膿毒癥患者血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞水平與機體細胞免疫狀態(tài)的相關(guān)性研究

耿延青

浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院ICU，浙江溫嶺317500

膿毒癥患者血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞水平與機體細胞免疫狀態(tài)的相關(guān)性研究

耿延青

浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院ICU，浙江溫嶺317500

目的探討膿毒癥患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的水平與細胞免疫的關(guān)系。方法以2013年7月～2014年6月浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院收治的膿毒癥患者53例為觀察組。將觀察組患者按病情分為膿毒癥組（18例）、嚴(yán)重膿毒癥組（21例）、膿毒癥休克組（14例）；按28 d預(yù)后情況分為死亡組（16例）和存活組（37例）。另選取25名健康者為對照組。用流式細胞儀檢測CD4+CD25+Treg及T細胞亞群水平并進行組間比較。結(jié)果CD4+CD25+Treg表達率：膿毒癥休克組＞嚴(yán)重膿毒癥組＞膿毒癥組＞對照組，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平：膿毒癥組＞對照組＞嚴(yán)重膿毒癥組＞膿毒癥休克組，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CD8+水平各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。死亡組CD4+CD25+Treg表達率明顯高于存活組（P＜0.05）；CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平明顯低于存活組（P＜0.05）；CD8+水平兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論膿毒癥患者Treg細胞水平增高，可能導(dǎo)致T淋巴細胞亞群水平降低，在預(yù)測患者預(yù)后方面有一定作用。

膿毒癥；細胞免疫；CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞

膿毒癥（sepsis）是感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）。膿毒癥造成多器官功能衰竭是嚴(yán)重創(chuàng)傷患者死亡的主因之一。已往研究認為，膿毒癥是過度炎性反應(yīng)的一系列綜合征，也就是機體自身滅活病原體的免疫機制被過度激活，導(dǎo)致炎性反應(yīng)失控，從而引起機體自身損傷，導(dǎo)致多器官功能衰竭甚至死亡。對膿毒癥發(fā)病機制的深入探索揭示，除了病原菌及其毒素對正常組織的侵害之外，機體自身免疫功能失衡也在膿毒癥的發(fā)病及進展中也起著重要作用［1］。免疫亢進與免疫抑制兩種病理狀態(tài)同時存在，加劇了膿毒癥的進展。近年研究發(fā)現(xiàn)，機體中存在著CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（Treg細胞）。膿毒癥患者Treg水平升高，從而啟動免疫抑制效應(yīng)，誘發(fā)T淋巴細胞過度凋亡，這正是膿毒癥患者免疫功能紊亂的發(fā)生機制［2］。本研究檢測了膿毒癥患者Treg細胞與T細胞亞群水平，分析兩者的相關(guān)性及與膿毒癥患者病情與預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)總結(jié)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年7月～2014年6月在浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）治療的膿毒癥患者53例為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合國際膿毒癥定義會議制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有自身免疫系統(tǒng)疾?。虎诩毙阅X卒中；③心肌梗死；④病毒性肝炎；⑤HIV感染；⑥入院前3個月內(nèi)使用過激素或免疫抑制劑者。入選患者男31例，女22例；年齡31～69歲，平均（58.52± 13.46）歲。疾病構(gòu)成：消化道穿孔破裂術(shù)后21例；膽囊壞死及重癥膽管炎12例；腸梗阻術(shù)后9例；肺部感染11例。選取25名健康者為對照組，男15例，女10例；年齡32～65歲，平均（56.25±14.62）歲。將觀察組患者按疾病嚴(yán)重程度分為膿毒癥組（18例）、嚴(yán)重膿毒癥組（21例）、膿毒癥休克組（14例）；按28 d預(yù)后情況分為死亡組（16例）和存活組（37例）。

1.2 方法

1.2.1 一般監(jiān)測指標(biāo)監(jiān)測記錄血乳酸水平、氧合指數(shù)；評估急性生理和慢性健康評分（APACHEⅡ評分）。血乳酸水平檢測儀器為美國雅培I-Stat血液分析儀。抽取動脈血1 mL，應(yīng)用電極法測定血乳酸值。氧合指數(shù)通過測定動脈氧分壓后計算得出（氧合指數(shù)=動脈氧分壓/吸入氧濃度）。APACHEⅡ評分包括急性生理評分、年齡評分、慢性健康評分三部分，總分0～71分。

1.2.2 試驗指標(biāo)符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者于入選當(dāng)天采肘靜脈血10 mL，4 h內(nèi)應(yīng)用流式細胞儀檢測CD4+CD25+Treg及T細胞亞群水平。另25名例健康者作為對照組同期進行試驗。

試劑與儀器：異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的小鼠抗人CD25單抗，藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的CD4單抗，CD25同型陰性對照試劑，CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CYS試劑（美國Beckman-Coulter公司），細胞膜滲透性試劑盒（美國eBioscience公司）。流式細胞儀（美國Beckman-Coulter公司）。

CD4+CD25+Treg檢測：將25μL抗凝全血加入試管中，再添加5μL CD25-FITC與5μL CD4-PE，混勻并在室溫環(huán)境下避光反應(yīng)15 min，添加500μL溶血劑，放置于37℃水浴箱中保存10 min，然后上流式細胞儀檢測。T細胞亞群檢測：取100μL全血，采用全血流式細胞儀三色標(biāo)記法（直接免疫熒光標(biāo)記法），確定CD3+、CD4+、CD8+并計算CD4+/CD8+。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般臨床資料比較

不同病情患者各指標(biāo)比較：血乳酸水平、APACHEⅡ評分，膿毒癥休克組＞嚴(yán)重膿毒癥組＞膿毒癥組（P＜0.05）；氧合指數(shù)，膿毒癥組＞嚴(yán)重膿毒癥組＞膿毒癥休克組（P＜0.05）。見表1。

不同預(yù)后患者各指標(biāo)比較：存活組血乳酸水平、APACHEⅡ評分低于死亡組（P＜0.05）；存活組氧合指數(shù)高于死亡組（P＜0.05）。見表2。

2.2 各組CD4+CD25+Treg表達率與T細胞亞群水平比較

不同病情患者各指標(biāo)比較：CD4+CD25+Treg表達率，膿毒癥休克組＞嚴(yán)重膿毒癥組＞膿毒癥組＞對照組（P＜0.05）；CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平，膿毒癥組＞對照組＞嚴(yán)重膿毒癥組＞膿毒癥休克組（P＜0.05）；CD8+各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

不同預(yù)后患者各指標(biāo)比較：死亡組CD4+CD25+Treg表達率明顯高于存活組（P＜0.05）；CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+明顯低于存活組（P＜0.05）；CD8+兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表1 不同病情患者臨床資料比較（x±s）

2.3 各指標(biāo)相關(guān)性分析

膿毒癥患者CD4+CD25+Treg表達率與APACHEⅡ評分呈正相關(guān)（r=0.793，P＜0.05）；與血乳酸水平呈正相關(guān)（r=0.627，P=0.01）；與CD4+/CD8+呈負相關(guān)（r=-0.623，P＜0.05）。

表2 不同預(yù)后患者臨床資料比較（x±s）

表3 各組CD4+CD25+Treg表達率與T細胞亞群水平比較（x±s）

3 討論

3.1 促炎/抗炎反應(yīng)失衡促進膿毒癥發(fā)病的機制

膿毒癥的本質(zhì)是機體對感染的過度免疫反應(yīng)。目前認為促炎反應(yīng)/抗炎反應(yīng)動態(tài)失衡在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。促炎/抗炎反應(yīng)過程可分為兩個階段：

第一個階段是炎癥反應(yīng)綜合征期。此時期的顯著特征是細胞免疫狀態(tài)呈增高趨勢，主要為大量產(chǎn)生TNF-α、IL-1β等前炎癥細胞因子，使機體的炎性反應(yīng)被充分激活，導(dǎo)致單核細胞急劇增殖，同時活性水平增高，分泌TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等細胞因子，誘導(dǎo)抗原性T淋巴細胞活化。TNF-α、IL-1和IL-6也是膿毒癥早期的促炎因子，可以通過促進自由基、緩激肽、組胺等產(chǎn)生，激活補體等，加重膿毒癥患者的組織損傷［3］。另外，在膿毒癥患者的促炎反應(yīng)還表現(xiàn)為前列腺素E2（PGE2）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）合成增多，對機體的免疫功能產(chǎn)生了很大的影響［4］。

第二個階段是代償性抗炎反應(yīng)期。激發(fā)炎癥反應(yīng)綜合征之后，隨著膿毒癥促炎反應(yīng)發(fā)展，在膿毒癥的后期，機體啟動代償性抗炎反應(yīng)，進入免疫抑制狀態(tài)，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)免疫麻痹，其典型表現(xiàn)是CD4+T淋巴細胞以及B淋巴細胞不斷出現(xiàn)凋亡，而且增殖能力明顯降低，其造成的免疫抑制是膿毒癥病理生理機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，使機體對病原體的易感性明顯增加。同時，在機體的負向調(diào)控機制中，細胞因子也發(fā)揮了重要的作用。IL-10是由多種細胞（如單核細胞、T細胞、B細胞、肥大細胞等）分泌的抗炎細胞因子，是機體重要的免疫調(diào)節(jié)因子，作為抗炎因子主要對單核/巨噬細胞發(fā)揮影響，抑制巨噬細胞的黏附、激活。隨著IL-10等抗炎細胞因子水平升高以拮抗過度產(chǎn)生的前炎癥細胞因子，而前炎癥細胞因子水平明顯降低，導(dǎo)致機體免疫功能低下，尤其是抗感染的功能嚴(yán)重受損，成為病情進一步惡化的主要原因。研究證實，IL-10水平升高被認為與膿毒癥時免疫功能紊亂相關(guān)［5］。有報道顯示，應(yīng)用相應(yīng)的抗原和IL-10反復(fù)刺激可以抑制細胞因子，誘導(dǎo)特異性調(diào)節(jié)性T淋巴細胞增殖、克隆，從而發(fā)揮免疫抑制作用。

3.2 Treg細胞對膿毒癥免疫功能的影響

在動物和人類膿毒癥患者中，均被證實發(fā)生了大量CD4+T淋巴細胞和B淋巴細胞凋亡。秦慶華［6］指出，大約1/2由于膿毒癥致死的患者表現(xiàn)為淋巴細胞的凋亡增加，雖然未發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細胞等的數(shù)量出現(xiàn)明顯減少，但CD4+T淋巴細胞和B淋巴細胞濃度均顯著降低。由于淋巴細胞的大量凋亡，使活化的T淋巴細胞不斷被清除，這誘導(dǎo)了T淋巴細胞的克隆無反應(yīng)性，導(dǎo)致其對抗原刺激失去反應(yīng)，無法對抗病原體的侵襲，并且分泌細胞因子的能力也明顯受到抑制。伴隨著淋巴細胞大量凋亡的還有樹突狀細胞，后者是功能最強的抗原遞呈細胞，其凋亡使細胞的抗原遞呈能力明顯受損，進而引起CD4+T淋巴激活功能障礙，進一步加劇了機體的免疫功能異常反應(yīng)。

表4 不同預(yù)后患者CD4+CD25+Treg表達率與T細胞亞群水平比較（x±s）

CD4+CD25+Treg是1995年Sakaguchi等在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，其在正常人和小鼠外周血CD4+T細胞中的含量占1%～2%，主要特征性表達CD25（IL-2受體的A鏈），具有分泌IL-10與PGE2的功能，是一類重要的免疫抑制細胞，廣泛參與多種免疫調(diào)節(jié)機制。近年來較多研究表明，CD4+CD25+Treg在膿毒癥復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著對細胞免疫的抑制作用，可影響機體的天然免疫和獲得性免疫。盛志勇等［7］認為，膿毒癥患者機體的免疫反應(yīng)傾向于Th2型，Th2型細胞因子生成增多而Th1型細胞因子產(chǎn)生減少，明顯損害了機體的細胞免疫功能。Treg可以抑制CD4+/CD8+T淋巴細胞功能，介導(dǎo)Th1向Th2反應(yīng)漂移，調(diào)節(jié)促炎、抗炎介質(zhì)水平，下調(diào)樹突狀細胞表面共刺激分子的表達，影響免疫細胞如單核巨噬細胞、中性粒細胞的凋亡和增殖，特別是誘導(dǎo)T淋巴細胞的凋亡［8］。研究表明，Treg細胞水平與膿毒癥的發(fā)病存在密切關(guān)系，膿毒癥發(fā)病時Treg水平明顯升高。在膿毒癥患者中，CD4+CD25+Treg升高在死亡者中多見，提示CD4+CD25+Treg在某種程度上能夠表現(xiàn)膿毒癥患者病情的嚴(yán)重程度，能夠為預(yù)測患者的預(yù)后提供依據(jù)［9］。Zhang等［10］從基因水平證實上述結(jié)論，其研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者Treg細胞的特異性標(biāo)志Foxp3 mRNA明顯增多。Hein等［11］研究報道膿毒癥患者Treg水平與ASPsⅡ及乳酸水平存在負相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，CD4+CD25+Treg表達率：膿毒癥休克組＞嚴(yán)重膿毒癥組＞膿毒癥組＞對照組；膿毒癥組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+明顯高于對照組，嚴(yán)重膿毒癥組和膿毒癥休克組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+則顯著下降。相關(guān)性分析表明：膿毒癥患者CD4+CD25+Treg表達率與APACHEⅡ呈正相關(guān)，與乳酸水平呈正相關(guān)，與CD4+/CD8+呈負相關(guān)。T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+是機體的免疫功能狀態(tài)的重要指標(biāo)。Inoue等［12］研究發(fā)現(xiàn)，采用干預(yù)措施減少CD4+和CD8+的凋亡，能夠改善膿毒癥的生存率。這說明隨病情加重，膿毒癥患者Treg水平呈上升趨勢，從而加劇免疫無反應(yīng)狀態(tài)。有關(guān)Treg誘導(dǎo)淋巴細胞凋亡的機制，可能有以下多種不同的途徑：①IL-2是細胞增殖信號，在T淋巴細胞增殖過程中起著重要的激活作用。Treg細胞上的CD25能夠與效應(yīng)細胞競爭結(jié)合IL-2，使IL-2無法正常發(fā)揮增殖信號功能［13］。②Treg細胞能夠誘導(dǎo)IL-10水平的升高，從而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。③Treg細胞能夠激活FAS和FASL，通過Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)T細胞彼此殺傷或直接凋亡。④Treg細胞經(jīng)TCR介導(dǎo)的信號刺激活化后，能導(dǎo)致免疫亢進轉(zhuǎn)向免疫抑制。隨著膿毒癥病情的加重，Treg數(shù)量增加，免疫抑制加劇，最終導(dǎo)致患者免疫麻痹，甚至死亡。已有研究表明，通過使用胸腺肽，誘導(dǎo)和促進T淋巴細胞的分泌與成熟，能夠有效提高IL-2的活性及受體表達水平，從而對膿毒癥的免疫抑制產(chǎn)生刺激作用，逆轉(zhuǎn)其免疫抑制狀態(tài)，尤其是對于輕中度的免疫抑制狀態(tài)能夠通過上述治療取得良好效果，而重度免疫抑制者經(jīng)過較長時間持續(xù)治療也能夠獲益［14］。進一步證明免疫抑制的形成與改善是影響患者預(yù)后的重要因素。

綜上所述，臨床上對膿毒癥患者檢測Treg水平能夠反映患者的細胞免疫狀態(tài)，對患者的預(yù)后有一定預(yù)測作用。但由于目前相關(guān)的臨床研究還較少，其確切的調(diào)控機制還有待進一步深入探討。由于膿毒癥患者的免疫失衡涉及各種細胞因子及炎癥介質(zhì)，而且與神經(jīng)、內(nèi)分泌因素的調(diào)節(jié)作用存在密切關(guān)系，因此，僅分析某幾種細胞或細胞因子的相關(guān)性，不可能全面了解其根本的發(fā)病機制。隨著對Treg細胞的免疫調(diào)節(jié)功能認識的日益深化，對膿毒癥的臨床干預(yù)的切入點將會越來越多，從而為防治膿毒癥及其他感染性疾病提供可靠的新手段。

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The relationship between CD4+CD25+Treg cells and cell immune state in patients with sepsis

GENG Yanqing
Department of ICU,The First People's Hospital of Wenling City,Zhejiang Province,Wenling 317500,China

ObjectiveTo investigate the relationship between level of CD4+CD25+Treg cells and cell immune state in patients with sepsis.Methods53 patients with sepsis treated in the First People's Hospital of Wenling City from July 2013 to June 2014 were selected as observation group.The observation group was divided into sepsis group(18 cases), severe sepsis group(21 cases),and septic shock group(14 cases)according to the disease severity;and divided into death group(16 cases)and survival group(37 cases)according to the treatment result.25 healthy individuals served as controls.The expression of CD4+CD25+Treg cells and T-lymphocyte subsets was detected by flow cytometry.The expression of CD4+CD25+Treg cells and T-lymphocyte subsets within groups was compared.ResultsThe expression rate of CD4+CD25+Treg cells:septic shock group＞severe sepsis group＞sepsis group＞control group,with significant difference of those groups(P＜0.05).The level of CD3+,CD4+and CD4+/CD8+:sepsis group＞control group＞severe sepsis group＞septic shock group,with significant difference of those groups(P＜0.05).There was no significant difference in CD8+of these groups(P＞0.05).The expression of CD4+CD25+Treg cells in death group was higher than that in survival group(P＜0.05),the levels of CD3+,CD4+and CD4+/CD8+in death group was lower than those in survival group (P＜0.05).There was no significant difference in CD8+between death group and survival group(P＞0.05).ConclusionThe expression of CD4+CD25+Treg cells increased in patients with sepsis,which maybe reduce the levels of T lymphocyte subsets and has clinical value to assess the prognosis.

Sepsis;Cell immunity;CD4+CD25+Treg cells

R392

A

1673-7210(2015）01(c）-0007-05

2014-09-30本文編輯：程銘）

浙江省溫嶺市科研計劃項目（編號2011WLCB0104）。