SPE-HPLC法測(cè)定酒、糖果、巧克力中的喹啉黃*

孫小杰，張玲，宋佳，凌睿

(1.南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，南京 210008； 2.南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，南京 210028)

SPE-HPLC法測(cè)定酒、糖果、巧克力中的喹啉黃*

孫小杰1，張玲1，宋佳2，凌睿1

(1.南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，南京 210008； 2.南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，南京 210028)

建立了固相萃取-高效液相色譜(SPE-HPLC)測(cè)定酒、糖果、巧克力中喹啉黃的方法。樣品分別經(jīng)水、70%甲醇水溶液提取，提取液經(jīng)聚酰胺固相萃取柱凈化，采用C18色譜柱，以0.02 mol／L乙酸銨溶液和甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，用高效液相色譜儀對(duì)酒、糖果、巧克力中喹啉黃的含量進(jìn)行了測(cè)定。喹啉黃的質(zhì)量濃度在5.0～100.0 mg／L范圍內(nèi)與其色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)大于0.999 9，方法的檢出限酒為2.5 mg／L、糖果和巧克力2.5 mg／kg。樣品的平均加標(biāo)回收率為83.2%～92.2%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4.4%(n=6)。該方法快速，定量準(zhǔn)確，可用于酒、糖果、巧克力中喹啉黃的測(cè)定。

高效液相色譜；喹啉黃；固相萃取

食品添加劑喹啉黃為水溶性偶氮類合成色素，食品安全標(biāo)準(zhǔn)中僅允許在配制酒中添加，且最大使用量為0.1 g／L［1］。食品中食品添加劑違規(guī)或過(guò)量添加時(shí)有發(fā)生，如美國(guó)進(jìn)口的巧克力、法國(guó)進(jìn)口的家樂(lè)福牌混合糖果、匈牙利進(jìn)口的哈斯兒童維生素C泡騰片、比利時(shí)進(jìn)口的HAMLET的進(jìn)口棉花糖均存在違規(guī)使用化學(xué)物質(zhì)喹啉黃。但我國(guó)食品中喹啉黃檢測(cè)的方法標(biāo)準(zhǔn)一直未能及時(shí)跟上，造成了喹啉黃檢測(cè)項(xiàng)目的缺失，因此研究喹啉黃的檢測(cè)方法對(duì)于保障食品安全具有重要意義。

目前國(guó)內(nèi)外用于喹啉黃的檢測(cè)方法主要有液相色譜法、分光光度法、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法等。液相色譜法由于色譜條件的不同，喹啉黃部分組分由于未得到有效分離而造成色譜峰個(gè)數(shù)存在差異［2-7］，馬曉燕等和伊熊海等采用液質(zhì)聯(lián)用法以喹啉黃二鈉鹽對(duì)喹啉黃進(jìn)行定量［8-9］，F(xiàn)eng Feng等以喹啉黃作為一鈉鹽來(lái)定量［10］，而單獨(dú)測(cè)定喹啉黃一鈉鹽、二鈉鹽并不能準(zhǔn)確反映喹啉黃的實(shí)際含量。樣品處理方法有聚酰胺吸附法，液-液分配法等，采用固相萃取柱處理樣品的報(bào)道很少。筆者在前期成功分離喹啉黃各組分并對(duì)其各組分進(jìn)行定性定量的基礎(chǔ)上［11］，利用固相萃取-高效液相色譜技術(shù)建立了酒、糖果、巧克力中喹啉黃的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，配有二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，美國(guó)Agilent公司；

電子天平：XS205型，瑞士Metler-Toledo公司；

固相萃取裝置：Wat200609型，美國(guó)Waters公司；

聚酰胺固相萃取柱：500 mg，3 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

氮吹儀：N-EVAP型，美國(guó)Organomation公司；

離心機(jī)：ROTINA 35型，德國(guó)Hettich公司；

具塞塑料離心管：50 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

水相微孔濾膜：0.45μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

渦旋混合器：VX-200型，美國(guó)Labnet公司；

甲醇、乙腈：色譜純，美國(guó)ROE公司；

乙酸銨：分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司；

喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度97.5%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；

實(shí)驗(yàn)室用水為經(jīng)Mili-Q凈化系統(tǒng)(0.22 μm過(guò)濾膜)過(guò)濾的超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)品100.0 mg于100 mL棕色容量瓶中，用純水溶解并定容，配制成1 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，室溫保存?zhèn)溆?。用時(shí)根據(jù)實(shí)際需要再將其配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 液相色譜條件

色 譜 柱：Eclipse XDB-C18色 譜 柱 (4.6 mm×150 mm，5 μm，美國(guó)Agilent公司)；流動(dòng)相：A為0.02 mol／L乙酸銨水溶液，B為甲醇；梯度 洗 脫 程 序：0～1.0 min，20% B，1.0～20.0 min，20% B～90% B，20.0～22.0 min，90% B～20.0% B，22.0～25.0 min，保持20% B；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：415 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4 樣品處理

1.4.1 樣品提取

(1)酒。量取2.0 mL試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入10.0 mL水混勻后，待凈化。

(2)糖果。稱取2 g(精確至0.01 g)已粉碎樣品于50 mL具塞塑料離心管中，加入10.0 mL 60℃水溶解，離心5 min(5 000 r／min)，轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，殘?jiān)?.0 mL水重復(fù)提取一次，合并提取液待凈化。

(3)巧克力。稱取2 g(精確至0.01 g)已粉碎樣品于50 mL具塞塑料離心管中，加入10.0 mL70%的甲醇水溶液，渦旋混勻5 min，離心5 min(5 000 r／min)，轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，殘?jiān)?.0 mL 70%的甲醇水溶液重復(fù)提取一次，合并提取液，待凈化。

1.4.2 樣品凈化

測(cè)定提取液的pH值，若提取液pH值大于6，用檸檬酸溶液(20 g／L)調(diào)pH值為4.0±0.2。將固相萃取柱預(yù)先依次用3 mL甲醇、3 mL水活化。將上述待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，再用1 mL甲醇-甲酸-水溶液(體積比為2∶2∶6)充分洗滌離心管，一并轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，棄去流出液；然后依次用3 mL甲醇-甲酸-水溶液(體積比為2∶2∶6)和3 mL水淋洗，棄去每次淋洗液，抽至近干(至少抽1 min)；用5 mL氨水-甲醇(體積比為1：9)溶液洗脫，控制洗脫流速小于1 mL／min，收集洗脫液并在60℃水浴下用氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑镉?.0 mL水定容，渦旋溶解，最后用水相微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，濾液待上機(jī)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品各組分含量的測(cè)定

喹啉黃為2-(2-喹啉基)-茚滿基-1，3-二酮單磺酸鈉鹽(QYNa)和2-(2-喹啉基)-茚滿基-1，3-二酮二磺酸二鈉鹽(QYNa2)的混合物。QYNa，QYNa2各存在兩個(gè)同分異構(gòu)體，按保留時(shí)間的前后分別定義為QYNa2Ⅰ，QYNa2Ⅱ，QYNaⅠ，QYNaⅡ。以1.0 mg／mL的喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)溶液為研究對(duì)象，用峰面積歸一化法對(duì)4組峰積分得到喹啉黃各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，QYNa2Ⅰ，QYNa2Ⅱ，QYNaⅠ，QYNaⅡ含量分別為18.89%，8.11%，22.86%，47.84%［11］。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于喹啉黃結(jié)構(gòu)中含有磺酸根基團(tuán)，乙酸銨溶液的存在可以促進(jìn)目標(biāo)物的保留和分離，并且能改善峰形，加入不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇，發(fā)現(xiàn)隨著甲醇比例的增加，流動(dòng)相的極性逐漸減小，洗脫能力逐漸增強(qiáng)。兼顧到合適的保留時(shí)間和良好的色譜峰形，最終選擇甲醇初始比例為20%，流動(dòng)相采用梯度洗脫［11］。

2.3 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

喹啉黃為水溶性偶氮類合成的食用黃色色素，國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)中，對(duì)于提取喹啉黃的溶劑主要為水。在實(shí)際研究過(guò)程中，以水為提取溶劑時(shí)，對(duì)于酒、糖果類樣品具有較好的提取效果，提取液較為澄清，便于進(jìn)行SPE凈化分析；而對(duì)于巧克力類樣品而言，由于樣品基質(zhì)中含有大量的干擾物質(zhì)，均質(zhì)后樣品提取液成懸濁液，即便在較高轉(zhuǎn)速的條件下離心也不能得到較為澄清的提取液。

分別考察了甲醇水溶液與乙腈水溶液作為巧克力基質(zhì)的提取溶劑，提取溶劑中的水可以增強(qiáng)有機(jī)溶劑在樣品中的滲透能力，而乙腈和甲醇都可較好的提取目標(biāo)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種提取溶劑均有良好的提取效果，但考慮到乙腈的實(shí)驗(yàn)成本，選擇甲醇水溶液作為提取溶劑。甲醇與水的體積比為70∶30時(shí)，采用均質(zhì)提取方式，以5 000 r／min離心5 min，提取液較為澄清且分層明顯，取得了較好的提取效果。

2.3.2 凈化柱淋洗條件的優(yōu)化

國(guó)標(biāo)中對(duì)色素的檢測(cè)采用聚酰胺粉末吸附法，但采用聚酰胺粉末吸附存在實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)效率較低，而商品化的聚酰胺固相萃取小柱性價(jià)比較高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以聚酰胺固相萃取小柱為凈化柱去除干擾的效果較好，洗脫比較干凈，基質(zhì)背景和基線噪聲低，可獲得穩(wěn)定滿意的回收率和較好的重現(xiàn)性，酒、糖果、巧克力樣品中添加喹啉黃的色譜圖見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 酒樣品中添加喹啉黃的色譜圖

圖2 糖果樣品中添加喹啉黃的色譜圖

圖3 巧克力樣品中添加喹啉黃的色譜圖

對(duì)于氨水-甲醇(體積比為1∶9)溶液洗脫體積進(jìn)行了比較研究，分別試驗(yàn)了1，2，3，4，5，6，7，8， 9，10 mL氨水-甲醇(體積比為1∶9)溶液的洗脫效果。結(jié)果表明，5 mL氨水-甲醇(體積比為1∶9)溶液可將喹啉黃洗脫完全。由于洗脫液中含有部分水，洗脫液體積大，氮吹時(shí)間較長(zhǎng)，綜合考慮試劑用量及前處理時(shí)間因素，實(shí)驗(yàn)選擇收集前5 mL氨水-甲醇洗脫液作為樣品溶液。

2.4 線性方程與檢出限

喹啉黃在5.0～100.0 μg／mL濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度x與色譜峰面積y呈良好的線性關(guān)系(r≥0.999 9)，以喹啉黃4種組分測(cè)量信噪比為S／N=3時(shí)的進(jìn)樣濃度定義為檢出限，結(jié)果列于表1。

表1 喹啉黃中各組分的線性關(guān)系

喹 啉 黃 的 含 量 以QYNa2Ⅰ，QYNa2Ⅱ，QYNaⅠ，QYNaⅡ含量的總和計(jì)算，單獨(dú)做出某一組分并不能代表喹啉黃的總含量，為得到喹啉黃真實(shí)的添加量，喹啉黃檢出限應(yīng)予以折算。對(duì)不同生產(chǎn)廠家及不同批次的10批食品添加劑喹啉黃進(jìn)行了組分含量分析，分別以1.0 mg／mL的喹啉黃水溶液為研究對(duì)象，用峰面積歸一化法得到喹啉黃各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同食品添加劑喹啉黃中組分含量 %

表2結(jié)果表明，喹啉黃4種組分中檢出限最高的QYNa2Ⅰ的含量大于40%。QYNa2Ⅰ檢出限為1.0 mg／L，折算得到喹啉黃的檢出限酒為2.5 mg／L、糖果和巧克力為2.5 mg／kg。為達(dá)到改善色澤的目的，喹啉黃濃度需達(dá)到10 mg／L(mg／kg)以上才能起作用，檢出限能夠滿足實(shí)際檢測(cè)需要。

2.5 回收試驗(yàn)與精密度試驗(yàn)

通過(guò)向陰性酒、糖果、巧克力樣品中添加低(2.5 mg／L)、中(20.0 mg／L)、高(100.0 mg／L)3個(gè)濃度水平的喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)，每個(gè)濃度樣品平行測(cè)定6次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，喹啉黃的回收率在83.2%～92.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.11%～4.36%，說(shuō)明該方法具有良好的精密度與準(zhǔn)確度。

表3 方法回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法對(duì)市售30個(gè)批次的酒、糖果、巧克力樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示10批次酒中有兩個(gè)檢出喹啉黃，喹啉黃含量分別為14.2，16.5 mg／L，其余樣品均未檢出。

3 結(jié)論

采用SPE-HPLC法測(cè)定了酒、糖果、巧克力中喹啉黃的含量。該方法簡(jiǎn)便快捷，靈敏度高，可滿足國(guó)內(nèi)外現(xiàn)行法規(guī)的限量要求。與之前的檢驗(yàn)方法相比，該方法提高了準(zhǔn)確度和效率，能夠有效監(jiān)管喹啉黃在配制酒中的限量添加，及時(shí)防范喹啉黃在糖果、巧克力中的非法摻入，其它食品基質(zhì)中喹啉黃的測(cè)定也可參照此方法。

［1］ GB 2760-2014 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［2］ 楊富春，張寶元，陳丹萍.用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定葡萄酒中4種色素［J］.江蘇調(diào)味副食品，2010，27(3): 12-14.

［3］ 阮麗萍，吉文亮，劉華良，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中10種合成著色劑［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2011，23(2): 151-154.

［4］ 肖鋒，趙瓊暉，呂行，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定糖果中喹啉黃等9種禁限用合成色素［J］.湘潭大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36(3): 86-89.

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［9］ 馬曉燕，朱順達(dá)，肖海龍，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中喹啉黃、酸性綠S和專利藍(lán)V［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2012，12(4): 182-186.

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［11］ 孫小杰，宋佳，尹華濤.喹啉黃中各組分的定性及定量研究［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2015，24(3): 55-58.

尾氣檢測(cè)技術(shù)革新 助力尾氣減排

不久前，從中科院北京國(guó)家技術(shù)轉(zhuǎn)移中心和中關(guān)村蘭德科教評(píng)價(jià)研究院召開(kāi)的新聞發(fā)布會(huì)獲悉，由北京神州蘭德機(jī)動(dòng)車尾氣治理科技公司研發(fā)的“尾革”技術(shù)減排節(jié)能效果顯著，使用該技術(shù)后機(jī)動(dòng)車尾氣一氧化碳減少30%以上，碳?xì)浠衔铩⒌趸衔锟蓽p少40%以上，老舊車輛尾氣減排均達(dá)到50%以上，汽油車節(jié)油率平均10%以上，柴油車節(jié)油率15%以上。

尾革產(chǎn)品是由納米級(jí)特殊潤(rùn)滑材料經(jīng)過(guò)復(fù)雜的加工工藝制成的一種“固態(tài)滾動(dòng)摩擦潤(rùn)滑劑”。它與機(jī)油完全融合后，具有特殊吸附功能，在發(fā)動(dòng)機(jī)的缸體、活塞、活塞環(huán)、主軸、襯套等運(yùn)動(dòng)部件表面，形成具有納米級(jí)超高硬度的復(fù)合潤(rùn)滑層，使其有效提高抗磨損性和耐腐蝕性。同時(shí)，該技術(shù)還能防止膠質(zhì)沉淀，提高了潤(rùn)滑油的清凈分散和抗氧化性；有效保護(hù)缸體，減少缸體磨損，增加了氣缸密封性。專家認(rèn)為，該技術(shù)對(duì)我國(guó)治理機(jī)動(dòng)車尾氣、減少霧霾源和節(jié)省燃油、機(jī)油具有重要的推廣和應(yīng)用價(jià)值。目前，尾革技術(shù)已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，并研制推出第一代產(chǎn)品——尾氣超標(biāo)車專用版、出租車專用版和大型客貨運(yùn)輸車專用版。尾革產(chǎn)品已成為“冬奧藍(lán)”“天堂藍(lán)”機(jī)動(dòng)車尾氣治理唯一指定專用產(chǎn)品，將在京、津、冀、魯、豫、晉、蒙和蘇州、杭州的出租車、大型客貨車等機(jī)動(dòng)車領(lǐng)域大力應(yīng)用和推廣。

（科技日?qǐng)?bào)）

Detection of Quinoline Yellow in Wine, Candies and Chocolate by SPE-HPLC

Sun Xiaojie1， Zhang Ling1， Song Jia2， Ling Rui1
(1. Nanjing Institute for Food and Drug Control， Nanjing 210008， China；2. Nanjing Bureau of Quality and Technical Supervision， Nanjing 210028， China)

A analytical method based on solid phase extraction and high performance liquid chromatography was established for determination of quinoline yellow in wine，candies and chocolate. The samples were extracted by water and 70% aqueous methanol. The extract was purified with solid phase extraction and measured by HPLC. The compounds were separated by a C18column with methanol-0.02 mol／L ammonium acetate solution by gradient elution mode. The mass concentration of quinoline yellow and chromatographic peaks area had good relationship in the range of 5.0-100.0 mg／L with the correlation coefficient of more than 0.999 9. The detection limit was 2.5 mg／L for wine, 2.5 mg／kg for candies and chocolate. The recoveries were 83.2%-92.2%，with coefficients of variation below 4.4%(n=6). The method of SPE-HPLC is fast，accurate， it can be used for determining the quinoline yellow in wine，candies and chocolate.

high performance liquid chromatography; quinoline yellow; solid phase extraction

O657.7

：A

：1008-6145(2015)06-0019-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2015.06.005

*江蘇省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目(JSSPDB-2013-009)

聯(lián)系人：孫小杰；Email: 55223141@qq.com

2015-07-25