抗纖抑癌方調(diào)控HGF/c-Met mRNA干預肝癌前病變的實驗研究

楊先照 江 鋒 葉永安

(北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京，100700)

抗纖抑癌方調(diào)控HGF/c-Met mRNA干預肝癌前病變的實驗研究

楊先照 江 鋒 葉永安

(北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京，100700)

目的：觀察抗纖抑癌方對肝癌前病變大鼠HGF/c-Met mRNA的影響，探討抗纖抑癌方防治肝癌前病變的作用機制。方法：75只SD雄性大鼠隨機分為正常組、模型組、抗纖抑癌組、鱉甲軟肝組和秋水仙堿組。以二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌前病變模型，用抗纖抑癌方進行干預，并以復方鱉甲軟肝片、秋水仙堿片作為對照，采用免疫組化檢測肝組織α-SMA的表達情況，實時熒光定量PCR檢測各組大鼠肝臟的HGF和c-Met mRNA的表達量。結果：免疫組化顯示，與模型組及秋水仙堿組比較，抗纖抑癌組能明顯減少α-SMA表達量，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)。實時熒光定量PCR結果顯示，HGF mRNA的相對表達量抗纖抑癌組與模型組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與秋水仙堿組比較亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，抗纖抑癌方能顯著提高肝癌前病變大鼠HGF mRNA的表達水平。c-Met mRNA在DEN造模的各組中均低表達，各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論：抗纖抑癌方能夠提高肝癌前病變大鼠HGF mRNA的表達水平，這可能是其防治肝癌前病變的作用機制之一。

抗纖抑癌方；肝癌前病變；肝細胞生長因子；c-Met

肝細胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，約占原發(fā)性肝癌的90%，在腫瘤相關死因中位列第三[1]。在我國每年死于肝癌的患者約11萬，其病死率已上升為農(nóng)村和城市惡性腫瘤病死率的第一位和第二位[2]。肝癌的有效治療是臨床上所面臨的艱巨而又緊迫的難題。由于肝癌患者臨床癥狀出現(xiàn)晚、進展迅速、手術切除率低、復發(fā)率高、生存期短等問題，雖然近年來診療手段日益豐富，但其發(fā)病率和死亡率并無明顯下降趨勢，預后仍然十分兇險。肝癌相關的基礎研究近年來有著較大的投入，但亦未取得重大突破。這些都迫切要求肝癌的臨床治療及相關基礎研究需戰(zhàn)略前移，加強預防肝癌發(fā)生的能力，這使得肝癌前病變的研究具有非常重要的現(xiàn)實意義。而在預防肝癌的發(fā)生方面，目前尚未有一個公認的療效確切的藥物，無論西醫(yī)還是中醫(yī)都處在同一條起跑線上，具有完全相同的機會和優(yōu)勢[3]。中醫(yī)藥防治肝癌有著悠久的歷史，具有多層次、多靶點及協(xié)同作用的特點[4]，但因其具體作用機制未明，目前仍難以被大多數(shù)學者所接受，已成為中醫(yī)藥國際化發(fā)展的瓶頸。因而應用現(xiàn)代生物醫(yī)學技術揭示、闡明中醫(yī)藥干預肝癌前病變的作用機制研究十分必要。

本研究的抗纖抑癌方是我院葉永安教授在臨床上治療肝癌前病變的經(jīng)驗方，從以往的臨床及基礎研究中已證實其具有抗纖維化、延緩肝癌前病變進展及抑制肝癌細胞增殖等作用[5-6]。本實驗用抗纖抑癌方對二乙基亞硝胺(Diethylnitrosamine，DEN)誘發(fā)的肝癌前病變大鼠進行干預，觀察抗纖抑癌方對大鼠肝癌前病變的肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)及其受體(c-Met)mRNA的影響，探討抗纖抑癌方防治肝癌前病變的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠75只，每只體重110～120 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK(京)2006-0009。給予北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)的清潔級大、小鼠維持飼料喂養(yǎng)，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2009-0012，生產(chǎn)批號：10101621。實驗動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學屏障環(huán)境動物實驗室。

1.1.2 藥品與試劑 抗纖抑癌方主要由柴胡、黃芪、山藥等藥物組成，由深圳市三九現(xiàn)代中藥有限公司提供相應藥物的免煎顆粒。復方鱉甲軟肝片，內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn)，批準文號：國藥準字Z19991011。秋水仙堿片，昆明制藥集團股份有限公司生產(chǎn)，批準文號：國藥準字H53021389。DEN購自sigma公司，貨號：N0756，Lot#049k1613v；α-SMA免疫組化檢測試劑盒及Mayor蘇木素均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；M-MuLV反轉錄酶和RNase Inhibitor購自Fermentas(MBI)公司；2×PCR TaqMix購自北京美萊博醫(yī)學科技有限公司；瓊脂糖購自西班牙Biowest公司；DEPC購自美國Amresco公司。

1.1.3 主要儀器 LEICA-RM 2135組織切片機：德國萊卡公司；Olympus L340099光學顯微鏡：日本奧林巴斯公司；LEICA Q500IW圖像分析儀：德國萊卡公司；Takara TP600型梯度PCR儀：日本Takara公司；H1650-W臺式微量高速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；電泳槽、電泳儀及凝膠紫外分析儀：北京君意東方電泳設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥方法 將75只SD大鼠隨機分為5組，分別為正常組12只，模型組18只，抗纖抑癌組15只，鱉甲軟肝組15只，秋水仙堿組15只。所有大鼠在同一個條件下飼養(yǎng)，實驗期間各組大鼠自由攝水、攝食。適應性喂養(yǎng)1周后，按我們前期研究方法予造模給藥[6]：除正常組以外的各組均以DEN(70 mg/kg)按1 mL/100 g的劑量灌胃，正常組大鼠按1 mL/100 g的劑量給予生理鹽水灌胃，每周1次，連續(xù)14周。造模開始后，正常組及模型組大鼠給予生理鹽水灌胃，其余各組大鼠分別給予相應藥物灌胃，給藥劑量相當于臨床用量的7倍劑量，按1 mL/100 g的體積灌胃，1次/d，連續(xù)給藥14周。

1.2.2 取材 最后一次給藥后禁食12h，10%水合氯醛麻醉，迅速摘取大鼠右前葉部分肝組織。一部分肝組織置于4%多聚甲醛溶液中準備石蠟切片行蘇木素-伊紅染色和免疫組化，另一部分肝組織快速置于液氮中備實時熒光定量PCR檢測用。

1.2.3 免疫組化 按照SABC試劑盒使用說明書檢測大鼠肝臟α-SMA的表達水平，利用LEICA Q500IW圖像分析儀進行圖像采集和處理。隨機選取5個視野(400倍)，測陽性著色面積百分比=陽性著色面積/肝組織面積×100%。所有結果均用均值加減標準差表示。

1.2.4 實時熒光定量PCR Trizal法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的完整性。RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板行實時熒光定量PCR反應，檢測HGF和c-Met的mRNA與β-actin(管家基因)的擴增效率的一致性，優(yōu)化反應條件。將優(yōu)化后的PCR反應體系置于SLAN熒光定量PCR儀中行PCR擴增：95 ℃ 5 min預變性，95 ℃ 15 s→58 ℃ 20 s→72 ℃ 20 s(熒光檢測)，共30個循環(huán)，終反應于72 ℃延伸5 min。HGF引物：上游：5'-TTGGTGGACGATGACACGTG-3'；下游：5'-GTGTCTCCCAAGATGTCCATG-3'，產(chǎn)物長度為251 bp。c-Met引物：上游：5'-GCTCGGCTCTATCGTTTTCG-3'；下游：5'-AAAACCTAGCACACTCGCAG-3'，產(chǎn)物長度為289 bp。β-actin引物：上游：5'-GAAGTGTGACGTTGACATCCG-3'；下游：5'-GCCTAGAAGCATTTGCGGTG-3'，產(chǎn)物長度為282bp，以上引物均由北京擎科生物工程有限公司合成。采用比較循環(huán)閾值法(2-△△Ct)分析樣本中HGF和c-Met的mRNA相對含量。

2 結果

2.1 一般情況 實驗過程中正常組大鼠一般狀況良好，模型組大鼠予DEN灌胃第3周以后開始出現(xiàn)毛色枯皺，不愛活動，易激惹，進食和飲水減少，尿黃，體重增加緩慢；各治療組大鼠也有類似表現(xiàn)，但程度較模型組輕。第12周起造模各組開始出現(xiàn)死亡，至實驗結束，模型組死亡6只，抗纖抑癌組死亡2只(其中1只是因第2周時給藥不慎致死)，鱉甲軟肝組死亡4只，秋水仙堿組死亡4只。

2.2 肝組織病理 HE染色顯示正常組大鼠肝細胞束排列整齊，呈單行放射狀排列在中央靜脈周圍，未見變性、壞死及纖維增生改變，肝竇無狹窄。模型組大鼠肝索排列紊亂，在門脈區(qū)有大量的結締組織增生，膠原纖維增生明顯，廣泛假小葉形成，可見大量肝細胞異型增生灶及異型增生結節(jié)，肝細胞大小不等，核仁明顯，細胞核具有多形性，核漿比增高。與模型組相比，抗纖抑癌組在肝細胞變性壞死、結締組織增生程度及肝細胞異型增生灶和異型增生結節(jié)數(shù)目上均明顯減輕輕；而鱉甲軟肝組、秋水仙堿組大鼠的情況介于兩者之間。

表1 α-SMA陽性灶面積比(%)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與抗纖抑癌組比較，△P<0.05。

2.3 免疫組化結果 在正常組大鼠的肝組織中，α-SMA以陰性表達為主，在中央靜脈、匯管區(qū)血管平滑肌及膽管壁肌上皮細胞中可見極少量陽性表達。除了正常組以外的各組均可見α-SMA陽性表達，主要表達在肝細胞胞漿、假小葉纖維帶、匯管區(qū)較大的纖維瘢痕、血管壁、內(nèi)皮細胞、膽管上皮等部位。由表1可看出，與模型組比較，抗纖抑癌組的α-SMA表達量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，鱉甲軟肝組亦明顯下降(P<0.05)，秋水仙堿組亦較模型組有降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；抗纖抑癌組較鱉甲軟肝組、秋水仙堿組表達量低，與秋水仙堿組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但與鱉甲軟肝組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 實時熒光定量PCR檢測結果 由表2可看出，HGF mRNA的相對表達量在模型組、鱉甲軟肝組及秋水仙堿組中較低，在正常對照組和抗纖抑癌組中相對較高。與模型組比較，抗纖抑癌方組HGF mRNA的相對表達量明顯偏高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；抗纖抑癌方組與秋水仙堿組比較亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與鱉甲軟肝組比較沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組、鱉甲軟肝組和秋水仙堿組之間的差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？估w抑癌方能夠顯著地提高大鼠肝癌前病變的HGF mRNA的表達。c-Met mRNA的相對表達量在正常組與其他各組之間有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；DEN造模的各組間沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。c-Met mRNA在DEN造模的各組中均為低表達。

表2 HGF和c-Met mRNA的相對表達量

注：與模型組比較，*P<0.05；與秋水仙堿組比較，△P<0.05。

3 討論

HGF是一種具有多種生物學功能的細胞因子，主要由間質細胞產(chǎn)生，其生物學活性是由其受體c-Met蛋白所介導。HGF激活c-Met受體后，通過與細胞內(nèi)的一些靶蛋白直接作用，可引起包括Ras/MAPK和PI32K/PKB等信號通路的級聯(lián)激活，從而起到調(diào)節(jié)多種細胞的增殖、分化、形態(tài)發(fā)生和侵襲運動等作用[7]。HGF在慢性肝病的不同階段所起到的作用不同，一般認為在慢性肝病的早中期HGF具有抗纖維化、治療肝硬化的作用。有研究表明HGF通過阻滯TGF-β和PDGF介導的信號通路起到抗纖維化的作用[8]；Matsuda等[9]的研究發(fā)現(xiàn)多次注射HGF干預二甲基亞硝胺誘導的肝硬化大鼠，能降低肝臟的ECM水平、增加肝細胞的再生，能改善肝硬化情況。Kim[10]和Ueki[11]的相關研究也證實了HGF對肝硬化的治療效果。

抗纖抑癌方是我院葉永安教授臨床上用于防治肝癌前病變的經(jīng)驗方，具有疏肝健脾、活血化痰功效，臨床應用療效顯著。本實驗研究結果表明，從大鼠一般情況來看，抗纖抑癌方能夠改善肝癌前病變大鼠的一般情況，提高肝癌前病變大鼠的體重，降低肝癌前病變大鼠的病死率。從大鼠組織病理來看，抗纖抑癌方能夠減輕肝癌前病變大鼠肝臟的纖維化程度、減少異型增生結節(jié)的數(shù)目和體積及減輕肝細胞的異形程度；從肝癌前病變的免疫組化指標來看，本實驗通過給予抗纖抑癌方灌胃給藥，非常顯著地降低大鼠肝臟α-SMA的表達量，表明抗纖抑癌方能夠抑制DEN誘導的肝癌前病變大鼠HSC的活化。RQ-PCR的結果表明，抗纖抑癌方能夠提高肝癌前病變大鼠HGF mRNA的表達量。

由上我們可以得出，抗纖抑癌方能夠抗纖維化、延緩肝癌前病變的發(fā)生，其作用機制可能是通過調(diào)控HGF/c-Met系統(tǒng)，抑制肝星狀細胞活化，起到抗纖維化作用來改善肝臟的微環(huán)境，進而延緩肝癌前病變的進展，具體作用環(huán)節(jié)仍需進一步研究。

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(2015-08-20收稿 責任編輯：洪志強)

The Regulation Effect of Kangxian Yi-ai Formula on HGF and c-Met mRNA in Rats with Liver Precancerous Lesions

Yang Xianzhao, Jiang Feng, Ye Yong'an

(DongzhimenHospitalAffiliatedtoBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China)

Objective: To observe the effect of Kangxian Yi-ai formula on HGF and c-Met mRNA in rats with liver precancerous lesions, and thus to investigate its prevention and treatment mechanism. Methods: Seventy-five SD rats were randomly divided into normal group, model group, Kangxian Yi-ai(KXYA) group, Biejiaruangan(BJRG) group and colchicine group. Established the animal models of diethylnitrosamine(DEN)-induced liver precancerous lesions and used KXYA formula to intervene. BJRG tablets and colchicine tablets were taken as control drug. To detect the expression levels of α-SMA in liver by using immunohistochemistry and to detect the expression levels of HGF and c-Met mRNA by using real-time quantitative PCR. Results: The results of immunohistochemistry showed that compared with the model group and the colchicine group, KXYA group could significantly reduce the expression of α-SMA, which is of statistical significance (P<0.01,P<0.05). The results of real-time quantitative PCR showed that compared to the relative expression of HGF mRNA, KXYA group were significantly different with model group and colchicine group(P<0.05). Kangxian Yi-ai formula can significantly increase the expression level of HGF mRNA in rat liver precancerous lesions. The expression of c-Met mRNA were low in each group of DEN-induce liver precancerous lesions, and there is no statistical significance(P>0.05). Conclusion: Kangxian Yi-ai formula can increase the expression of HGF mRNA levels of hepatic lesions in rats, which may be the one of its prevention and treatment mechanism.

Kangxian Yi-ai formula; Liver precancerous lesions; Hepatic growth factor; c-Met

北京中醫(yī)藥大學青年教師自主課題(編號：2009JYBZZ-JS078)

葉永安，教授，博士研究生導師，主要研究方向：中醫(yī)藥防治慢性肝病的臨床與基礎研究，E-mail：yeyongan@vip.163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.09.006