草兔卵透明帶3(ZP3)基因真核表達載體的構(gòu)建與表達

吳景龍，隋丹丹，張冬輝，周智敏，李 昊，鄭雪莉，韓崇選

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

草兔卵透明帶3(ZP3)基因真核表達載體的構(gòu)建與表達

吳景龍，隋丹丹，張冬輝，周智敏，李 昊，鄭雪莉，韓崇選

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 利用基因重組技術(shù)將草兔卵透明帶3基因(ZP3)構(gòu)建到真核表達載體上，并在RK-13細(xì)胞中表達ZP3蛋白，為后期的免疫不育研究提供方便。【方法】 提取草兔卵巢總RNA，采用RT-PCR方法克隆ZP3基因，將其與pEGFP-N1真核表達載體連接，構(gòu)建pEGFP-N1-ZP3表達載體，并將載體轉(zhuǎn)入RK-13細(xì)胞中進行ZP3表達。利用倒置熒光顯微鏡、RT-PCR和Western Bolt方法對重組ZP3蛋白表達情況進行觀測?！窘Y(jié)果】 RT-PCR獲得長為1 260 bp的草兔ZP3基因；成功構(gòu)建pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染RK-13細(xì)胞后表達出73 ku的重組ZP3蛋白，RT-PCR驗證和Western Bolt結(jié)果與ZP3基因的理論長度一致?！窘Y(jié)論】 首次構(gòu)建了草兔ZP3基因真核表達載體并成功在真核細(xì)胞中表達重組ZP3蛋白。

草兔；卵透明帶3基因；免疫不育；pEGFP-N1；真核表達

草兔(Lepuscapensis)屬兔形目(Lagomorpha)兔科(Leporidae)，與穴兔屬(Oryctolagus)的歐洲兔以及新西蘭大白兔不同，屬山兔屬(Lepus)[1]，分布縱跨亞洲、歐洲和非洲，是一類適應(yīng)性很強的哺乳動物[2]。在我國，從海拔5 000 m以上的西北青藏高原到東部沿海平原，從東北寒冷的大興安嶺地區(qū)到最南端熱帶地區(qū)的海南島都有草兔的分布，甚至在極度干旱的戈壁和沙漠邊緣也有它們的活動蹤跡。近年來由于人為原因及自然災(zāi)害等因素的影響，草兔的活動更加猖獗，給我國的林業(yè)、農(nóng)業(yè)和牧業(yè)生產(chǎn)帶來了極大的損失[3]。然而現(xiàn)在的防治方法還停留在以控制死亡率為目的的傳統(tǒng)方法上，如機械捕殺、化學(xué)毒殺等，雖然這些方法短時間內(nèi)對于控制有害生物起到了顯著的效果，但是這些方法普遍存在工作量大、成本高、專一性差、滅效短、種群恢復(fù)快等缺點，而且化學(xué)毒殺方法對環(huán)境的污染及公眾的安全危害較大。隨著公眾對環(huán)保和動物權(quán)益等方面意識的增強，許多國家開始轉(zhuǎn)變有害生物防治的策略，通過減少出生率來控制其數(shù)量。應(yīng)運而生的免疫不育技術(shù)顯示出了相當(dāng)誘人的前景，其一方面使種群內(nèi)部分個體不能繁育，降低種群的出生率，另一方面不育個體存在繼續(xù)占用空間、消耗資源等競爭性繁殖干擾，保持緊張的社群壓力，從而抑制種群數(shù)量的恢復(fù)和發(fā)展。針對像鼠兔類這樣的生長發(fā)育快、性成熟早、妊娠期短、分娩后可立即發(fā)情交配、全年大部分時間都能繁殖且單胎仔數(shù)多的有害生物，免疫不育技術(shù)的防治效果很好。目前免疫不育已經(jīng)成為國際上最有潛力的種群控制技術(shù)[4]。

免疫不育技術(shù)是利用基因重組等分子生物學(xué)技術(shù)將草兔生育調(diào)控激素或相關(guān)蛋白與具有免疫活性的“碎片”或其他外源性大分子物質(zhì)連接起來形成抗原，使機體產(chǎn)生破壞自身生殖的抗體，達到阻斷生育的目的。由于免疫不育的抗原自身具有種的特異性，如果再加上專一性強的病原微生物攜帶和傳播[5-6]，不僅解決了疫苗傳遞的問題，降低成本，提高防治效率，而且對防治對象的專一性有了“雙保險”的作用。通過免疫途徑使動物不育，最關(guān)鍵的是選擇免疫不育疫苗，目前避孕疫苗抗原研究主要集中在激素抗原、精子抗原和卵透明帶這3類靶抗原上。其中哺乳動物卵透明帶(Zona pellucida，ZP)是由卵母細(xì)胞合成和分泌并包裹在其外部的一層糖蛋白基質(zhì)，由3～4種蛋白組成，分別稱為ZP1、ZP2、ZP3和ZP4[7-8]，是精卵結(jié)合的特異性識別媒介，是精子的最初受體，對卵子生成、精卵結(jié)合和早期胚胎發(fā)育具有重要作用[9]。大量研究表明，ZP3蛋白能以抗原的形式干擾精子與正常ZP3的結(jié)合而阻斷小鼠、豬、猴子等的生殖過程[10-11]。同時有研究表明，各物種ZP3的羧基端及糖支鏈特異性抗原表位相對應(yīng)的區(qū)域同源性極低，即使在小鼠和倉鼠之間也不例外，而且ZP3蛋白是卵巢特有的，在其他組織中不表達，不會離開卵巢進入血液循環(huán)，不會形成復(fù)雜的免疫復(fù)合體以及與其他組織發(fā)生交叉反應(yīng)或引起激素水平上的紊亂，因此ZP3蛋白在免疫過程中有很高的種屬特異性和組織特異性，是一種很有前途的抗生育疫苗。

有研究證實，ZP3蛋白在哺乳動物中能產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)，具有顯著的抗生育作用，利用ZP3蛋白免疫能大大降低動物的受精率。目前已有人[12]、小鼠[13]、狗[7,14]、草原兔尾鼠(Laguruslagurus)[15-16]、歐洲兔(Oryctolaguscuniculus)[17]、帽猴(Macacaradiata)[18-20]、狒狒(Papioanubis)[21]、鯉魚[22]、考拉(Phascolarctoscinereus)[23]和刷尾負(fù)鼠(Trichosurusvulpecula)[24-25]等多種哺乳動物的卵透明帶蛋白成功在各種表達系統(tǒng)中表達并用于免疫不育的研究，但有關(guān)草兔ZP3蛋白的免疫效果卻未見報道。本研究對草兔ZP3基因進行了克隆，構(gòu)建其增強型綠色熒光蛋白pEGFP-N1-ZP3真核表達載體，并對表達載體進行轉(zhuǎn)染和表達，旨在為進一步深入研究草兔免疫不育疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物 草兔捕自陜北黃土高原地區(qū)，雌性，體長30 cm左右。

1.1.2 試 劑 RNAout提取試劑盒，購自上海生工；RQ1 RNase-Free DNase，購自Promega公司；高效瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒及去內(nèi)毒素大提試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，購自Fermentas公司；連接試劑盒DNA Ligation Kit Ver.2.1、QuickCutXhoⅠ/EcoRⅠ，購自TaKaRa(大連)生物有限公司；南美胎牛血清(FBS)、DMEM、100×青霉素鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶溶液及細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Reagent，購自Thermo公司；Opti-MEM，購自Gbico公司；2×TaqMasterMix、DNA Marker、抗His標(biāo)簽鼠單抗、抗GFP標(biāo)簽鼠單抗、抗GAPDH內(nèi)參鼠單抗，二抗Goat Anti-Mouse IgG及eECL Western Blot高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.3 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞 克隆載體T-Vector pMD19 (Simple)購自TaKaRa(大連)生物有限公司；真核表達載體pEGFP-N1由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院張成成博士饋贈；大腸桿菌克隆菌株DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔腎臟細(xì)胞(RK-13)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 草兔卵巢總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

將剛捕獲的草兔從籠中提起，用木槌等硬物用力敲擊其后腦處處死，整個過程應(yīng)做好防護，避免因草兔掙扎而受傷。待確認(rèn)草兔已死亡后，將其腹面朝上固定于解剖臺上，解剖取出卵巢組織，液氮中保存待用。取2只兔子的卵巢于液氮中快速研磨，按照RNAout試劑盒說明提取總RNA，超微量紫外分光光度計檢測其總RNA濃度及質(zhì)量，1.2%瓊脂糖凝膠電泳輔助檢測，如果有DNA殘留，用無RNA酶的DNA酶試劑盒進行消化，然后用First-Strand cDNA Synthesis Kit進行cDNA第一鏈的合成。

1.3 草兔ZP3全長cDNA的克隆及測序

根據(jù)西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院森林鼠、兔害防治實驗室在GenBank上登錄的ZP3基因開放閱讀框序列(GenBank登錄號：KC447289.1)[26]設(shè)計全長引物，上游引物(F1)：5′-ATGGGGCTGAGCTACGGG-3′，下游引物(R1)：5′-TTATTGGGAAGCAGACCTGG-3′，委托上海生工合成。

以合成的cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系50 μL：2×TaqMasterMix 25 μL，引物F1、R1終濃度均為0.5 μmol/L，模板cDNA 30 ng，ddH2O 補足50 μL。擴增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次；最后72 ℃終止補償延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖電泳和紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測。

PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒進行回收，將回收的產(chǎn)物目標(biāo)片段亞克隆于T-Vector pMD19 (Simple)載體上，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌菌株感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素(Amp)、24 μg/mL IPTG和20 μg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的平板上過夜培養(yǎng)，進行藍白斑篩選。次日挑取白色單克隆搖管培養(yǎng)，進行菌液PCR驗證，驗證正確的克隆菌液寄往上海生工，用T-Vector pMD19 (Simple)載體通用引物進行雙向測序，測序結(jié)果用MEGA 5.0軟件進行拼接并與數(shù)據(jù)庫進行比對驗證。

1.4 pEGFP-N1-ZP3真核表達載體的構(gòu)建及鑒定

1.4.1 真核表達目的基因ZP3引物的設(shè)計 設(shè)計兩端分別帶有XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點的草兔ZP3全長引物，上游引物(F2)：5′-CCGCTCGAGATGGGGCTGAGCTACGGGCTC-3′，下游引物(R2)：5′-CCGGAATTCCTTGGGAAGCAGACCTGGGGTG-3′，其中上游引物(F2)包含一個起始密碼子(ATG)方便蛋白轉(zhuǎn)錄起始(下劃線標(biāo)注為XhoⅠ酶切位點)，下游引物(R2)已去掉ZP3終止密碼子(TAA)以利于其與后邊相連的GFP融合表達(下劃線標(biāo)注為EcoRⅠ酶切位點)。引物委托上海生工合成。

1.4.2 真核表達目的基因ZP3的獲得 以1.3中構(gòu)建并驗證正確的pMD-19T-ZP3克隆為模板，F(xiàn)2和R2為引物，菌液PCR(PCR體系及程序同1.3)獲得帶XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點的目的基因ZP3。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒回收，回收DNA用超微量紫外分光光度計檢測其濃度及質(zhì)量，同時用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳輔助檢測。

1.4.3 真核表達載體pEGFP-N1的獲得 提前1 d用試管培養(yǎng)適量的帶pEGFP-N1質(zhì)粒的DH5α大腸桿菌菌株，用質(zhì)粒小提試劑盒提取pEGFP-N1質(zhì)粒，超微量紫外分光光度計檢測其濃度及質(zhì)量，同時用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳輔助檢測。

1.4.4 真核表達載體pEGFP-N1和目的基因ZP3的酶切、連接及轉(zhuǎn)化 將1.4.2得到的ZP3基因和1.4.3得到的pEGFP-N1質(zhì)粒均用XhoⅠ和EcoRⅠ QuickCut限制酶37 ℃酶切1 h。用凝膠回收試劑盒分別回收已酶切的ZP3目的基因片段和pEGFP-N1載體片段，2個片段用DNA Ligation Kit Ver.2.1連接試劑盒16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α菌株。為提高構(gòu)建成功率，在將2個片段混合之后65 ℃熱激4 min，迅速冰浴2 min，然后再加SolutionⅠ過夜連接，同時在轉(zhuǎn)化之前加1 μL轉(zhuǎn)化增強劑Solution Ⅲ(DNA Ligation Kit Ver.2.1連接試劑盒中包含SolutionⅠ和Solution Ⅲ)。

1.4.5 pEGFP-N1-ZP3轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定 將所得pEGFP-N1-ZP3轉(zhuǎn)化子涂布于含50 μg/mL硫酸卡那霉素(Kana)的LB平板上過夜篩選培養(yǎng)，次日挑取單菌落搖菌，菌液PCR驗證，同時提取pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒分別進行XhoⅠ、EcoRⅠ單酶切及XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切驗證。

將上述菌液PCR驗證和單/雙酶切驗證均正確的單克隆菌液寄至上海生工，用pEGFP-N1載體通用引物進行雙向測序，測序結(jié)果用MEGA 5.0軟件進行拼接并比對驗證。

1.5 pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒的大量制備

將驗證正確的pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒菌株接種于200 mL LB培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，超微量紫外分光光度計及凝膠電泳檢測質(zhì)粒質(zhì)量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 RK-13細(xì)胞培養(yǎng)及pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

1.6.1 RK-13細(xì)胞的培養(yǎng) RK-13細(xì)胞培養(yǎng)用含有100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素及體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱設(shè)置參數(shù)為體積分?jǐn)?shù)5% CO2，37 ℃。細(xì)胞培養(yǎng)液每天更換1次，2～3 d傳代1次。

1.6.2 RK-13轉(zhuǎn)染細(xì)胞的準(zhǔn)備 將生長狀態(tài)良好的RK-13細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰蛋白酶消化，新鮮培養(yǎng)基重懸，取適量細(xì)胞懸液臺盼藍染色，在倒置顯微鏡下用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，按每孔約5×104個細(xì)胞的接種量接種于24孔板中，體積分?jǐn)?shù)5% CO2，37 ℃培養(yǎng)。

1.6.3 pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 當(dāng)24孔板中的細(xì)胞匯合度達到60%～70%時棄去舊培養(yǎng)基，更換新的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染時每孔重組質(zhì)粒用量1 μg。具體操作如下：取1 μg pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒，用100 μL的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，加入2 μL的TurboFect轉(zhuǎn)染試劑，移液槍吹打混勻，室溫孵育17 min后逐滴加入上述24孔板中，輕輕搖勻，37 ℃繼續(xù)孵育。12 h后換液，期間如果觀察到細(xì)胞狀態(tài)不佳應(yīng)及時換液，48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達情況。在轉(zhuǎn)染時同時設(shè)置空白RK-13細(xì)胞及pEGFP-N1空載體轉(zhuǎn)染RK-13細(xì)胞對照組。

1.7 轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒的RK-13細(xì)胞中ZP3基因的RT-PCR檢測

用RNAout試劑盒分別提取轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-ZP3或pEGFP-N1載體的RK-13細(xì)胞及空白RK-13細(xì)胞的總RNA，以提取的總RNA為模板， F2和R2為引物，按照One Step RT-PCR Kit操作手冊，RT-PCR法分別檢測這3種RK-13細(xì)胞中目的基因ZP3的表達情況。

1.8 ZP3在RK-13細(xì)胞中的大量表達及Western Blot檢測

將RK-13細(xì)胞轉(zhuǎn)染體系按比例放大到60 mm培養(yǎng)皿中進行轉(zhuǎn)染表達，48 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌，細(xì)胞裂解液裂解后收集蛋白，取適量樣品用蛋白定量試劑盒定量后加蛋白loading buffer，沸水浴10 min，14 000 r/min離心10 min收集上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取上述已處理樣品適量，用8%分離膠的SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜。將轉(zhuǎn)好的膜在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉2 h，封閉完將膜從預(yù)染蛋白Marker 45 ku左右的位置剪開一分為二，蛋白分子質(zhì)量大的一塊膜封于含5 mL抗GFP標(biāo)簽鼠單克隆抗體(1∶700稀釋)的雜交小袋中，另外一塊封于裝抗GAPDH的鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)雜交小袋中，4 ℃孵育過夜。次日分別用TBST洗膜，洗完后將2塊膜一起放入HRP偶聯(lián)的兔抗鼠二抗(1∶5 000稀釋)中室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯影，Bio-Rad Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)成像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草兔ZP3基因的克隆

提取的總RNA電泳結(jié)果顯示，28S和18S條帶清晰，A260/A280為1.98，RNA含量為213.54 ng/μL；PCR擴增得到長度約為1 250 bp的條帶(圖1)，與理論值相符；測序結(jié)果顯示其長度為1 260 bp，無堿基缺失及突變。

圖1 草兔ZP3基因的克隆

2.2 草兔pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒的鑒定

從1.4.5轉(zhuǎn)化的瓊脂糖平板上挑取8個pEGFP-N1-ZP3轉(zhuǎn)化子陽性克隆，擴大培養(yǎng)，菌液PCR檢測獲得了約1 250 bp的條帶(圖2)，條帶長度與理論值一致。選取其中4個克隆提取質(zhì)粒，XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后得到1 250 bp的pEGFP-N1-ZP3目的基因片段和4.7 kb的載體片段；XhoⅠ、EcoRⅠ單酶切均獲得1條線性重組質(zhì)粒條帶，大小比雙酶切的線性載體條帶稍大；而重組質(zhì)粒由于是超螺旋結(jié)構(gòu)，電泳速度比線性質(zhì)粒稍快，因此顯示比單酶切的條帶稍小一些(圖3泳道1)。測序結(jié)果顯示，構(gòu)建的pEGFP-N1-ZP3重組質(zhì)粒ZP3基因長度及序列與理論值一致。

圖2 草兔真核表達載體pEGFP-N1-ZP3的菌液PCR檢測

2.3 草兔ZP3在RK-13細(xì)胞中表達的熒光觀察

RK-13細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后置于倒置熒光顯微鏡下觀察，可見轉(zhuǎn)染pEGFP-N1(圖4-A)和pEGFP-N1-ZP3(圖4-D)的RK-13細(xì)胞均有綠色熒光，多為明亮的綠色熒光，少數(shù)發(fā)出弱熒光；與眀場中的RK-13細(xì)胞(圖4-C)相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-ZP3的細(xì)胞約75%成功表達；空白RK-13細(xì)胞對照無表達，未見綠色熒光(圖4-B)。

圖3 草兔真核表達載體pEGFP-N1-ZP3的單雙酶切鑒定M．DNA Marker；1.重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ZP3；2.重組質(zhì)粒XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切；3.重組質(zhì)粒XhoⅠ單酶切；4.重組質(zhì)粒EcoRⅠ單酶切

圖4 草兔ZP3-GFP融合蛋白在RK-13細(xì)胞中表達的熒光顯微鏡觀察(48 h)A.轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體的RK-13細(xì)胞(暗場激光激發(fā))；B.空白RK-13細(xì)胞(暗場激光激發(fā))；C.轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-ZP3的RK-13細(xì)胞(明場)；D.轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-ZP3的RK-13細(xì)胞(暗場激光激發(fā))
Fig.4 Analysis of ZP3-GFP expression in RK-13 cells after 48 hours with fluorescence microscopy A.RK-13 cells transfected with pEGFP-N1 as control;B.RK-13 cells without being transfected as control;C.Expression of pEGFP-N1-ZP3 cells in bright field;D.Expression of pEGFP-N1-ZP3 cells with green fluorescence

2.4 草兔ZP3在RK-13細(xì)胞中表達的RT-PCR檢測

RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，在約1 250 bp處有一清晰條帶(圖5)，與ZP3基因理論長度相符，說明ZP3基因轉(zhuǎn)入RK-13細(xì)胞中并成功轉(zhuǎn)錄。

2.5 草兔ZP3-GFP重組蛋白的Western Blot檢測

RK-13表達細(xì)胞的裂解液上清經(jīng)SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，與抗GFP的一抗反應(yīng)后在約73 ku處有一條陽性反應(yīng)條帶，與理論大小一致，而空細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體細(xì)胞沒有陽性條帶(圖6-A)，表明ZP3-GFP融合蛋白在RK-13細(xì)胞中成功表達。GAPDH內(nèi)參條帶亮度基本一致(圖6-B)，從側(cè)面說明3個處理組上樣量一致。

圖5 轉(zhuǎn)染RK-13細(xì)胞中草兔ZP3基因的RT-PCR檢測M．DNA Marker；1.轉(zhuǎn)染重組表達載體pEGFP-N1-ZP3的RK-13細(xì)胞；2.轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-N1的RK-13細(xì)胞；3.未轉(zhuǎn)染的空白RK-13細(xì)胞Fig.5 Analysis of expression products of ZP3 in RK-13 cells by RT-PCR M.DNA Marker;1.RK-13 cells transfected by pEGFP-N1-ZP3;2.RK-13 cells transfected by pEGFP-N1 as control;3.RK-13 cells without being transfected as control

圖6 草兔ZP3-GFP重組蛋白的Western Blot分析 A.一抗為抗GFP的鼠單克隆抗體；B.內(nèi)參基因GAPDH(為保證上樣量一致)，一抗為抗GAPDH的鼠單克隆抗體 1.空白RK-13細(xì)胞對照；2.轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-N1的RK-13細(xì)胞；3.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ZP3的RK-13細(xì)胞Fig.6 Analysis of expression products of ZP3-GFP in RK-13 cells by Western Blot A.Anti-GFP Western Blot;B.Anti-GAPDH Western Blot to equalize the quantity of loading protein;1.RK-13 cells transfected without being transfected as control;2.The cells transfected with pEGFP-N1;3.The cells transfected with pEGP-N1-ZP3

3 討論與結(jié)論

ZP3免疫不育研究最多的是豬ZP3蛋白，印度新德里國家免疫學(xué)中心配子抗原實驗室曾用豬的ZP3α蛋白輔以弗氏完全佐劑免疫帽猴，成功使其不育，但當(dāng)抗體滴度下降時，大約有一半的猴子又重新獲得了妊娠能力[27-28]。用ZP3免疫在降低受精率的同時伴隨有部分動物自身免疫卵巢炎反應(yīng)，卵巢結(jié)構(gòu)遭受不同程度的破壞，卵泡的發(fā)育也受到影響[29-31]。但有害生物防治不同于人類避孕研究，不需要考慮避孕的可逆性，以及免疫動物是否患有卵巢炎及生殖系統(tǒng)被破壞等問題，只要能提高免疫不育的成功率和持久性就行[32]。

目前迫切要解決的問題是要從ZP3蛋白序列中選擇一段能夠產(chǎn)生免疫不育的蛋白表位片段。研究表明，ZP3蛋白非常保守，其家族成員在結(jié)構(gòu)上都有位于N端的22個氨基酸的信號肽序列、位于尾部C端弗林蛋白酶的切割位點和跨膜區(qū)，以及中間大約260個氨基酸的保守序列[33]。有數(shù)據(jù)顯示，人的ZP3蛋白氨基酸序列與小鼠有67%的相似度，與兔子有69%相似，與豬有74%相似，與帽猴的相似度甚至達到93.9%[34]，并且這些物種之間大多都存在交叉免疫反應(yīng)，用他們的ZP3來免疫異種動物都會出現(xiàn)免疫反應(yīng)[29,35-36]，因此本試驗選擇的免疫表位片段不僅要包括ZP3特性的保守區(qū)域，還要帶有草兔特異性的識別區(qū)域，以保證免疫靶動物的準(zhǔn)確性。資料顯示，關(guān)于ZP3的研究大多都集中在其去信號肽和去跨膜區(qū)的保守片段與此片段在原核表達系統(tǒng)中的表達及其免疫原性上。本研究前期曾嘗試?yán)胮ET-28a(+)載體在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中表達，試驗經(jīng)過2個階段：第1階段是以去掉前端信號肽的ZP3為目的基因插入pET-28a(+)載體與His標(biāo)簽融合表達[37]，但可能是后端疏水的跨膜區(qū)影響，ZP3融合蛋白表達量不高；因此第2階段同時去掉了信號肽和跨膜區(qū)區(qū)域，只留核心片段，表達量有所提高，但蛋白以包涵體的形式存在，不利于后期的純化和免疫。有關(guān)ZP3蛋白免疫原性的研究表明，ZP3蛋白在表達過程中有很多后期的N-和O-鏈接糖支鏈修飾，其是精子識別和結(jié)合的重要抗原決定簇位點，起著關(guān)鍵性的作用[38]。但原核表達系統(tǒng)由于沒有復(fù)雜的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和信號調(diào)控，并且目標(biāo)蛋白前段的幫助轉(zhuǎn)運和分泌的信號肽序列也被去掉，因此目標(biāo)蛋白在表達過程中不存在后期的甲基化和糖基化等修飾，以及二硫鍵和多肽折疊高級結(jié)構(gòu)的形成。故原核表達系統(tǒng)表達出來的蛋白與天然蛋白相差甚遠(yuǎn)，更談不上其免疫原性和特異性。

鑒于前期的探索性試驗，本研究選擇用哺乳動物細(xì)胞真核表達系統(tǒng)來表達ZP3蛋白。相對于其他表達系統(tǒng)，哺乳動物表達系統(tǒng)具有更準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達的蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白分子，表達蛋白可以分泌到細(xì)胞外部便于下游產(chǎn)物分離純化，且外源基因可以整合表達，穩(wěn)定遺傳。在本試驗中，表達載體采用pEGFP-N1穿梭質(zhì)粒，其含有一個編碼GFP的基因片段，可在哺乳動物細(xì)胞中高效融合表達，方便檢測。綠色熒光蛋白編碼序列的上游有巨細(xì)胞病毒的早期啟動子序列和Kozak序列，可促進外源基因的表達起始。多克隆位點可供外源基因片段插入，而外源基因片段無終止密碼，且基因讀碼框架與GFP基因讀碼框架一致，可與GFP蛋白融合表達。表達ZP3的宿主細(xì)胞則選用分類上與草兔更接近的兔源RK-13細(xì)胞。

在重組蛋白的轉(zhuǎn)染表達過程中，雖然蛋白得到成功表達，但是筆者發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染過程中重組質(zhì)粒的質(zhì)量及其與轉(zhuǎn)染試劑的比例非常重要。本試驗中，分別采用普通的質(zhì)粒提取試劑盒和去內(nèi)毒素試劑盒來提取轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒，其中普通試劑盒試驗組在轉(zhuǎn)染表達后期細(xì)胞死亡很多，細(xì)胞狀態(tài)很差，而去內(nèi)毒素試劑盒組的細(xì)胞相對前者好很多。同時質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的量太低轉(zhuǎn)染效率不高，太高則影響細(xì)胞的生長；兩者之間比例不同，轉(zhuǎn)染效率也不同。因此在采用不同的表達系統(tǒng)和宿主細(xì)胞表達時優(yōu)化很重要，需要長期摸索適宜的條件。另外細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清成分十分復(fù)雜，不利于下游分泌蛋白的分離純化，因此探索一種低血清或無血清的培養(yǎng)基很重要。

由于重組蛋白帶有綠色熒光可在激發(fā)光下直接觀察，下一步試驗可用pEGFP-N1-ZP3重組載體直接注射免疫草兔，研究其在活體內(nèi)的表達和免疫；也可以采用His標(biāo)簽代替GFP標(biāo)簽構(gòu)建重組載體，以制備His融合的ZP3蛋白，用Ni離子親和柱一步純化分離ZP3蛋白免疫草兔；同時也可以考慮用純化的蛋白和構(gòu)建好的重組真核表達載體同時注射草兔聯(lián)合免疫研究草兔免疫不育；另外，構(gòu)建病毒表達載體以及以特異性更強的兔黏液瘤病毒為載體來傳播疫苗也是一種途徑。

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Construction and expression of eukaryotic expression vector ofZP3 gene fromLepuscapensis(brown hare)

WU Jing-long,SUI Dan-dan,ZHANG Dong-hui,ZHOU Zhi-min, LI Hao,ZHENG Xue-li,HAN Chong-xuan

(CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The eukaryotic expression vector ofZP3 gene fromLepuscapensis(brown hare) was constructed by recombinant-DNA technique and expressed in RK-13 cells to improve the study of immunocontraception.【Method】 The ovarian RNA was purified from rabbit (Lepuscapensis) ovaries.The full-length ofZP3 gene cloned with RT-PCR was connected with the pEGFP-N1 vector to form pEGFP-N1-ZP3 expression vector before being expressed in RK-13 cells.The expression ofZP3 was detected with RT-PCR,Western Blot analysis and fluorescence microscopy.【Result】 The full-length ofZP3 gene was 1 260 bp,and the recombinant plasmid pEGFP-N1-ZP3 was successfully constructed.The recombinantZP3 obtained from RK-13 cells was 73 ku.Western Blot and RT-PCR further proved that the pEGFP-N1-ZP3 was expressedinvitro.【Conclusion】 This is the first study that successfully cloned the recombinantZP3 into eukaryotic expression vector and expressed it in RK-13 cells.

Lepuscapensis(brown hare);zona pellucida 3 (ZP3) gene;immunocontraception;pEGFP-N1;eukaryotic expression

時間:2015-10-13 08:46

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.002

2014-03-31

國家林業(yè)公益性行業(yè)專項(201404405)；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費項目(QN2012036)

吳景龍(1986-)，男，河南南陽人，碩士，主要從事草兔免疫不育疫苗研究。E-mail：lifehouse635@163.com

韓崇選(1962-)，男，陜西西安人，教授，主要從事森林鼠、兔害治理研究。E-mail：sendakingcat@qq.com

S829.1

A

1671-9387(2015)11-0009-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.004.html