蛇床子素對(duì)小鼠濕疹肥大細(xì)胞及其STAT5基因和蛋白表達(dá)的影響*

熊健，鐘振東，傅榮，熊巍

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、四川省人民醫(yī)院皮膚科，成都 610072)

·皮膚性病用藥專欄·

蛇床子素對(duì)小鼠濕疹肥大細(xì)胞及其STAT5基因和蛋白表達(dá)的影響*

熊健，鐘振東，傅榮，熊巍

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、四川省人民醫(yī)院皮膚科，成都 610072)

目的探討蛇床子素對(duì)小鼠濕疹肥大細(xì)胞及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白5(STAT5)基因和蛋白表達(dá)的影響。方法采用被動(dòng)皮膚變態(tài)反應(yīng)復(fù)制小鼠濕疹模型，致敏后分離腹腔肥大細(xì)胞，采用卵蛋白誘發(fā)肥大細(xì)胞過敏，致敏后的肥大細(xì)胞分為空白對(duì)照組、蛇床子素大劑量組及小劑量組。藥物干預(yù)24 h后，采用免疫熒光法檢測3組肥大細(xì)胞形態(tài)，噻唑藍(lán)法檢測藥物對(duì)肥大細(xì)胞增殖的影響，RT-PCR及Western blot法檢測各組細(xì)胞中STAT5基因及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，給藥組肥大細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞核體積縮小，部分細(xì)胞凋亡；細(xì)胞抑制率隨藥物濃度顯著上升(P<0.01)；與空白對(duì)照組(2.16±0.57)比較，蛇床子素大劑量組(0.59±0.12)和小劑量組(0.82±0.13)STAT5基因表達(dá)水平均有極顯著降低(P<0.01)；與空白對(duì)照組比較，蛇床子素大劑量組及小劑量組STAT5蛋白表達(dá)水平均有極顯著降低(P<0.01)。結(jié)論蛇床子素可抑制致敏肥大細(xì)胞的增殖，并下調(diào)STAT5基因和蛋白的表達(dá)。

蛇床子素；濕疹；肥大細(xì)胞；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白5

濕疹是臨床皮膚科常見炎癥性皮膚疾病。目前已被證實(shí)，肥大細(xì)胞脫顆粒病變在濕疹的發(fā)病過程中起著決定性作用。Toshiaki及其研究團(tuán)隊(duì)在人類皮膚上皮細(xì)胞樣本中證實(shí)，肥大細(xì)胞是引起濕疹的罪魁禍?zhǔn)?，而肥大?xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白5(signal transduction and activator of transcription5，STAT5)在濕疹的發(fā)病過程中具有關(guān)鍵性作用，可以大大增加肥大細(xì)胞的數(shù)量[1]。該研究展示了肥大細(xì)胞和STAT5驅(qū)動(dòng)濕疹發(fā)展的關(guān)鍵性作用，同時(shí)該成果也為開發(fā)治療濕疹的藥物提供了重要的靶點(diǎn)。蛇床子素，又名甲氧基歐芹酚或歐芹酚甲醚，主要存在于傘形科14 個(gè)屬植物中和蕓香科17個(gè)屬的植物中，目前已證實(shí)其具有抗菌、抗氧化、抗變態(tài)反應(yīng)等藥理活性[2-3]。蛇床子軟膏是四川省人民醫(yī)院以蛇床子素為原料制備的一種外用擦劑，廣泛用于各種急、慢性濕疹和小兒尿布疹等的治療，其療效顯著，且安全無毒副作用。筆者在本實(shí)驗(yàn)中，在臨床療效基礎(chǔ)上，以蛇床子素單體為研究對(duì)象，研究其對(duì)肥大細(xì)胞及其關(guān)鍵基因和蛋白的影響，旨在探究該品種治療濕疹的作用機(jī)制，為該品種的新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 6周齡雌性BALB/c小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2009-0124。生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2008-0024。飼養(yǎng)條件：四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察室。動(dòng)物自由進(jìn)食飲水，環(huán)境溫度22～24 ℃，相對(duì)濕度45%～75%，通風(fēng)條件良好，環(huán)境相對(duì)安靜，每日光照12 h，每籠5只。

1.2 試藥 蛇床子素，含量：99.5%，批號(hào)：R-140228，購自中國科學(xué)院成都生物所。卵蛋白(ovalbumin，OVA，批號(hào)：S0123)、溴化噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT，批號(hào)：K1208)為Sigma公司產(chǎn)品。Trizol Kit(批號(hào)：S130928)、RNAiso Plus Kit(批號(hào)：BK3303)、PrimeScript RT reagent Kit(批號(hào)：BK501)、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Kit(批號(hào)：BK402)均為美國Amresco公司產(chǎn)品。兔抗人STAT5多克隆抗體、辣根過氧化酶標(biāo)志山羊抗兔抗體、DAB 顯液試劑盒(批號(hào)：BK130922)均購自北京博奧森生物科技公司。STAT5和β-actin引物均由北京博奧森生物科技公司合成。

1.3 儀器 BSA224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，感量：0.1 mg)；PIKORed96 RT-PCR擴(kuò)增儀(美國ThermoFisher儀器有限公司)；UK-33垂直電泳槽(美國Bio-RAD 公司)；DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(美國Bio-RAD 公司)。

1.4 小鼠致敏模型的建立與血清樣本收集 采用被動(dòng)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)復(fù)制小鼠濕疹模型，經(jīng)腹腔注射卵蛋白過敏原和氟氧化鋁佐劑致敏BALB/c小鼠，篩選致敏成功的小鼠，眼球采血，收集血液，3 000 r·min-1(r=3 cm)離心10 min，分離血清，等量混合制備血清池，-80 ℃貯存?zhèn)溆肹4]。

1.5 BALB/c小鼠腹腔肥大細(xì)胞(mice peritoneal mast cells，MPMC)的制備 參照文獻(xiàn)[5]方法，處死小鼠，立即用去鈣鎂離子的Hank’s平衡鹽溶液(Hank's balanced salt solution，HBSS)進(jìn)行腹腔注射，輕撫小鼠腹部3～4 min后打開腹腔，抽取各組小鼠腹腔洗液，低溫離心5 min，收集沉淀細(xì)胞，反復(fù)清洗3次后吹打成細(xì)胞懸液，緩慢加入到30：80的percoII梯度分離液中，低溫離心5 min，用HBSS溶液洗3次，收集界面細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至5×1011·L-1。分別用錐蟲藍(lán)和甲苯胺藍(lán)染色法進(jìn)行細(xì)胞染色，鏡下觀察，鑒定細(xì)胞活力和細(xì)胞純度(甲苯胺藍(lán)染色能與肥大細(xì)胞中的肝素結(jié)合成特異性紫紅色，可用于肥大細(xì)胞鑒定與脫顆粒檢測，它將胞核染成藍(lán)色，故可見細(xì)胞中間有藍(lán)色細(xì)胞核)。取活力和純度均>95%的肥大細(xì)胞置RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 h。

1.6 肥大細(xì)胞體外致敏和激發(fā)實(shí)驗(yàn) 取“1.5”項(xiàng)下分離培養(yǎng)的肥大細(xì)胞，于37 ℃條件下，與鈣離子濃度為5 mmol·L-1的不同濃度致敏血清共孵育2 h，4 ℃終止反應(yīng)，用預(yù)冷的HBSS洗滌，去上清液，在細(xì)胞懸液中加入卵蛋白過敏原溶液終濃度為100 μg·L-1進(jìn)行激發(fā)，孵育60 min。

1.7 藥物干預(yù) 取激發(fā)后的肥大細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗，取含5×104～6 ×104的細(xì)胞懸液170 μL接種于96孔培養(yǎng)板，加入蛇床子素溶液，使其終濃度分別為5.0，1.0 mg·mL-1，分別作為藥物大劑量組及小劑量組，加RPMI-1640培養(yǎng)液至200 μL?？瞻讓?duì)照組只加細(xì)胞懸液170 μL，加培養(yǎng)液至200 μL。每種濃度均作10個(gè)平行孔，混勻后放入二氧化碳孵箱中培養(yǎng)。藥物干預(yù)24 h后，于4 ℃下終止反應(yīng)，用預(yù)冷的HBSS洗滌，收集細(xì)胞和上清液待測。

1.8 檢測指標(biāo)

1.8.1 肥大細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 采用免疫熒光技術(shù)對(duì)3組肥大細(xì)胞進(jìn)行染色，并用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.8.2 肥大細(xì)胞細(xì)胞抑制率 藥物干預(yù)24 h后，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)根據(jù)公式：抑制率(%)=(對(duì)照孔A值-用藥孔A值)/對(duì)照孔A值×100%，計(jì)算抑制率，同時(shí)用免疫熒光法對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行檢測。

1.8.3 STAT5 mRNA檢測 取藥物干預(yù)24 h后的肥大細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用兩步法PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：(95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃預(yù)變性30 s)×40個(gè)循環(huán)，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，得到每個(gè)樣品的Ct值，以β-actin作為內(nèi)參照基因進(jìn)行校準(zhǔn)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的表達(dá)量，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)空白對(duì)照組，STAT5 mRNA和β-actin基因引物信息見表1。

1.8.4 STAT5蛋白檢測 取藥物干預(yù)24 h后的肥大細(xì)胞，細(xì)胞裂解法提取細(xì)胞總蛋白，Lowry法蛋白定量，聚丙烯酰氨凝膠電泳凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)，Western blot蛋白質(zhì)印跡。應(yīng)用Tanon-2500R型全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)成像，使用ScionImage軟件對(duì)蛋白電泳帶進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參照蛋白進(jìn)行校準(zhǔn)，采用目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值來表示STAT5的相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

表1 STAT5和β-actin引物 Tab.1 Primer of STAT5 and β-action

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對(duì)肥大細(xì)胞形態(tài)的影響 藥物干預(yù)后，肥大細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞核體積縮小，核固縮，無核仁；部分凋亡細(xì)胞可見核碎裂，碎裂的核由胞膜包裹并突起于細(xì)胞表面形成凋亡小體。見圖1。

A.空白對(duì)照組；B.蛇床子素大劑量組；C.蛇床子素小劑量組

A.blank control group；B.high-dose osthole group；C.low-dose osthole group

Fig.1 Fluorescence images of three groups of mast cells(×100)

2.2 蛇床子素對(duì)肥大細(xì)胞增殖的影響 蛇床子素作用于肥大細(xì)胞24 h后，蛇床子素大劑量組及小劑量組肥大細(xì)胞抑制率為(87.9±8.2)%，(78.6±7.5)%，與空白對(duì)照組(0.0±0.0)%比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其抑制率與作用濃度呈顯著正相關(guān)。

2.3 蛇床子素對(duì)STAT5 mRNA表達(dá)的影響

2.3.1 熔解曲線分析 由圖2可知，內(nèi)參β-actin和STAT5基因的Tm值分別為86.07和85.24 ℃，說明所得擴(kuò)增產(chǎn)物均是目標(biāo)產(chǎn)物，無引物二聚體及非特異產(chǎn)物。

圖2 內(nèi)參β-actin(A)及STAT5(B)Real-Time PCR產(chǎn)物熔解曲線

Fig.2 Melting curves of PCR product from β-actin(A) and STAT5(B)

2.3.2 擴(kuò)增曲線分析 由圖3可知，內(nèi)參β-actin和STAT5的Ct值均在20～35范圍內(nèi)，表明PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序設(shè)置合理。

2.3.3 蛇床子素對(duì)STAT5 mRNA表達(dá)的影響 蛇床子素大劑量組及小劑量組肥大細(xì)胞中STAT5 mRNA表達(dá)為(0.59±0.12)，(0.82±0.13)，與空白對(duì)照組(2.16±0.57)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明蛇床子素可顯著下調(diào)肥大細(xì)胞中STAT5基因的表達(dá)。

2.4 蛇床子素對(duì)STAT5蛋白表達(dá)的影響 由圖4可知，與空白對(duì)照組比較，蛇床子素大劑量組及小劑量組肥大細(xì)胞中STAT5蛋白表達(dá)均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明蛇床子素可顯著下調(diào)肥大細(xì)胞中STAT5蛋白的表達(dá)。

3 討論

濕疹是嚴(yán)重影響人類健康的常見變態(tài)反應(yīng)疾病，其發(fā)病率高，容易遷延，多種炎癥細(xì)胞參與其發(fā)生、發(fā)展，尤其是肥大細(xì)胞及其介質(zhì)在變態(tài)反應(yīng)過程中起到了非常重要的作用。肥大細(xì)胞是人類速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的初級(jí)效應(yīng)細(xì)胞，主要分布在皮膚、呼吸道、胃腸道及泌尿生殖系統(tǒng)黏膜下層，其激活直接影響次級(jí)效應(yīng)細(xì)胞——嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的募集和激活[6-7]?？梢姺蚀蠹?xì)胞及其介質(zhì)在變態(tài)反應(yīng)過程中起著重要作用，控制或抑制肥大細(xì)胞的過度增生是治療變態(tài)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。

Toshiaki團(tuán)隊(duì)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，敲除STAT5基因后，小鼠擁有了對(duì)濕疹的抵抗力，表明肥大細(xì)胞中的STAT5通路對(duì)于濕疹的重要性。進(jìn)一步采用 STAT5抑制藥后發(fā)現(xiàn)，濕疹小鼠肥大細(xì)胞數(shù)量明顯減少，此研究結(jié)果表明變態(tài)反應(yīng)過程中，肥大細(xì)胞的異常增生可能與STAT5基因和蛋白的過表達(dá)有關(guān)[1]。筆者在本實(shí)驗(yàn)中研究表明，蛇床子素對(duì)致敏后肥大細(xì)胞的過度增生具有明顯的抑制作用，與此同時(shí)，蛇床子素可顯著降低致敏肥大細(xì)胞中STAT5基因和蛋白的表達(dá)，這可能是蛇床子素治療濕疹的內(nèi)在機(jī)制。

圖3 內(nèi)參β-actin(A)及STAT5(B)Real-Time PCR擴(kuò)增曲線

Fig.3 Amplification curves of β-actin(A) and STAT5(B) by real-time PCR

A.電泳圖；B.矩形圖；與空白對(duì)照組比較，*1P<0.01

圖4 蛇床子素對(duì)肥大細(xì)胞STAT5蛋白表達(dá)的影響

A.electrophotogram；B.histogram；compared with blank control group，*1P<0.01

Fig.4 Effect of osthole on the expression of STAT5 protein in mast cells

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Effect of Osthole on Mast Cells and Expression of STAT5 Gene and Protein in Mice with Eczema

XIONG Jian，ZHONG Zhendong，F(xiàn)U Rong，XIONG Wei

(SichuanAcademyofMedicalSciences,DepartmentofDermatology,SichuanProvincialPeople'sHospital,Chengdu610072,China)

Objective To explore the effect of osthole on mast cells and expression of STAT5 gene and protein in them. Methods Passive cutaneous anaphylaxis was made in mice to copy eczema model, then the allergic mast cells were separated, and the ovalbumin was used to induce allergy of mast cells.Different concentrations of osthole were used to intervene the sensitized mast cells.Then the sensitized mast cells were divided into blank control group, osthole high-dose group and low-dose group.At the end of the experiment, morphology of the mast cells was detected by immunofluorescence technology.MTT assay was used to detect the influence of drugs on mast cells proliferation.RT-PCR and Western blotting were used to detect the expression of STAT5 gene and protein. Results As compared with blank control group, the number of mast cells in the osthole groups was significantly reduced, cells and nuclei obviously shrank, even apoptosis of some cells could be observed； the inhibition rate of mast cells in osthole groups was significantly increased in concentration-dependent manner (P<0.01).As compared with blank control group (2.16±0.57), gene expression of STAT5 was significantly decreased in osthole high-dose group (0.59±0.12) and low-dose group (0.82±0.13) (P<0.01).The protein expression of STAT5 was also significantly decreased in osthole high-dose group and low-dose group as compared with blank control group (P<0.01). Conclusion Osthole can inhibit the proliferation of sensitized mast cells, and reduce the expression of STAT5 gene and protein.

Osthole； Eczema； Mast cells； Signal transduction and activator of transcription 5

2014-07-18

2014-09-11

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81301075)

熊健(1976-)，男，四川成都人，學(xué)士，研究方向：皮膚病學(xué)。電話：(0)18080463709，E-mail：1505214952@qq.com。

鐘振東(1974-)，男，四川成都人，助理研究員，碩士，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病理學(xué)工作。電話：(0)13568922768，E-mail：511738602@qq.com。

R285.5；R751

A

1004-0781(2015)12-1584-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.009