替米沙坦對(duì)血管緊張素Ⅱ所致血管內(nèi)皮細(xì)胞游離鈣離子的抑制作用

黃漢輝 鄭師明 荊冬冬 劉少志 梁穎 關(guān)秉恩 嚴(yán)鵬科

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州510150

替米沙坦對(duì)血管緊張素Ⅱ所致血管內(nèi)皮細(xì)胞游離鈣離子的抑制作用

黃漢輝 鄭師明 荊冬冬 劉少志 梁穎 關(guān)秉恩 嚴(yán)鵬科

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州510150

目的探討血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）對(duì)細(xì)胞鈣庫的應(yīng)激效應(yīng)及替米沙坦對(duì)此的拮抗作用。方法預(yù)防性實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組、AngⅡ0.1μmol/L組和替米沙坦60、300、1000μg/L預(yù)處理組；治療性實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組、AngⅡ0.1μmol/L組和AngⅡ+替米沙坦60、300、1000μg/L組。分別檢測(cè)各組試驗(yàn)前胞內(nèi)鈣離子濃度，記為0 h。體外培養(yǎng)的人大動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)防性給予替米沙坦60、300、1000μg/L培育30 min后，加入AngⅡ0.1μmol/L；或AngⅡ0.1μmol/L培育30 min后，再加入替米沙坦60、300、1000μg/L，分別于共同作用0.5、2、8和24 h采用激光共聚焦掃描顯微鏡成像法檢測(cè)胞漿游離鈣離子濃度。結(jié)果預(yù)防性實(shí)驗(yàn)：與正常對(duì)照組相比，替米沙坦60、300、1000μg/L作用細(xì)胞30 min對(duì)胞漿游離鈣離子濃度無明顯影響，加入AngⅡ0.1μmol/L后，胞漿游離鈣離子濃度立即（0 h）顯著升高，均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），但顯著低于AngⅡ組，并且替米沙坦預(yù)處理濃度越高抑制作用越強(qiáng)（P＜0.05），作用時(shí)間對(duì)此無影響。治療性實(shí)驗(yàn)：AngⅡ0.1μmol/L先誘導(dǎo)30 min后，再加入替米沙坦60μg/L對(duì)升高的胞漿游離鈣離子濃度無抑制作用；替米沙坦300μg/L作用2 h或替米沙坦1000μg/L作用0.5 h才顯示其抑制作用（P＜0.05），但均顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)的正常對(duì)照組。替米沙坦的作用時(shí)間對(duì)此無影響。結(jié)論AngⅡ能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫向胞漿釋放游離鈣離子，而替米沙坦能有效拮抗AngⅡ?qū)?nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激作用及促使胞漿游離鈣離子重新被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重吸收。預(yù)防性給予替米沙坦的拮抗作用較治療性給予的拮抗作用顯著。

替米沙坦；血管內(nèi)皮細(xì)胞；血管緊張素Ⅱ；鈣離子

高血壓、動(dòng)脈硬化、冠心病等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均存在著以內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的一氧化氮（NO）減少而致血管舒張反應(yīng)下降為主要特征的血管內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙［1］。導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的因素中，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAAS），尤其是局部RAAS所產(chǎn)生的血管緊張素Ⅱ（angiotensin，AngⅡ）在病理生理方面起著重要的作用［2］。異常升高的AngⅡ可通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的AT1受體結(jié)合，引起細(xì)胞鈣超載并啟動(dòng)一系列的細(xì)胞凋亡信息轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。替米沙坦（Telmisartan）是新型的長(zhǎng)效AngⅡ受體拮抗劑，其作用機(jī)制主要是與AT1受體結(jié)合，阻斷AngⅡ?qū)T1受體的激動(dòng)作用，作為臨床一線降壓藥被廣泛應(yīng)用。以往的研究顯示，替米沙坦對(duì)由高糖或AngⅡ等因素所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用［3-6］。靜息生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)鈣離子主要儲(chǔ)存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子保持在極低的水平約1×10-7mol/L，細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子濃度差大約為一萬倍［7］。當(dāng)遇到相應(yīng)的刺激時(shí)，細(xì)胞會(huì)通過多種途徑瞬間提高胞內(nèi)局部或全部的鈣離子濃度。其中主要的途徑包括胞外鈣離子的內(nèi)流和胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激釋放儲(chǔ)存在其的鈣離子。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度在細(xì)胞死亡過程中有變化，并且這種變化與許多病理狀態(tài)相關(guān)。已有的研究報(bào)道中，在探討替米沙坦對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度影響時(shí)，較少區(qū)分引起胞內(nèi)鈣離子濃度變化的途徑或給予限制，本文通過采用無鈣離子細(xì)胞培養(yǎng)基，消除細(xì)胞應(yīng)激后鈣離子從胞外內(nèi)流的途徑，探討AngⅡ刺激后胞內(nèi)鈣離子的變化，觀察替米沙坦對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源游離鈣離子濃度的調(diào)控作用，以細(xì)化這兩類物質(zhì)（藥物）對(duì)胞內(nèi)鈣離子影響及其誘發(fā)細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人大動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株（VEC），PriCell公司；替米沙坦，森瑞化工有限公司；AngⅡ，Sigma公司；胎牛血清，美國Hyclone公司；高糖DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；無鈣DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；Fluo-3/AM，Sigma公司。替米沙坦和AngⅡ均用無鈣無血清DMEM培養(yǎng)液溶解配成10 mg/L和2μmol/L母液，用時(shí)以無鈣無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)終末濃度。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)復(fù)蘇血管內(nèi)皮細(xì)胞株，以含血清DMEM培養(yǎng)基（90%高糖DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清）制備濃度為1×105/mL的血管內(nèi)皮細(xì)胞懸浮液。取10 mL血管內(nèi)皮細(xì)胞懸浮液置于75 cm2無菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在5% CO2、37℃、濕度95%的條件中孵化培養(yǎng)，隔天置換培養(yǎng)液。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合液消化傳代。當(dāng)細(xì)胞傳至第3代時(shí)，將細(xì)胞接種于35 mm激光共聚焦玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，置回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后進(jìn)入分組、Fluo-3/AM負(fù)載及干預(yù)試驗(yàn)程序。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

根據(jù)健康人體口服40、80、120 mg替米沙坦片測(cè)得的血漿藥物峰濃度（Cmax）［8］，實(shí)驗(yàn)藥物濃度設(shè)計(jì)為60、300、1000μg/L。

1.3.1 預(yù)防性實(shí)驗(yàn)將接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的血管內(nèi)皮細(xì)胞分為5組：正常對(duì)照組、替米沙坦60、300、1000μg/L預(yù)處理組和AngⅡ0.1μmol/L組。試驗(yàn)添加藥物前每組分別測(cè)定初始鈣離子濃度（0 h），設(shè)為T0。隨后，各組培養(yǎng)基中分別加入培養(yǎng)液10μL（正常對(duì)照組）、濃度為0.036 g/L的替米沙坦10μL（60μg/L替米沙坦組）、濃度為0.18 g/L的替米沙坦10μL（300μg/L替米沙坦組）、濃度0.60 g/L的替米沙坦10μL（1000μg/L替米沙坦組）和培養(yǎng)液10μL（AngⅡ0.1μmol/L組）。替米沙坦預(yù)處理30 min后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度（T1），除正常對(duì)照組外，其余組均加入濃度2μmol/L的AngⅡ10μL，并分別繼續(xù)共同培養(yǎng)，于AngⅡ加入后瞬時(shí)（T2）、0.5 h（T3）、2 h（T4）、8 h（T5）和24 h（T6）抽樣檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。

1.3.2 治療性實(shí)驗(yàn)將接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的血管內(nèi)皮細(xì)胞分為5組：正常對(duì)照組、AngⅡ0.1μmol/L組，AngⅡ+替米沙坦60、300、1000μg/L組。試驗(yàn)添加藥物前每組分別測(cè)定初始鈣離子濃度（0 h），設(shè)為T0。隨后，除正常對(duì)照組外，其余各組加入0.1μmol/L的AngⅡ10μL培養(yǎng)30 min后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度（T1），再加入替米沙坦（加入濃度和體積同“1.3.1”項(xiàng)下），并分別繼續(xù)共同培養(yǎng)，于替米沙坦加入后瞬時(shí)（T2）、0.5 h（T3）、2 h（T4）、8 h（T5）和24 h（T6）抽樣檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。

1.4 胞漿游離鈣離子濃度測(cè)定[9]

按照檢測(cè)時(shí)間，分別取各組細(xì)胞應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡調(diào)節(jié)激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為526 nm，置負(fù)載Fluo-3的內(nèi)皮細(xì)胞于鏡下，于每個(gè)檢測(cè)時(shí)點(diǎn)，每組隨機(jī)選取活細(xì)胞8個(gè)，各細(xì)胞共掃描16次，每次掃描間隔時(shí)間為2 s，取16次掃描測(cè)得的平均熒光強(qiáng)度數(shù)值作為該內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 替米沙坦預(yù)處理對(duì)AngⅡ?qū)е碌难軆?nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

替米沙坦預(yù)處理加入AngⅡ0.1μmol/L后，胞漿游離鈣離子濃度立即（0 h）顯著升高，均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），但顯著低于AngⅡ組，并且替米沙坦預(yù)處理濃度越高抑制作用越強(qiáng)（P＜0.05），作用時(shí)間對(duì)此無影響。見表1。

2.2 替米沙坦對(duì)AngⅡ?qū)е碌难軆?nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

與正常對(duì)照組相比，AngⅡ0.1μmol/L誘導(dǎo)30 min，鈣離子濃度顯著升高（P＜0.05）。與AngⅡ0.1μmol/L相比，加入替米沙坦60μg/L作用24 h，對(duì)升高的胞漿游離鈣離子濃度無抑制作用；替米沙坦300μg/L作用2 h或替米沙坦1000μg/L作用0.5 h才顯示其抑制作用（P＜0.05），均顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)的正常對(duì)照組；替米沙坦的作用時(shí)間對(duì)此無影響。見表2。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，AngⅡ能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫向胞漿釋放游離鈣離子，而替米沙坦具有效拮抗AngⅡ?qū)?nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激作用及促使胞漿游離鈣離子重新被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重吸收。血管內(nèi)皮細(xì)胞具有物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、自分泌、旁分泌等多重功能，是易受損的功能性界面，對(duì)各種不同的病理生理干預(yù)均可發(fā)生形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)方面的改變。多種心血管病變均可引起內(nèi)源性AngⅡ分泌增加，超生理濃度的AngⅡ可通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的AT1受體結(jié)合，激動(dòng)G蛋白，使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇水解生成三磷酸肌醇（IP3），生成的IP3激動(dòng)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3受體（IP3敏感型鈣庫），致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞漿釋放大量游離Ca2+，同時(shí)損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵（endoplasmic reticulum Ca2+ATPase，SERCA）的活力，影響其對(duì)細(xì)胞質(zhì)游離鈣離子的重新吸收，引起細(xì)胞鈣超載并啟動(dòng)一系列的細(xì)胞凋亡信息轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［10-12］，這一系列的改變將進(jìn)一步引起細(xì)胞骨架降解，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)自溶反應(yīng)［13-15］。而血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是動(dòng)脈粥樣硬化病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］。

表1 替米沙坦預(yù)防性實(shí)驗(yàn)對(duì)鈣離子熒光強(qiáng)度的影響（x±s）

表2 替米沙坦治療性實(shí)驗(yàn)對(duì)鈣離子熒光強(qiáng)度的影響（x±s）

替米沙坦是新型的AngⅡ受體拮抗劑，其作用機(jī)制主要是與AT1受體結(jié)合，阻斷AngⅡ?qū)T1受體的激動(dòng)作用。Selman等［11］對(duì)心肌細(xì)胞的研究中觀察到，替米沙坦能在一定程度上阻斷IP3對(duì)IP3受體的激動(dòng)作用，并在進(jìn)一步的動(dòng)物試驗(yàn)中觀察到，長(zhǎng)期給高血壓大鼠灌服替米沙坦可令I(lǐng)P3受體的數(shù)量下調(diào)。Abiko等［10］等Maczewski等［14］研究表明，AngⅡ、甲狀腺素等作用內(nèi)皮細(xì)胞后，SERCA mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著下降且和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝取Ca2+的能力下降相關(guān)，咪達(dá)普利和替米沙坦干預(yù)后，SERCA mRNA表達(dá)無明顯變化，但可顯著提高SERCA的活力。

從本試驗(yàn)的預(yù)防性和治療性試驗(yàn)觀察到，血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)替米沙坦預(yù)處理30 min后均能有效拮抗AngⅡ引起的胞漿游離鈣離子濃度上升。這可能與替米沙坦為AngⅡ受體拮抗劑，經(jīng)替米沙坦預(yù)處理30 min后，藥物優(yōu)先占據(jù)AngⅡ的AT1受體結(jié)合位點(diǎn)，阻礙或（和）減弱了AngⅡ?qū)Y(jié)合位點(diǎn)的激動(dòng)作用及由于受體激動(dòng)后所誘發(fā)的連鎖反應(yīng)。替米沙坦的預(yù)防作用也可能與其阻斷IP3對(duì)IP3受體的激動(dòng)作用，部分阻斷鈣庫內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放有關(guān)。

AngⅡ預(yù)先誘導(dǎo)30 min的試驗(yàn)中，300μg/L替米沙坦作用2 h或1000μg/L替米沙坦作用0.5 h才顯示其抑制胞漿游離鈣離子濃度的作用。這可能由于AT1受體被AngⅡ預(yù)先占據(jù)并激動(dòng)，而AngⅡ在細(xì)胞和組織中的半衰期為15～30 min，在此期間AT1受體等結(jié)合位點(diǎn)依然被AngⅡ所占據(jù)但由于替米沙坦與AngⅡ競(jìng)爭(zhēng)相同的作用位點(diǎn)。因此，替米沙坦同樣起到一定的拮抗作用，以至于抑制了胞內(nèi)游離Ca2+的持續(xù)上升（與AngⅡ模型組比較）。隨著AngⅡ被活細(xì)胞逐漸代謝，原先被AngⅡ占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)重新暴露并被替米沙坦占據(jù)。其后胞內(nèi)游離鈣離子濃度的降低可能與沙坦類藥物同時(shí)抑制多種細(xì)胞內(nèi)氧化反應(yīng)［16-21］，或替米沙坦提高了SERCA的活力，促使胞漿游離鈣離子重新被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器重吸收有關(guān)。

從觀察到的結(jié)果可以得出，替米沙坦對(duì)AngⅡ引起的胞漿游離鈣離子濃度的上升拮抗作用具有劑量相關(guān)性，高濃度的替米沙坦拮抗作用明顯優(yōu)于低濃度。但基于受體具有飽和性，組織或細(xì)胞中含有某種受體的數(shù)目是相對(duì)固定的，當(dāng)受體與配體結(jié)合達(dá)到飽和時(shí)，生物效應(yīng)并不會(huì)因?yàn)榕潴w數(shù)目的增加而又有增強(qiáng)。故此，替米沙坦或許存在拮抗AngⅡ受體外的其他保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制，如阻斷鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放、提高SERCA的活力加快胞內(nèi)游離鈣離子的重吸收等，以終止和（或）延緩細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。

綜上所述，替米沙坦可通過影響AT1受體、IP3受體及SERCA的活力等保護(hù)降低內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子水平，減少細(xì)胞鈣超載，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

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The inhibitory effect of Telmisartan on vascular endothelium cells free calcium induced by angiotensinⅡ

HUANG Hanhui ZHENG Shiming JING Dongdong LIU Shaozhi LIANG Ying GUAN Bing'en YAN Pengke
Department of Pharmacy,the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangdong Province, Guangzhou 510150,China

ObjectiveTo explore the effect of angiotensin(Ang)Ⅱon intracellular free calcium concentration in vascular endothelial cell(VEC)and antagonism of Telmisartan.MethodsPreventive test:control group;AngⅡ0.1μmol/L group;60,300 and 1000μg/L Telmisartan groups.Therapeutic test:control group;AngⅡ0.1μmol/L group;60,300 and 1000μg/L Telmisartan+AngⅡgroups.Intracellular calcium concentration was detected in each groups before the tests and the time were denoted 0 h.VECs co-cultured with 60,300 and 1000μg/L Telmisartan separately as prevention and increased AngⅡ0.1μmol/L after 30 min;or VECs co-cultured with AngⅡ0.1μmol/L and increased 60, 300 and 1000μg/L Telmisartan separately after 30 min.Then,concentration of intracellular free calcium concentration in VEC was scanned by laser scanning confocal microscope on certain point time when VECs were co-cultured 0.5,2, 8 and 24 h.ResultsPreventive test:compared with the control group,VECs pre-co-cultured with 60,300 and 1000 μg/L Telmisartan 30 min separately has no discernible effect on VEC's intracellular free calcium concentration.But after increasing AngⅡ0.1μmol/L,concentration of intracellular free calcium climbed significantly instantaneously, which were higher than control group(P＜0.05),but lower than the groups which never pretreated with Telmisartan and preformed dose-response relationship characters. Therapeutic test:VECs were pretreated with AngⅡ0.1 μmol/L showed Telmisartan preformed resistance after 2 h with 300μg/L and 0.5 h with 1000μg/L(P＜0.05).But 60μg/L Telmisartan had no discernible effect on VEC'sintracellular free calcium concentration.In both experiment,time have no much effect on the results.Conclusion AngⅡcan induce endoplasmic reticulum calcium store release free calcium to the cytoplasmic.Telmisartan can antagonize the stress effect on endoplasmic reticulum caused by AngⅡand promote the intracellular free calcium ion re-reabsorption by the endoplasmic reticulum.Effects of resistance of Telmisartan on pretreatment as prevention is higher than those on treatment as therapy.

Telmisartan;Vascular endothelial cell;AngiotensinⅡ;Ca2+

R972.4

A

1673-7210(2015）01(c）-0011-05

2014-10-28本文編輯：程銘）

黃漢輝（1975-），男，副主任藥師；研究方向：心腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制。

嚴(yán)鵬科（1967-），男，醫(yī)學(xué)博士，主任藥師，教授，碩士生導(dǎo)師；研究方向：心腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制和新藥研發(fā)。