定了10個(gè)化合物，分別為麥角甾醇過氧化物、麥角甾-4,6,8,22-四烯-3-酮、9(11)-去氫麥角甾醇過氧化物、22E,24R-7,22-麥角甾二烯-3β,5α,6β-三醇、22E,24R-7,22-麥角甾二烯-3β,5α,6β,9α-四醇、麥角甾醇、單油酸甘油酯、α-亞麻酸、對甲氧基苯乙酸和對氨基苯乙酸，均為首次從該菌種中分離得到。在鑒定的化合物中，化合物1～6為甾醇類化合物，廣泛分布于植物、大型真菌和絲狀真菌中，該類化合物大多具有生物活性，包括抗菌和細(xì)胞毒活性[15]等，具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用前景。

分離自紫蘇內(nèi)生真菌Aspergillussp.12Y03的10個(gè)化合物中，有6個(gè)環(huán)二肽類、2個(gè)脂肪酸類和2個(gè)甾醇類化合物[3]；而本研究表明，分離自Penicilliumsp.12Y25的10個(gè)化合物中有6個(gè)甾醇類、2個(gè)脂肪酸類和2個(gè)苯乙酸類化合物，二者僅有2個(gè)化合物相同。鑒于兩者的次生代謝產(chǎn)物類型不同，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，本研究對分離得到的化合物進(jìn)行了植物病原菌抗菌活性測試，結(jié)果顯示，僅有22E,24R-7,22-麥角甾二烯-3β,5α,6β-三醇(化合物4)和22E,24R-7,22-麥角甾二烯-3β,5α,6β,9α-四醇(化合物5)對番茄灰霉病菌和西瓜枯萎病菌有中等強(qiáng)度的抗菌活性，其在100 μg/mL質(zhì)量濃度下對菌絲生長的相對抑制率為50.8%～55.6%，其余化合物的抗菌活性較弱。Aspergillussp.12Y03和Penicilliumsp.12Y25 2株內(nèi)生真菌雖然均來自于山西太原地區(qū)的紫蘇，但分別分離于健康紫蘇的莖稈和葉子，導(dǎo)致兩者分屬不同的種屬，進(jìn)而其次生代謝產(chǎn)物也具有很大的差異，這與銀杏內(nèi)生真菌化學(xué)成分的研究結(jié)果類似[16-20]，分離植物的地域、采集時(shí)期和分離部位等的差異將導(dǎo)致植物內(nèi)生真菌種屬和次生代謝產(chǎn)物的不同。所以在不同條件下多次進(jìn)行同一種植物內(nèi)生真菌的分離和篩選，不僅有利于全面了解植物內(nèi)生真菌的生物多樣性，而且對植物內(nèi)生菌來源的新型和高活性天然產(chǎn)物的獲得具有重要意義。

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Chemcial constituents and antimicrobial activities of endophytic fungusPenicilliumsp.12Y25 isolated fromPerillafrutescens

LI Xiao-jun,CHEN Tie,LI Meng-xue,LI Hui-zhen,ZHANG Zhi-jun

(CollegeofChemicalandEnvironmentalEngineering,NorthUniversityofChina,Taiyuan,Shanxi030051，China)

【Objective】 This study investigated the chemical constituents and antimicrobial active metabolites of endophytic fungusPenicilliumsp.12Y25 fromPerillafrutescensto provide reference for the development of new natural products.【Method】 This study used an endophytic fungus isolated from healthy stem ofP.frutescensin Taiyuan,Shanxi.The leavening ofPenicilliumsp.12Y25 was extracted with EtOAc,and the EtOAc extract was separated by silica gel CC and Sephadex LH-20.The structures of compounds were elucidated by spectroscopic methods,andinvitroantifungal activities of isolated compounds againstBotrytiscinerea,Fusariumoxysporiumf.sp.NiveumandGibberellasaubinettiwere evaluated by mycelial growth inhibitory rate method.【Result】 A total of ten compounds were isolated from the EtOAc extract ofPenicillumsp.12Y25 including ergosterol peroxide,such as ergosta-4,6,8,22-tetraen-3-one,9(11)-dehydroergosterol peroxide,cerevisterol,22E,24R-ergosta-7,22-diene-3β,5α,6β,9α-tetraol,ergosterol,glycerol-1-monooleate,α-linolenic acid,4-methoxyphenylacetic acid,and 4-aminophenylacetic acid.All compounds were isolated from this fungus for the first time.Compounds cerevisterol and 22E,24R-ergosta-7,22-diene-3β,5α,6β,9α-tetraol had moderate inhibitory effects againstB.cinereaandF.oxysporiumf.sp.Niveum.【Conclusion】 There were various chemical components from the endophytic fungusPenicilliumsp.12Y25,and some of them showed moderate inhibitory activities against phytopathogenic fungi.

Perillafrutescens;endophytic fungus;chemical constituents;antimicrobial activities

時(shí)間:2015-09-09 15:41

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.10.009

2014-03-10

山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(2013-080)；山西省國際科技合作項(xiàng)目(2013081004)

李曉君(1983-)，男，山西忻州人，講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail:xiaojunfeiyan@163.com

張志軍(1973-)，男，山西盂縣人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。 E-mail:zjzhang@nuc.edu.cn

Q501；Q503

A

1671-9387(2015)10-0064-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150909.1541.018.html