廣西漢族人群NPC1L1基因1 735 C>G多態(tài)性分布特征及與血脂、肥胖的關(guān)系

苗 林，尹瑞興，吳東峰

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣西柳州 545005；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，南寧 530021；3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院綜合干部病區(qū)，南寧 530021)

廣西漢族人群NPC1L1基因1 735 C>G多態(tài)性分布特征及與血脂、肥胖的關(guān)系

苗 林1，尹瑞興2△，吳東峰3

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣西柳州 545005；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，南寧 530021；3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院綜合干部病區(qū)，南寧 530021)

目的 分析NPC1L1基因1 735 C>G多態(tài)性分布特征及其與血脂、肥胖的關(guān)系。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法，對409例漢族人群進(jìn)行NPC1L1基因多態(tài)性分型，比較不同基因型間血脂水平、BMI的差異。結(jié)果CC,CG,GG基因型的分布頻率分別為39.40%、46.00%、14.60%；等位基因C和G頻率分別為62.35%和37.65%。3種基因型組間的LDL-C、ApoB水平和BMI的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，G等位基因攜帶者(GC/GG基因型)較CC型有更高的LDL-C、ApoB水平 (P<0.05)。血脂譜和BMI與多種環(huán)境因素相關(guān)。結(jié)論NPC1L1基因1 735 C>G多態(tài)性與血脂水平和BMI相關(guān)，G等位基因可能是高LDL-C水平和肥胖的一個危險因素。

多態(tài)性,單核苷酸；血脂異常；NPC1L1；人體質(zhì)量指數(shù)

血脂代謝紊亂和肥胖是動脈粥樣硬化和冠心病發(fā)生、發(fā)展的重要危險因素[1-2]。尼曼-匹克C1樣1(NPC1L1)蛋白是膽固醇跨膜轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵物質(zhì)，在小腸中高度表達(dá)，影響腸道膽固醇的吸收，以及調(diào)節(jié)其他血脂代謝基因的活性，對全身膽固醇穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[3-4]。研究顯示，NPC1L1基因多態(tài)性對其蛋白功能具有重要生物學(xué)效應(yīng)，從而影響膽固醇的水平[5-11]。本文研究NPC1L1基因1 735 C>G (rs2072183)多態(tài)性位點對血脂水平和肥胖的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 在廣西羅城縣采用分層隨機(jī)整群抽樣的方法組建了漢族人群標(biāo)本庫，從中隨機(jī)抽取409名漢族人群作為研究對象。其中男155例，女254例。排除有心臟病史、中風(fēng)史，糖尿病或空腹血糖水平大于或等于7.0 mmol/L者，及正在使用他汀類、貝特類、膽固醇吸收抑制劑(如依澤麥布片)、激素等影響血脂代謝相關(guān)藥物者。納入研究前患者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會許可。

1.2 方法 體檢項目：由專門人員測量身高、體質(zhì)量、腰圍和血壓等，并計算出BMI。?？漆t(yī)師詢問既往病史及生活習(xí)慣。血標(biāo)本采集及生化指標(biāo)檢測：禁食12 h，清晨空腹，坐位采取靜脈血8 mL，離心獲取血清。血清總膽固醇(TC)和三酰甘油(TG)的檢測采用標(biāo)準(zhǔn)酶法；血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)采用酶聯(lián)免疫一步法測定，載脂蛋白A-I(ApoA-I)和載脂蛋白B(ApoB)采用免疫透射比濁法。均在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗中心統(tǒng)一測定。DNA提取及PCR擴(kuò)增：取靜脈血3 mL，采用苯酚-氯仿法提取基因組DNA[12]。上游引物：5′-GGG ATG ACA GAT AGC ACC AA-3′，下游引物：5′-GAC ATC ACC TTC CAC CTC TTG-3′。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2.0 μL模板DNA，12.5 μL2×Taq PCR MasterMix (北京天根生物公司)，上下游引物各1.0 μL (10 μmol/L)，不足部分去離子水補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物使用TaqⅠ內(nèi)切酶酶切?？偡磻?yīng)體系10 μL：PCR產(chǎn)物5 μL，TaqⅠ 5 U (Fermentas公司),10×Buffer 1 μL，不足體積去離子水補(bǔ)足，65 ℃水浴12 h，2.0%瓊脂糖凝膠-核酸染料GELVIEW染色，100 V電泳40 min，紫外線下觀察、攝影。將PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物與DNA片斷長度標(biāo)準(zhǔn)物比較以鑒定基因型。PCR產(chǎn)物為437 bp；野生基因型CC酶切產(chǎn)物為2條帶，分別為169 bp和268 bp；突變型GG為437 bp；雜合型CG則為3條帶，分別是437、169、268 bp。隨機(jī)抽取3種基因型PCR產(chǎn)物經(jīng)上海生工測序證實。

表1 研究對象男女組間一般情況比較

2 結(jié) 果

2.1 一般情況比較 男性具有較高的BMI、腰圍、收縮壓、舒張壓、TC、TG、LDL-C、ApoB水平和較低的HDL-C水平(P<0.05)。兩組間年齡、血糖和ApoA-Ⅰ水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，男性中吸煙和飲酒比例明顯高于女性(P<0.05)。見表1。

2.2 電泳結(jié)果 NPC1L1基因rs2072183多態(tài)性的突變電泳圖譜，1條帶(437 bp)為突變純合子，2條帶(169、268 bp)為野生純合子，3條帶(437、169、268 bp)為雜合子。測序證實，見圖1、2。

M：100 bp Marker Ladder；1、2：GG基因型(437 bp)；3、4：GC基因型(437、169、268 bp)；5：CC基因型(169、268 bp)。

圖1 PCR產(chǎn)物酶切后電泳結(jié)果

1：GC基因型；2：CC基因型；3：CG基因型。

圖2 3種基因型測序圖

表2 不同基因型各項指標(biāo)的比較

2.3 基因分布 NPC1L1基因rs2072183多態(tài)性在廣西漢族人群中的分布符合Hardy-Weinberg 平衡。409例研究對象中CC、CG、GG基因型的分布頻率為39.40%、46.00%、14.60%，C和G等位基因頻率分別為62.35%和37.65%。男女之間基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 NPC1L1基因型與血脂水平和BMI的關(guān)系 3種基因型間LDL-C、ApoB和BMI水平存在顯著差異。G等位基因攜帶者具有較高的LDL-C和ApoB水平，CC和CG/GG組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。GG基因型具有較高的BMI，但G等位基因攜帶組與CC組比較，BMI差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.5 血脂和BMI相關(guān)因素分析 多元線性回歸分析顯示血脂和BMI與多種環(huán)境因素有著密切關(guān)系(P<0.05)，僅LDL-C及ApoB 水平與基因型有相關(guān)性(P<0.05)。BMI未發(fā)現(xiàn)與基因型有相關(guān)性，見表3。

表3 血脂和BMI相關(guān)因素分析

續(xù)表3 血脂和BMI相關(guān)因素分析

3 討 論

NPC1L1蛋白作為依澤麥布的作用靶點，調(diào)節(jié)腸腔內(nèi)膽固醇的吸收而為人熟知。NPC1L1蛋白主要分布于小腸上皮細(xì)胞的刷狀緣和肝細(xì)胞內(nèi)，在結(jié)構(gòu)上具有13個跨細(xì)胞膜區(qū)和固醇感知區(qū)域[13]。NPC1L1基因定位于染色體7p133，包括20個外顯子，19個內(nèi)含子[13]。研究發(fā)現(xiàn)，該基因單核苷酸基因多態(tài)性(SNP)影響膽固醇的吸收及血脂水平。1 735 C>G多態(tài)性位于第2外顯子的編碼區(qū)，關(guān)于其多態(tài)性分布特征，以及是否與血脂水平和肥胖相關(guān)的研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，中國廣西漢族人群G等位基因頻率為37.65%，GG、GC和CC基因型頻率分別為14.60%、46.00%和39.40%，男女之間等位基因分布無差異。廣西漢族G等位基因和GG基因型頻率與臺灣人群的35.7%、10.71%和上海地區(qū)漢族人群的37.3%、12.6%非常相似[7,14]，但均低于日本人群的41.90%和19.01%[9]。與歐美人群比較[11]，在高加索白人、美籍黑人和西班牙人群中，突變基因G頻率分別為21.9%、28.3% 和 17.9%，明顯低于亞洲人群。這提示G等位基因的突變具有顯著的種族差異性。

Teslovich等[15]進(jìn)行的多中心的GWAS研究發(fā)現(xiàn)NPC1L1基因變異與血脂代謝顯著相關(guān)，rs2072183多態(tài)性對血清TC和LDL-C水平有著重要影響。本研究顯示rs2072183多態(tài)性不僅對血脂水平，而且對BMI也有著重要影響。G等位基因攜帶者的血清LDL-C和ApoB水平顯著高于CC基因型組(P<0.05)，多元線性回歸分析亦表明LDL-C和ApoB和基因型有相關(guān)性。這和Polisecki等[8]在歐洲老年人中的研究結(jié)果一致，但卻和在其他亞裔人群的研究結(jié)果有所不同。Maeda等[9]在日本人群的研究顯示突變基因G對血清TC,HDL-C,LDL-C 和 ApoB水平無顯著性影響，但GG可升高菜油甾醇(膽固醇吸收的標(biāo)志)的水平,提示G等位基因可增加腸腔內(nèi)膽固醇的吸收，從而增加動脈粥樣硬化的風(fēng)險。Zhao等[5]研究發(fā)現(xiàn)基因1 735 C>G多態(tài)性位點尚通過形成單倍體影響血脂水平,比如單體型-18A-1735C-U328650A>G較其他單體型的血清LDL-C基礎(chǔ)水平低1.8 mg/dL。綜上可見，NPC1L1基因1 735 C>G多態(tài)性對血脂代謝有著重要影響，攜帶突變等位基因G的人群可能有著較高的血脂水平，但在不同種族中其對血脂譜的影響不同。多因素分析顯示多種環(huán)境因素與血脂譜相關(guān)，這種差異性也可能與環(huán)境因素或環(huán)境-基因相互作用對血脂譜的影響有關(guān)。

研究顯示NPC1L1基因敲除小鼠可避免肥胖[16]，但研究未得到一致結(jié)果[17]。BMI作為肥胖的重要衡量指標(biāo)，本研究表明，3種基因型間BMI水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且GG基因有著較高的BMI水平。但合并GG/GC后這種差異性消失，多元回歸分析亦未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。該結(jié)果提示NPC1L1基因1 735 C>G多態(tài)性可能影響肥胖的發(fā)生，但其是否為肥胖易感基因或是通過增加膽固醇的吸收而影響有待進(jìn)一步研究。

不可否認(rèn)，本研究存在一定局限性。(1)本研究共入選了409例某一地區(qū)漢族人群，樣本量小、單一，尚需在大樣本、不同種族人群中進(jìn)行驗證。(2)本研究僅探討了NPC1Ll基因單個多態(tài)位點與血脂譜和BMI的關(guān)系。由于單個位點的微小性，以及基因-基因和基因-環(huán)境因素的相互影響，可能導(dǎo)致與其他結(jié)果的不一致，尚需進(jìn)一步研究多個位點進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。(3)進(jìn)一步開展機(jī)制和功能方面的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，NPC1L1基因1 735 C>G多態(tài)性在中國漢族人群中廣泛存在，具有顯著的種族差異性。該基因突變位點G可能是高LDL-C水平和肥胖的一個危險因素。

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Distribution characteristics of NPC1L1 gene 1 735 C>G polymorphism and relationship between serum lipid levels and obesity in Guangxi Han population*

MiaoLin1,YinRuixing2△,WuDongfeng3

(1.DepartmentofCardiology,theFourthAffiliatedHospital,GuangxiMedicalUniversity,Liuzhou,Guangxi545005,China;2.DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospital,GuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China;3.DepartmentofComprehensiveCadre′sWard,thePeople′sHospitalofGuangxiZhuangzuAutonomousRegion,Nanning,Guangxi530021,China)

ObjectiveTo analyze the distributional characteristics ofNPC1L1 1 735 C>G polymorphism and the relationship between serum lipid levels and obesity in Guangxi Han population.Methods Genotyping of theNPC1L1 1 735 C>G polymorphism of 409 cases of Han was performed by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism combined with gel electrophoresis in all subjects.The relationship of different genotypes in blood lipid levels and obesity were evaluated.Results The frequency of CC,CG and GG genotypes was 39.40%,46.00% and 14.60% in Han.The frequency of C and G alleles was 62.35% and 37.65% in Han.The levels of BMI,LDL-C,ApoB was different among the three genotypes (P<0.05).The G allele carriers had higher serum LDL-C and ApoB levels than the G allele noncarriers (P<0.05).Serum lipid parameters and BMI were also correlated with some environmental factors.Conclusion The 1 735 C>G polymorphism in NPC1L1 gene may be correlated with serum lipid profiles and obesity,the G allele might increase the risk of hyperlipemia and obesity.

polymorphism,single nucleotide;dyslipidemias;niemann-pick c1-like 1;body mass index

·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.24.010

國家自然科學(xué)基金資助項目(30960130)。

苗林(1985-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事冠心病的基礎(chǔ)和臨床研究。

△通訊作者，E-mail：yinruixing@126.com。

R446

A

1671-8348(2015)24-3341-04

2015-02-20

2015-08-10)