西格列汀對肥胖大鼠血清及不同組織視黃醇結(jié)合蛋白4表達水平的影響

戚仁娟，胡紅琳，夏 莉，劉炯炯，王長江，方朝暉

◇藥學研究◇

西格列汀對肥胖大鼠血清及不同組織視黃醇結(jié)合蛋白4表達水平的影響

戚仁娟1，胡紅琳1，夏 莉1，劉炯炯1，王長江1，方朝暉2

目的研究西格列汀對肥胖大鼠代謝指標、血清視黃醇結(jié)合蛋白4（RBP4）及附睪脂肪、肝臟組織RBP4表達水平的影響。方法 將40只SD大鼠隨機分為對照組（ND組，n＝10）和高脂組（HD組，n＝30）。16周后HD組成功建立肥胖模型（n＝16），并隨機分為肥胖對照組（OB組，n＝8）、西格列汀干預組（SITA組，n＝8）。分別測定干預前后體重（BW）、空腹血糖（FBG）、三酰甘油（TG）、膽固醇（TCH）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、空腹胰島素（FINS）及血清RBP4水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMAIR）。Western blot法檢測大鼠附睪脂肪和肝臟組織RBP4表達水平。結(jié)果①與ND組相比，HD組BW、FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOMA-IR、RBP4升高，HDL-C降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。在HD組中，OB組、SITA組間各指標差異無統(tǒng)計學意義。西格列汀干預后，SITA組較OB組FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOMA-IR、RBP4降低，HDL-C升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。②與ND組比較，OB組附睪脂肪RBP4蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05）；與OB組相比，SITA組附睪脂肪RBP4蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。③Pearson相關(guān)分析顯示ND組、血清RBP4與TG呈正相關(guān)性；HD組、血清RBP4與FINS、HOMA-IR、TG、附睪脂肪RBP4呈正相關(guān)性，與HDL-C呈負相關(guān)性。結(jié)論 肥胖大鼠血清RBP4水平升高，附睪脂肪RBP4表達水平增高。西格列汀干預能顯著降低肥胖大鼠血清RBP4水平及附睪脂肪中RBP4蛋白表達水平，并可改善糖脂代謝。

肥胖癥；胰島素抵抗；西格列?。灰朁S醇結(jié)合蛋白4

脂肪組織不僅是能量儲存器官，還是活躍的內(nèi)分泌器官，可以分泌眾多與代謝相關(guān)的脂肪因子，如內(nèi)臟脂肪素、瘦素、視黃醇結(jié)合蛋白4（retinol binding protein 4，RBP4）等［1］。這些脂肪因子在肥胖患者胰島素抵抗的發(fā)生與心血管并發(fā)癥的發(fā)生中起重要作用。研究［2］表明，肥胖患者血清RBP4水平升高。目前，RBP4與肥胖的相關(guān)研究備受關(guān)注，但其在人體中的作用及其調(diào)節(jié)機制尚不明確。西格列汀作為二肽基肽酶-4（dipeptide peptidase-4，DPP-4）抑制劑，具有刺激胰島β細胞再生、促進胰島素分泌、抑制內(nèi)源性葡萄糖的生成，達到降低血糖的作用，但西格列汀與肥胖患者RBP4的相關(guān)研究較少。該研究通過建立高脂飲食誘導的肥胖大鼠模型，給予西格列汀干預，測定肥胖大鼠干預前后血清RBP4水平及附睪脂肪、肝臟組織RBP4的表達水平，分析西格列汀干預對RBP4的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料40只普通級4周齡雄性SD大鼠，體重（body weight，BW）80～120 g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。普通飼料由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心配制，為國家標準齲齒類動物固體混合飼料。高脂飼料配方為普通飼料55%、豬油12%、蔗糖5%、奶粉8%、花生5%、雞蛋10%、麻油3%、食鹽2%。

1.2 實驗試劑西格列?。绹硸|公司）；胰島素放免試劑盒（北京原子高科公司）；RBP4酶免試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）；穩(wěn)豪血糖儀及試紙（美國強生公司）；RBP4一抗（英國Abcam公司）；RBP4二抗、β-actin一抗、β-actin二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 動物分組及肥胖大鼠模型建立將40只大鼠予以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組（ND組，n＝10）予普通飼料喂養(yǎng)，高脂組（HD組，n＝30）予高脂飼料喂養(yǎng)。兩組大鼠平行飼養(yǎng)，自由飲水，室溫21～24℃，相對濕度40%～60%，自然晝夜節(jié)律。每2周稱重1次，喂養(yǎng)16周后，取HD組BW大于ND組BW均數(shù)20%［3］的大鼠（n＝16）判定為肥胖造模成功的大鼠，將其隨機分為肥胖對照組（OB組，n＝8）和西格列汀干預組（SITA組，n＝8）。

1.4 干預方法SITA組給予西格列汀灌胃10 mg／（kg·d），ND組和OB組均以等劑量生理鹽水灌胃，共干預6周；干預期間ND組繼續(xù)普通飲食，OB組和SITA組繼續(xù)高脂飲食。

1.5 標本采集及檢測16周末空腹狀態(tài)下取內(nèi)眥靜脈竇血2 ml，靜置15 min后，3 200 r／min離心10 min，血清放置于－80℃冰箱保存待測。22周末次干預后禁食12 h但不禁水，稱重后水合氯醛0.3 ml／100 g腹腔注射，麻醉狀態(tài)下打開腹腔，下腔靜脈取血7 ml，靜置15 min后，3 200 r／min離心10 min，血清放置于－80℃冰箱保存待測。麻醉狀態(tài)下解剖大鼠，冰上操作取出附睪脂肪及肝臟組織，置于液氮罐中以備提取蛋白質(zhì)。血糖儀紙片法測定血糖，Roche Modular全自動生化分析儀測定血脂，放免法測定胰島素，ELISA法測定血清RBP4，采用胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR）模型公式［4］計算。HOMAIR＝空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）（mIU／L）×空腹血糖（fast blood glucose，F(xiàn)BG）（mmol／L）／22.5。

1.6 Western blot法檢測提取附睪脂肪中的總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度決定上樣量。依次進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，RBP4兔抗一抗（1∶500）4℃孵育過夜后，辣根酶標記的山羊抗兔二抗（1∶4 000）室溫下孵育2 h。充分洗滌后加入ECL化學發(fā)光劑，暗室顯影成像。檢測后的膜重新用TBST清洗3次，TBS清洗1次（10 min／次），重復上述步驟進行內(nèi)參照β-actin（一抗1∶1 000稀釋，二抗1∶4 000稀釋）的結(jié)合。采用上述相同方法，在相同條件下完成肝臟組織RBP4和對應(yīng)的βactin蛋白檢測。RBP4蛋白相對表達量以其特異性結(jié)合條帶與β-actin結(jié)合條帶的灰度值比值表示。

1.7 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料以±s表示。兩組均數(shù)比較用配對t檢驗，3組均數(shù)間比較采用ANOVA及兩兩比較的LSD法；一個應(yīng)變量與單個自變量之間的關(guān)系用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 干預前各組大鼠代謝指標比較與ND組相比，OB、SITA組大鼠BW、FBG、三酰甘油（triglyceride，TG）、膽固醇（total cholesterol，TCH）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL-C）、FINS、HOMAIR明顯升高，高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL-C）降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；在HD組中，OB組、SITA組兩組間各指標差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 干預前各組大鼠代謝指標的比較（±s）

表1 干預前各組大鼠代謝指標的比較（±s）

與ND組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

2.2 干預后各組大鼠代謝指標比較 西格列汀干預6周后，SITA組大鼠的FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOMA-IR下降，HDL-C升高，與OB組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與ND組相比，差異無統(tǒng)計學意義。西格列汀干預后，與OB組相比，SITA組大鼠BW有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 干預后各組大鼠代謝指標的比較（±s）

表2 干預后各組大鼠代謝指標的比較（±s）

與ND組比較：**P＜0.01；與OB組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

2.3 干預前后各組大鼠血清RBP4水平比較干預前，HD組大鼠血清RBP4水平升高，與ND組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；在HD組中，OB組、SITA組兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義。西格列汀干預后，SITA組血清RBP4水平下降，與干預前相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與OB組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但仍高于ND組。見表3。

2.4 脂肪及肝臟組織中RBP4的表達與ND組相比，OB組附睪脂肪RBP4蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05）；與OB組相比，SITA組附睪脂肪RBP4蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。在肝臟組織中，3組RBP4表達差異無統(tǒng)計學意義。見圖1。

表3 干預前后各組大鼠血清RBP4水平變化（±s）

表3 干預前后各組大鼠血清RBP4水平變化（±s）

與ND組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與OB組比較：＃＃P＜0.01

項目ND組（n＝10）OB組（n＝8）SITA組（n＝8）F值干預前（μmol／L）33.34±6.3541.42±4.70**39.86±5.62*5.265干預后（μmol／L）30.88±2.4042.52±6.34**35.04±2.61＃＃*18.338

2.5 血清RBP4與各指標間的相關(guān)性分析以ND組大鼠為研究對象，Pearson相關(guān)分析顯示血清RBP4與TG呈正相關(guān)性，與其他指標無相關(guān)性。以HD組大鼠為研究對象，Pearson相關(guān)分析顯示血清RBP4與FINS、HOMA-IR、TG、附睪脂肪RBP4呈正相關(guān)性，與HDL-C呈負相關(guān)性，與BW、FBG、TCH、LDL-C、肝臟RBP4均無相關(guān)性，見表4。

表4 RBP4與各指標間的相關(guān)性分析

3 討論

RBP4是新近被發(fā)現(xiàn)的作用于肌肉和肝臟，并影響胰島素敏感性的脂肪因子。RBP4主要由肝臟和脂肪組織合成，可以將視黃醇從肝臟轉(zhuǎn)運至各種靶組織［5］。當RBP4在脂肪組織表達過多時可導致葡萄糖轉(zhuǎn)運體4（glucose transport 4，GLUT4）表達下降，抑制肝臟和肌肉組織對葡萄糖的利用［6］。RBP4導致胰島素抵抗的機制為RBP4水平升高可使肝臟產(chǎn)生過多的磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶，導致糖異生增加，并且通過IRS-1和PI3K途經(jīng)導致肌肉組織胰島素信號傳導減弱［2，7－8］。

本研究顯示高脂飲食誘導的肥胖大鼠血清RBP4水平及附睪脂肪RBP4表達水平較ND組升高，肝臟組織中RBP4表達量較ND組無明顯改變，這提示RBP4雖然主要由肝臟和脂肪組織合成，但在肥胖狀態(tài)下，血清中增高的RBP4水平可能主要來源于脂肪組織。Yang et al［2］發(fā)現(xiàn)在肥胖模型鼠中，脂肪組織RBP4表達水平明顯增加，而肝臟組織RBP4表達水平不變，與本實驗結(jié)果一致。Pearson相關(guān)性分析顯示，在肥胖大鼠中，血清RBP4水平與HOMA-IR呈正相關(guān)性，與研究［7］結(jié)果一致。但Lewis et al［9］發(fā)現(xiàn)RBP4與胰島素抵抗并無相關(guān)性，這可能與實驗對象、樣本含量及試驗方法不同有關(guān)。同時本研究顯示在肥胖大鼠中，血清RBP4與TG呈正相關(guān)性，與HDL-C呈負相關(guān)性，這與RBP4對肝臟的直接作用，導致肝臟產(chǎn)生TG過多，并促進極LDL-C釋放入血有關(guān)［10］。

胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是腸促胰素家族中的一員，具有促進胰島素分泌，抑制胰高糖素釋放，抑制胃排空，保護并增加胰島β細胞數(shù)量，促進胰島β細胞存活與生長、增殖與分化、抑制其凋亡等作用［11］。西格列汀作為DPP-4抑制劑，通過選擇性抑制DPP-4活性，減少體內(nèi)GLP-1降解，增加體內(nèi)GLP-1濃度，促進胰島素分泌、降低血糖、保護胰島β細胞功能［12］。

目前關(guān)于西格列汀對肥胖大鼠RBP4蛋白表達有無影響的相關(guān)報道較少。本研究通過給予肥胖大鼠西格列汀干預6周來觀察RBP4表達水平的變化，結(jié)果表明西格列汀干預后，血清RBP4水平及附睪脂肪RBP4表達水平下降，且糖脂代謝明顯改善，與研究［4］結(jié)果類似。研究［13］顯示另一種DPP-4抑制劑維格列汀亦能降低2型糖尿病患者血清RBP4水平，與本實驗結(jié)果一致。西格列汀干預后，脂肪組織RBP4蛋白表達水平下降，而肝臟組織RBP4蛋白表達水平無明顯改變，這與胰島素增敏劑羅格列酮對GLUT4敲除鼠不同組織RBP4表達影響的研究［2］結(jié)果一致。西格列汀降低RBP4蛋白表達水平的機制目前尚不完全明確，可能為降低了FBG和胰島素，改善胰島素抵抗，RBP4適應(yīng)性下調(diào)。另有研究［14］表明GLP-1干預后糖尿病模型鼠脂肪組織GLUT4表達水平增加，而RBP4水平與GLUT4水平呈負相關(guān)性［15］。隨著GLUT4表達水平增加，RBP4表達水平下降，因此推測，西格列汀干預后RBP4表達水平下調(diào)與體內(nèi)GLP-1濃度增加及GLUT4表達水平增加有關(guān)聯(lián)。

綜上所述，肥胖大鼠血清及附睪脂肪中RBP4水平升高，西格列汀干預后能顯著降低肥胖大鼠血清及脂肪組織RBP4水平，并可改善糖脂代謝。RBP4作為新的脂肪因子，在肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色。降低RBP4水平可能會成為肥胖癥、2型糖尿病的治療新靶點之一。

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Effects of treatment with sitagliptin on serum and different tissue retinol binding protein 4 expression levels in high-fat-fed obesity rats

Qi Renjuan，Hu Honglin，Xia Li，et al
（Dept of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo evaluate the effects of treatment with sitagliptin on metabolic parameters，serum retinol binding protein 4（RBP4）levels，epididymal adipose tissue and liver RBP4 expression levels in high-fat-fed obese rats.Methods40 SD rats were randomly divided into normal diet group（ND group，n＝10）and high fat dietgroup（HD group，n＝30）.16 weeks later，obese models（n＝16）were established from HD group and were randomly divided into obesity group（OB group，n＝8）and sitagliptin group（SITA group，n＝8）.Measure body weight（BW），fasting blood glucose（FBG），triglyceride（TG），total cholesterol（TCH），high-density lipoprotein（HDL-C），low-density lipoprotein（LDL-C），fasting insulin（FINS），serum RBP4 respectively before and after the 6 weeks of treatment，and calculate homeostasis model assessment-insulin resistance index（HOMA-IR）.Western blot was used to detect the epididymal adipose tissue and liver RBP4 protein expression levels.Results①The levels of BW，F(xiàn)BG，TG，TCH，LDL-C，F(xiàn)INS，HOMA-IR and serum RBP4 in HD group increased while the levels of HDL-C decreased compared with those of ND group with a statistical significance（P＜0.05，P＜0.01）.The differences between OB group and SITA group were of no statistical significance.After treatment with sitagliptin，the levels of FBG，TG，TCH，LDL-C，F(xiàn)INS，HOMA-IR and serum RBP4 of SITA group decreased while the levels of HDL-C increased compared with those of OB group with a statistical significance（P＜0.05，P＜0.01）.②Epididymal adipose tissue RBP4 protein expression levels in OB group increased compared with ND group（P＜0.05），epididymal adipose tissue RBP4 protein expression levels in SITA group decreased compared with OB group（P＜0.01）.③Pearson correlation analysis showed that in ND group，serum RBP4 was positively correlated with TG.In HD group，serum RBP4 and FINS，HOMA-IR，TG，epididymal adipose tissue RBP4 were positively correlated and negative correlation existed between serum RBP4 and HDL-C.ConclusionSerum and epididymal adipose tissue RBP4 protein levels are elevated in obesity rats.Sitagliptin intervention can lower serum and epididymal adipose tissue RBP4 protein levels in obesity rats and improve the glucose and lipid metabolism.

obesity；insulin resistance；sitagliptin；retinol binding protein 4

R 589.25

1000－1492（2015）02－0185－05

2014－09－20接收

安徽省高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2013Z126）；安徽中醫(yī)學院中醫(yī)藥管理局重點學科－中醫(yī)內(nèi)分泌學科開放基金（編號：2011nfmxk004）；國家自然科學基金青年科學基金培養(yǎng)計劃（編號：2011KJ11）

1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 2300222安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230031

戚仁娟，女，碩士研究生；王長江，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：chjw82＠126.com；夏 莉，女，主治醫(yī)師，責任作者，E-mail：xiaLi0205＠163.com