廣州地區(qū)6 000例羊水細(xì)胞染色體核型分析及其產(chǎn)前診斷價值探討

劉海波，丘文君，鄭育紅，賴煒強(qiáng)，孫筱放

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科研究所實驗室/廣東省產(chǎn)科重大疾病實驗室，廣州 510150)

·論 著·

廣州地區(qū)6 000例羊水細(xì)胞染色體核型分析及其產(chǎn)前診斷價值探討

劉海波，丘文君，鄭育紅，賴煒強(qiáng)，孫筱放△

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科研究所實驗室/廣東省產(chǎn)科重大疾病實驗室，廣州 510150)

目的 分析羊水細(xì)胞染色體，比較不同異常核型的發(fā)生率及其在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值。方法選擇2010年1月至2013年9月到該院就診有產(chǎn)前診斷指征的孕婦6 000例，行羊膜腔穿刺術(shù)、傳代法羊水細(xì)胞培養(yǎng)及胎兒染色體核型分析。結(jié)果6 000例羊水培養(yǎng)成功5 994例(99.90%)，異常核型193例(3.22%)。其中,染色體數(shù)目異常108例，占異常核型的55.96%，以21三體為主，占數(shù)目異常的67.59%(73/108)；結(jié)構(gòu)異常60例，占異常核型的31.09%，其中平衡性結(jié)構(gòu)重排38例(19.69%)，非平衡性結(jié)構(gòu)重排22例(11.40%)；嵌合體25例(12.95%)。將孕婦按進(jìn)行穿刺的首要指征分為6組,血清學(xué)篩查高風(fēng)險組和高齡組分別占受檢人數(shù)41.62%和33.70%，B超檢查示胎兒異常組和夫婦一方染色體異常組的核型異常檢出率分別為5.56%和20.00%,與其他組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論傳代法羊水細(xì)胞體外培養(yǎng)對核型分析具有實用性。羊水染色體核型分析是安全、有效的診斷胎兒染色體病的方法。

產(chǎn)前診斷;羊水；細(xì)胞培養(yǎng)；核型分析

染色體病是一種常見的遺傳病，新生兒的染色體異常率為0.5%～0.7%[1-2]。產(chǎn)前診斷是早期發(fā)現(xiàn)遺傳異常胎兒的有效措施之一，其中羊水細(xì)胞核型分析是目前國內(nèi)應(yīng)用最廣泛、結(jié)果最直觀可靠的方法之一，可以有效減少染色體病胎兒的出生。本文總結(jié)了因有產(chǎn)前診斷指征而在本院進(jìn)行羊膜腔穿刺的廣州地區(qū)6 000例孕婦的羊水細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果，以探討傳代法在羊水細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用及胎兒染色體異常核型出現(xiàn)的頻率和類型與產(chǎn)前診斷指征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月至2013年9月在本院產(chǎn)前診斷及遺傳咨詢門診就診，并經(jīng)羊膜腔穿刺行產(chǎn)前診斷的孕婦6 000例，年齡19～47歲，孕周16～33周；在告知孕婦及家屬進(jìn)行羊水細(xì)胞染色體分析的產(chǎn)前診斷范圍及風(fēng)險，孕婦及家屬簽署知情同意書后，在B超定位下經(jīng)腹羊膜腔穿刺；取羊水20 mL。

1.2 儀器與試劑 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司；染色體分析儀購自德國蔡司公司，Ikaros核型分析軟件購自德國Metasystems公司；羊水培養(yǎng)基購自美國Gibco公司及美國Irvine Scientific公司；秋水仙素及姬姆薩染液購自廣州達(dá)暉生物技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 羊水細(xì)胞培養(yǎng) 抽取羊水20 mL注入2個15 mL 無菌離心管中，離心棄上清液，留0.5 mL制成細(xì)胞懸液，接種于3 mL羊水培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，第7天換液，第9天取出培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下觀察，見到較多的圓而亮的克隆細(xì)胞時進(jìn)行傳代，第10～13天當(dāng)傳代細(xì)胞長至70%～80%滿度時收獲。

1.3.2 染色體制片與G顯帶 加入秋水仙素至終濃度為0.25 μg/mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h后取出細(xì)胞。0.05%胰酶消化，收集細(xì)胞。加入0.4%枸櫞酸鈉與0.4% Kcl按1∶1配制的低滲液1 mL，于37 ℃水浴中低滲5 min之后，進(jìn)行預(yù)固定、固定、滴片。在65 ℃的烤箱中老化過夜。常規(guī)進(jìn)行胰酶消化，姬姆薩染色。

1.3.3 核型分析 顯帶后油鏡下至少計數(shù)30個分散良好的中期分裂相，同時分析至少5個染色體帶紋清晰的細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)嵌合體，至少計數(shù)100個分裂相，并收獲第2瓶細(xì)胞再次進(jìn)行染色體分析。對于出現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)異常的病例，有必要時進(jìn)行家系調(diào)查及父母染色體核型分析。診斷標(biāo)準(zhǔn)按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名(ISCN2009)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3.4 分組 將6 000例胎兒根據(jù)其母親(孕婦)不同檢查指征進(jìn)行分組：當(dāng)孕婦年齡大于或等于35歲時，無論是否出現(xiàn)其他指征，均列為高齡孕婦組(2 022例)；當(dāng)孕婦年齡小于35歲，血清學(xué)篩查提示高危時，無論是否出現(xiàn)其他指征，均列為唐氏篩查高風(fēng)險組(2 497例)；當(dāng)孕婦年齡小于35歲，血清學(xué)篩查提示低危，而超聲篩查出現(xiàn)異常征象時，無論是否合并其他指征，均列為B超提示異常組(486例)；已知夫婦中有一方為染色體異常并以該指征就診者，列為夫婦染色體異常組(55例)；曾經(jīng)生育過或流產(chǎn)過有出生缺陷或者染色體異常胎兒的，列入不良孕產(chǎn)史組(491例)；進(jìn)行X連鎖單基因遺傳病診斷、輔助生殖技術(shù)懷孕后染色體檢查、孕期有害物接觸史、低智家族史、錯過血清學(xué)及超聲篩查機(jī)會且孕婦要求做胎兒染色體檢查者，其胎兒均列為其他因素組(449例)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SAS9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Bootstrap法進(jìn)行多組率的重復(fù)比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率 羊水培養(yǎng)病例最小孕周16周，最大孕周33周，胎糞樣羊水29例，血性羊水103例。6 000例羊水有6例培養(yǎng)失敗，成功率為99.90%。培養(yǎng)失敗的6例患者2周后再次進(jìn)行穿刺抽取羊水培養(yǎng)，核型分析結(jié)果均為正常。

2.2 各組胎兒異常核型種類、構(gòu)成及檢出率 由表1可見，6 000例受檢孕婦中，共檢出異常核型193例，檢出率為3.22%。高齡組和唐氏篩查高風(fēng)險組的受檢人數(shù)分別占33.70%和41.62%。B超提示異常組和夫婦染色體異常組的異常核型檢出率分別為5.56%和20.00%，明顯高于其他各組(P<0.05)。高齡組檢出異常核型68例，血清學(xué)篩查高風(fēng)險組檢出異常核型72例，分別占總異常核型的35.23%和37.31%,占總異常核型的72.54%。

2.3 異常核型種類及發(fā)生率 由表2可見，在檢出的193例異常核型中，染色體數(shù)目異常108例，占異常核型的55.96%，非整倍體占絕對優(yōu)勢，共104例，占異常核型的53.89%。其中21三體73例(37.82%)，18三體14例(7.25%)，13三體3例(1.55%)，性染色體三體10例(5.18%)，性染色體單體4例(2.07%)。三倍體3例(1.55%)，標(biāo)記染色體1例(0.52%)。結(jié)構(gòu)異常的病例共60例，占異常核型的31.09%。其中平衡性結(jié)構(gòu)重排38例(19.69%)，包括常染色體平衡易位20例，常染色體倒位7例，羅伯遜平衡易位2例和Y染色體臂間倒位9例。非平衡性結(jié)構(gòu)重排22例(11.40%)，其中包括常染色體增加、缺失或重復(fù)等非平衡性結(jié)構(gòu)重排13例，羅伯遜易位型三體5例，X染色體非平衡性結(jié)構(gòu)重排4例。嵌合體25例，占異常核型的12.95%，其中包括染色體數(shù)目異常的嵌合9例，結(jié)構(gòu)異常的嵌合15例，46,XX/46,XY嵌合體1例。

表1 6 000例產(chǎn)前診斷指征的分布構(gòu)成比及檢出率(%)

*:P<0.05,與其他各組比較。

表2 193例異常核型種類和比例及其在6 000例胎兒中的發(fā)生率

2.4 按孕婦分娩年齡分組比較 按照孕婦分娩年齡分為：<35歲組，35～40歲組、>40歲組，比較3組異常核型比例，結(jié)果見表3。孕婦隨年齡增加，發(fā)生染色體異常的比例增加。>40 歲組，其胎兒出現(xiàn)異常核型的比例高于其他兩組，尤其是三體的發(fā)生率明顯增加。但采用Bootstrap法進(jìn)行多組率的重復(fù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。將35～40、>40歲兩組合并為大于或等于35歲組，與小于35歲組比較，差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 不同年齡組異常核型檢出情況比較(n)

3 討 論

本研究中胎兒羊水染色體異常檢出率為3.22%，與湯麗霞等[3]報道佛山地區(qū)的異常檢出率3.4%，李丹等[4]報道北京地區(qū)的異常檢出率2.84%，陳雪等[5]報道蘭州地區(qū)的異常檢出率3.89%，孫立寧等[6]報道山東濰坊地區(qū)的異常核型檢出率3.32%，張月萍等[7]報道上海地區(qū)的異常檢出率2.81%，以及文獻(xiàn)[8]報道相似，高出新生兒染色體異常率5～6倍。說明以上各地區(qū)之間符合產(chǎn)前診斷指征的孕中期羊水的染色體異常率相近。與本院2年前報道的2.75%的檢出率相比較有所提高。說明有針對性的產(chǎn)前診斷可有效地診斷染色體病，減少出生缺陷的發(fā)生，嚴(yán)格把控羊膜腔穿刺的指征,可提高染色體異常的檢出率,進(jìn)一步提高產(chǎn)前診斷的效率。

本研究中的6種高危因素均與染色體病密切相關(guān)。其中血清學(xué)篩查高風(fēng)險的孕婦在受檢人群中所占比例最大，檢出染色體異常的人數(shù)也最多，因此孕早期血清學(xué)篩查是產(chǎn)前診斷必不可少的方法。隨著中國生育年齡的不斷推遲，高齡孕婦越發(fā)增多。在本研究中35周歲及以上的高齡孕婦與其他具有產(chǎn)前診斷指征的孕婦相比，染色體核型異常的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而且，有隨年齡增長而異常率上升的趨勢。因此，對于超過35周歲的孕婦，可以不必經(jīng)孕早期血清學(xué)篩查，直接于孕中期行羊水穿刺檢查。B超是檢測胎兒遺傳病的重要手段，在本研究中B超檢測出的胎兒異常包括了頸項透明層增厚、羊水過多、羊水過少、腦積水、腎積水、心包積液、單臍動脈等及各種胎兒畸形，B超異常組的異常核型檢出率為5.56%，與文獻(xiàn)[4,9]報道的相似，明顯高于血清學(xué)篩查高風(fēng)險組與高齡組。因此，B超檢查異常是羊水穿刺檢查的一個重要指征。夫婦染色體異常是異常核型檢出率最高的一組，雖然大多數(shù)檢出的異常為來源于父母的平衡性結(jié)構(gòu)異常，可以正常發(fā)育并分娩，但羊水穿刺檢查仍是檢出少數(shù)異常胎兒所必需的。不良孕產(chǎn)史組中，異常核型檢出率為2.04%，也較新生兒染色體異常率明顯增高，說明不良孕產(chǎn)史也是羊水穿刺檢查的指征。

非整倍體，尤其是21三體，在異常核型中占絕對優(yōu)勢。通過無創(chuàng)等快速基因檢查方法，可以檢出一半以上的染色體異常，但是結(jié)構(gòu)異常依舊需要羊水穿刺后的核型分析才能檢出[10]。對于染色體結(jié)構(gòu)異常的胎兒，需要雙親行外周血染色體檢查，以確定結(jié)構(gòu)異常染色體的來源。若異常核型來源于雙親之一且雙親表型正常，說明此突變并無遺傳物質(zhì)的增減，應(yīng)建議妊娠婦女行超聲檢查，密切觀察胎兒生長發(fā)育情況，如無異常可繼續(xù)妊娠；若雙親染色體正常，則染色體結(jié)構(gòu)異常為胎兒新發(fā)突變，應(yīng)建議行基因芯片檢查，以確定結(jié)構(gòu)異常有無造成基因的重復(fù)或者缺失。

本研究中嵌合體25例，發(fā)生率4.17‰，略高于張月萍等[7]報道的3.48‰ ，主要來自于血清學(xué)篩查高風(fēng)險組、高齡組及B超檢查異常組。嵌合體是羊水培養(yǎng)中經(jīng)常出現(xiàn)的現(xiàn)象，雖然原位培養(yǎng)可以排除部分假性嵌合的現(xiàn)象，但由于羊水細(xì)胞本身為胎兒脫落細(xì)胞,包含淘汰的異常細(xì)胞,且經(jīng)過體外培養(yǎng),突變概率增加[8,11-12]。故當(dāng)羊水出現(xiàn)嵌合體時，作者建議采集孕婦臍帶血復(fù)查，再次進(jìn)行核型分析后再下結(jié)論。

高質(zhì)量的羊水細(xì)胞培養(yǎng)及收獲技術(shù)對于染色體核型分析極為重要。羊水的最佳采集時間為孕20～22周，此時羊水中活性細(xì)胞較多、細(xì)胞易貼壁、生長旺盛。孕周過小,活細(xì)胞尚少，不易貼壁形成克隆；孕周過大，羊水中胎脂和上皮細(xì)胞增多，形成克隆也較少。但本研究發(fā)現(xiàn)，通過個體化的換液與傳代操作，晚至33周的羊水也可以培養(yǎng)并收集到足夠多分裂相細(xì)胞，但培養(yǎng)時間明顯延長。本研究中6 000例羊水標(biāo)本培養(yǎng)成功率為99.90%,培養(yǎng)失敗的6例病例，主要是由于羊水污染所造成。因此，在操作的各個步驟嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作,做好各個環(huán)境指標(biāo)的質(zhì)控尤為重要。

新近基因芯片檢測也成為了產(chǎn)前診斷的一線檢驗方法，與染色體核型分析相比，其檢驗標(biāo)本更為廣泛，能夠發(fā)現(xiàn)更微小的基因片段增加和缺失，但其應(yīng)用也有一定的限制[13-14]：(1)不能夠檢測除相對拷貝數(shù)變異之外的事件，如平衡性結(jié)構(gòu)重排。(2)由于敏感度所限，無法檢測低水平的嵌合體、不平衡易位和非等倍體。(3)無法檢測四倍體或其他的雙倍體性異常。(4)無法檢測芯片上所未覆蓋區(qū)域的基因拷貝數(shù)變異。(5)無法像核型分析一樣闡明基因不平衡性變異產(chǎn)生的機(jī)制或來源。因此，進(jìn)行基因芯片檢測的同時，仍需進(jìn)行染色體核型分析以相互補(bǔ)充。相信隨著科技的進(jìn)步，多種技術(shù)相結(jié)合，將使產(chǎn)前診斷越來越精確與完善。

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Investigation on 6 000 cases of chromosomal karyotypes of amniotic fluid cells and their prenatal dianostic values in Guangzhou area*

LiuHaibo,QiuWenjun,ZhengYuhong,LaiWeiqiang,SunXiaofang△

(KeyLaboratoryforMajorObstetricDiseasesofGuangdongProvince/ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510150,China)

Objective To analyze the chromosoms of amniotic fluid cells,to compare the occurrence rate of different karyotypes an dto investigate their application values in prenatal diagnosis.Methods A total of 6 000 pregnant women with the prenatal diagnostic indications came to our hospital from January 2010 to September 2013 were performed the amniocentesis,amniotic fluid cell passage culture and fetal chromosomal karyotypes analysis.Results Among 6 000 cases of amniotic fluid cell culture,5 594 cases(99.90%) were succeeded and 193 cases(3.22%) were abnormal karyotypes,in which 108 cases were the chromosomal numberical abnormality,acounting for 55.96% of abnormal karyotypes,Down′s syndrome was predominant and accounted for 67.59% of chromosomal numberical abnormality.There were 60 cases(31.09%) of chromosomal structural abnormality including 38 cases(19.69%) of balanced structural rearrangements and 22 cases(11.40%) of non-balanced structural rearrangements.There were 25 cases(12.95%) of chimera.The pregnant women were divided into 6 groups according to the amniocentesis chief indication,the high risk group and high age group of serological screening accounted for 41.62% and 33.70% of the detected person number.The detection rates of karyotype abnormality in the fetal B ultrasonographic abnormality group and the couple one party chromosomal abnornality group were 5.56% and 20.00%,respectively,which were significantly different from other groups (P<0.05).Conclusion The amniocyte subculture in vitro is practicable for the karyotype analysis.The karyotype analysis of amniotic fluid chromosomes is a safe and effective method for diagnosing the fetal chromosomal diseases.

prenatal diagnosis;amniotic fluid;cell culture;karyotype analysis

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.001

國家自然科學(xué)基金資助項目(81302079)；廣州醫(yī)科大學(xué)青年基金資助項目(2012C10)；廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院青年基金資助項目(2012Y15)。

劉海波(1973-)，博士，講師，主要從事遺傳學(xué)方面的研究。

△通訊作者，E-mail：xiaofangsun@hotmail.com。

R446

A

1671-8348(2015)15-2017-03

2014-10-08

2015-02-13)