左旋紫草素轉(zhuǎn)化工藝*

周健，郭瑞霞，王汝興，趙桂琴

(1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所、河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德 067000；2.石家莊學(xué)院化工學(xué)院，石家莊 050017)

左旋紫草素轉(zhuǎn)化工藝*

周健1，郭瑞霞2，王汝興1，趙桂琴1

(1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所、河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德 067000；2.石家莊學(xué)院化工學(xué)院，石家莊 050017)

目的研究紫草總色素轉(zhuǎn)化為左旋紫草素的最佳工藝條件。方法采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)法，以左旋紫草素轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，優(yōu)選轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化時間、2%氫氧化鈉的體積與紫草總色素的質(zhì)量比。結(jié)果溫度35 ℃，轉(zhuǎn)化時間4 h，2%氫氧化鈉的體積與紫草總色素的質(zhì)量比例為4.5 mL·mg-1時，紫草素轉(zhuǎn)化率最高，平均轉(zhuǎn)化率為64.86%。結(jié)論該優(yōu)選工藝方便簡便，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

紫草總色素；左旋紫草素；正交實(shí)驗(yàn)

紫草為紫草科紫草屬草本植物，分為新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle) Johnst.和內(nèi)蒙紫草ArnebiaguttataBunge。本品味苦、性寒，長于活血、涼血、解毒，為傳統(tǒng)中藥材[1]。紫草的有效化學(xué)成分主要分為兩類：一類是水溶性成分，主要是多糖，含量約2%[2]；另外一類是脂溶性很強(qiáng)的萘醌類紫草總色素[3]，包括左旋紫草素、去氧紫草素、乙酰紫草素、β-羥基異戊酰紫草素等[4]。紫草總色素有抗病原微生物、抗炎、抗過敏、解熱、抗腫瘤及止血等藥理作用[5]，其中左旋紫草素為主要活性成分[6]。在有關(guān)紫草素的制劑中左旋紫草素為主要檢測指標(biāo)，但是目前的研究報道大多局限于紫草總色素的提取分離方法，而忽略了總色素中左旋紫草素的含量，從而影響了紫草總色素藥效的發(fā)揮。本實(shí)驗(yàn)就這一問題進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀；HP-8453型紫外-可見分光光度儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化EYELA)；DZKW-C電子恒溫水浴鍋(北京光明醫(yī)療儀器廠)。

1.2 試藥 左旋紫草素，購自中國食品藥品檢定研究院(批號：110769-200204)；新疆紫草，購自中國藥材集團(tuán)承德藥材有限公司，由承德醫(yī)學(xué)院趙桂琴教授鑒定為新疆紫草[Arnebiaeuchroma(Royle) Johnst]的干燥根；甲醇，色譜純；乙醇，石油醚均為分析純；氫氧化鈉為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 左旋紫草素提取及堿轉(zhuǎn)化工藝 紫草50 g粉碎至粗粉，加入95%乙醇400 mL，于45 ℃保溫浸提15 h，濾過，濾渣加入95%乙醇400 mL，于45 ℃保溫浸提8 h，濾過，合并2次濾液，減壓回收乙醇，得250 mL濃縮液，由紫外分光光度法測定濃縮液中紫草總色素質(zhì)量，將適量2%氫氧化鈉溶液加入濃縮液，使?jié)饪s液由紫紅色變?yōu)樗{(lán)色，濾過，得濾餅和濾液，滴加適量甲酸于濾液中，使濾液由藍(lán)色變?yōu)榧t色，加入適量石油醚(沸程60～90 ℃)多次萃取至下層不顯紅色，取上層過濾，得濾液，回收石油醚，于45 ℃干燥，得左旋紫草素粉末狀結(jié)晶，稱重，并用高效液相色譜法測定左旋紫草素含量，計算轉(zhuǎn)化率。

2.2 紫草總色素質(zhì)量測定 準(zhǔn)確吸取提取濃縮液1.00 mL置100.00 mL量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，用95%乙醇作參比，用紫外分光光度計，選擇波長516 nm測定吸光度，按左旋紫草素(吸光系數(shù)E為242)計算紫草總色素的質(zhì)量。

2.3 含量測定方法

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Discovery C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長516 nm；流動相：甲醇-水-甲酸(85：15：0.1)；柱溫：室溫。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取左旋紫草素對照品12.50 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，得1.250 mg·mL-1對照品溶液，作為對照品儲備液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取紫紅色粉末狀結(jié)晶20 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對照品儲備液適量，按倍比稀釋法制備5個濃度的對照品溶液，濃度分別為1.250，0.625，0.312，0.156，0.078 mg·mL-1，吸取上述溶液，進(jìn)樣10 μL，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：Y=10 268X-111.15，r=0.999 49(n=5)，線性范圍0.078～1.250 mg·mL-1。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密取“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下制備的濃度為0.156 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積RSD為0.43%，表明精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取左旋紫草素對照品溶液(濃度為1.25 mg·mL-1)在室溫下放置2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h，分別吸取10 μL，測定峰面積，RSD為0.929%，結(jié)果顯示在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品5份，按”2.3.3”項(xiàng)下方法制備，按上述色譜條件測定，以左旋紫草素含量計算，RSD為0.92%。

2.3.8 回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量樣品一定量，加入適量對照品，按樣品溶液制備方法制備，測定含量并計算回收率，得平均回收率為99.8%，RSD為2.1%(n=6)。

2.4 正交實(shí)驗(yàn) 通過單因素試驗(yàn)，選擇對紫草總色素轉(zhuǎn)化為左旋紫草素工藝影響較大的3個主要因素，即轉(zhuǎn)化溫度(A)、轉(zhuǎn)化時間(B)、2%氫氧化鈉體積與紫草總色素的質(zhì)量比(C)作為考察對象，選取L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以提取液中左旋紫草素的轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)。因素水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表2，方差分析見表3，紫草總色素轉(zhuǎn)化前后HPLC譜見圖1。

表1 因素與水平表 Tab.1 Factors and levels

A：轉(zhuǎn)化溫度；B：轉(zhuǎn)化時間；C：2%氫氧化鈉體積與紫草總素的質(zhì)量比

A：transformation temperature；B：transformation time；C：ratio of 2% NaoH to alkanna tinctoria pigment

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果 Tab.2 Design and results of orthogonal test

A：轉(zhuǎn)化溫度；B：轉(zhuǎn)化時間；C：2%氫氧化鈉體積與紫草總素的質(zhì)量比

A：transformation temperature；B：transformation time；C：ratio of 2% NaoH to alkanna tinctoria pigment

表3 方差分析表 Tab.3 Analysis of variance

F1-0.05(2，2)=19.00 ；F1-0.01(2，2)=99.00

從轉(zhuǎn)化前后的液相色譜圖中可以看出，紫草總色素基本上轉(zhuǎn)化為左旋紫草素，并且含量>84%。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，因素A、B和C對紫草總色素轉(zhuǎn)化為左旋紫草素都有顯著的影響，3個因素對轉(zhuǎn)化率的影響大小依次為C>B>A。因此，紫草素總色素轉(zhuǎn)化為左旋紫草素的最佳工藝條件為：A2B2C3，即轉(zhuǎn)化溫度為35 ℃，轉(zhuǎn)化時間為4 h，2%氫氧化鈉與紫草總色素用料的比例為4.5 mL·mg-1。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照轉(zhuǎn)化溫度為35 ℃，轉(zhuǎn)化時間為4 h，2%氫氧化鈉與紫草總色素用料的比例為4.5 mL·mg-1進(jìn)行3批小試驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，左旋紫草素的轉(zhuǎn)化率分別為63.34%，64.56%，66.68%，平均轉(zhuǎn)化率為64.86%。

A.轉(zhuǎn)化前；B.轉(zhuǎn)化后；1.左旋紫草素

Fig.1 HPLC chromatograms of Arnebia euchroma pigment before and after conversion

3 討論

在紫草藥材中，左旋紫草素具有強(qiáng)大的生物活性，目前在有關(guān)紫草素的制劑中也以左旋紫草素為主要檢測指標(biāo)?，F(xiàn)階段，關(guān)于紫草天然藥物化學(xué)成分的研究，大多局限于提取工藝方面，由紫草總色素轉(zhuǎn)化為左旋紫草素的研究報道較少。紫草中所含化學(xué)成分主要為紫草總色素，這類物質(zhì)多數(shù)結(jié)合成酯的形式存在，通過

堿化可以去掉側(cè)鏈上的酯基，形成左旋紫草素。再根據(jù)結(jié)構(gòu)中具有酚羥基，顯酸性，能溶于堿液，加酸酸化又可析出的性質(zhì)，可得到高純度的左旋紫草素[7]。

在轉(zhuǎn)化過程中，主要考察了轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化時間、2%氫氧化鈉溶液體積與紫草總色素的質(zhì)量比。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，過量的氫氧化鈉會使溶液的顏色變?yōu)榫G色，紫草總色素溶液局部過度堿化，總色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞；而氫氧化鈉用量不足又會使溶液顯藍(lán)紫色，堿化不完全，降低左旋紫草素的轉(zhuǎn)化率。綜合考慮，選擇濃度為2%氫氧化鈉溶液，轉(zhuǎn)化時間4 h，2%氫氧化鈉的體積與紫草總色素的質(zhì)量比例為4.5 mL·mg-1。實(shí)驗(yàn)中，得藍(lán)色油狀濾餅，取該濾餅，加石油醚溶解，加入甲酸，生成紫紅色溶液，經(jīng)高效液相檢測發(fā)現(xiàn)其中左旋紫草素含量達(dá)20%，而萘醌類左旋紫草素溶于堿性濾液，原因可能為紫草的醇提溶液中含有非酸性類脂溶性物質(zhì)，形成類似于水包油體系，使得左旋紫草素包裹其中，造成損失；目前的研究基本都忽略了該濾餅成分，故回收該濾餅，再次應(yīng)用最佳工藝，最大化利用原料，提高整體的轉(zhuǎn)化率。實(shí)驗(yàn)過程中采用醇提石油醚萃取，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，易于回收，對環(huán)境污染較?。贿x用高效液相色譜作為檢測方法，指標(biāo)簡單、快速、準(zhǔn)確；本研究的完成可促進(jìn)紫草素提取物在制劑成型工藝方面的應(yīng)用，有望將其制備成高效、低毒的現(xiàn)代劑型，使紫草素在治療疾病方面發(fā)揮更好的作用。

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Transforming Process of Shikonin

ZHOU Jian1, GUO Ruixia2, WANG Ruxing1, ZHAO Guiqin1

(1.InstituteofChineseMateriaMedica,ChengdeMedicalCollege,HebeiKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentforTraditionalChineseMedicine,Chengde067000,China； 2.SchoolofChemicalEngineering,ShijiazhuangUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Objective To investigate the optimal condition for transforming alkanna tinctoria pigment into shikonin. Methods Transformation rate of shikonin served as index.Transformation temperature, time, ratio of 2% NaOH to alkanna tinctoria pigment (v/w) was optimized. Results With ratio of 2% NaOH to alkanna tinctoria pigment being 4.5 mL·mg-1, temperature 35 ℃ and the reaction time 4 h, the transformation rate reached the highest, and the average transformation rate was 64.86%. Conclusion This method is easy and simple, and suitable for industrialized production.

Alkanna tinctoria pigment； Shikonin； Orthogonal design

2014-11-05

2015-02-06

*河北省高等學(xué)?？茖W(xué)研究計劃(Q2012096)；河北省研究生創(chuàng)新資助項(xiàng)目(Z0000004)

周健(1991-)，男，湖南婁底人，在讀碩士，主要從事中藥新劑型研究。電話：(0)18703349024，E-mail：380795835@QQ.com。

王汝興(1973-)，男，河北承德人，副教授，在讀博士，主要從事中藥新劑型研究。電話：(0)13653248958，E-mail：Wangru1973@sina.com。

R286；TQ460.6

B

1004-0781(2015)12-1637-03

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.022