杉木中等位酶與早期生長(zhǎng)性狀間的相關(guān)研究

翁春媚，齊 明，王海蓉，華朝暉，包小梅

（1. 浙江省遂昌縣林業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 遂昌 323300；2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽(yáng) 311400）

杉木中等位酶與早期生長(zhǎng)性狀間的相關(guān)研究

翁春媚1，齊 明2*，王海蓉1，華朝暉1，包小梅1

（1. 浙江省遂昌縣林業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 遂昌 323300；2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽(yáng) 311400）

從杉木種子園中采集 11個(gè)優(yōu)良品種自由授粉家系的分系種子開(kāi)展杉木等位酶與早期生長(zhǎng)性狀間的相關(guān)研究，PAGE等位酶實(shí)驗(yàn)共篩選出 9個(gè)等位酶用于遺傳分析。結(jié)果表明，苗高、地徑在家系間存在顯著差異，研究群體存在豐富的遺傳變異；有5個(gè)等位酶位點(diǎn)（基因型）與苗高生長(zhǎng)顯著相關(guān)，其中X8（MNR-1）和X14（SKDH-1）為正效應(yīng)，其它X2（GOT-2）、X9（MNR-2）和X15（SKDH-2）均為負(fù)效應(yīng)，不同位點(diǎn)對(duì)苗高性狀表達(dá)的作用不等效；有5個(gè)等位酶位點(diǎn)與地徑的生長(zhǎng)顯著相關(guān)，其中除了X15為正效應(yīng)外（純合體有利于地徑的生長(zhǎng)），其它X7（MDH-4）、X12（6PGD-2）、X14（SKDH-1）和X17（Me-2）均為負(fù)效應(yīng)，不同位點(diǎn)對(duì)地徑性狀表達(dá)的作用也不等效；比較地徑和苗高，還發(fā)現(xiàn)SKDH-1和SKDH-2同時(shí)對(duì)地徑苗高有作用，但作用方向相反：SKDH-2純合體BB有利于地徑生長(zhǎng)，SKDH-2雜合體AB有利于苗高的生長(zhǎng)；SKDH-1純合體BB有利于苗高生長(zhǎng)，SKDH-1雜合體AB有利于地徑的生長(zhǎng)。

杉木；等位酶；PAGE；早期鑒定

林木的早期性狀一直倍受育種工作者的重視，因?yàn)閷⑺鼈冇糜谠缙阼b定、早期選擇時(shí)，會(huì)縮短林木的育種周期。Li和Mckeand[1]指出，即使在早晚相關(guān)較弱的情況下，早期選擇也會(huì)節(jié)約時(shí)間和財(cái)力。早期選擇的假設(shè)是假定一組的基因在早期控制某一經(jīng)濟(jì)性狀的表達(dá)，并且在林木生長(zhǎng)發(fā)育（成熟）過(guò)程中繼續(xù)表達(dá)，這構(gòu)成了林木早晚相關(guān)的基礎(chǔ)。由于林木在不同的生長(zhǎng)階段，林木的生長(zhǎng)、發(fā)育和成熟是由多種類(lèi)型的多基因控制的，當(dāng)然也會(huì)有部分基因一直表達(dá)[2]。盡管林木發(fā)育階段多基因調(diào)控的復(fù)雜性，但是早期生長(zhǎng)性狀是后來(lái)生長(zhǎng)、發(fā)育的基礎(chǔ)和表現(xiàn)良好的指示劑[3]。成本和收益分析[4]揭示出，即使早晚相關(guān)低到 0.6，調(diào)整早期選擇的方法進(jìn)行早期選擇比推遲選擇劃算。因?yàn)檫@個(gè)原因，評(píng)價(jià)早期生長(zhǎng)性狀仍然是值得做的工作。因?yàn)榛蛐瓦x擇比表型選擇更可靠，早期選擇的遺傳基礎(chǔ)是等位酶與早期性狀間的相關(guān)。只要這種相關(guān)在統(tǒng)計(jì)上是顯著的，便可用于選擇優(yōu)良的基因型。

近年來(lái)，隨分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記研究生物變異也越來(lái)越廣泛。但相比而言，用同工酶研究林木遺傳變異具有操作簡(jiǎn)單、成本低、共顯性表達(dá)、能間接反映DNA水平的變異等優(yōu)點(diǎn)。等位酶技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用在眾多的用材樹(shù)種的遺傳育種工作中，十分成熟。

通過(guò)利用中性標(biāo)記與影響數(shù)量性狀的基因位點(diǎn)之間的連鎖或相關(guān)關(guān)系，進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇（MAS）的方法，來(lái)改良現(xiàn)有的商業(yè)用材林。MAS能夠在早期淘汰那些不具有生長(zhǎng)潛力的親本或個(gè)體，從而大大地降低了子代測(cè)定的規(guī)模與時(shí)間。本研究采用Bush[5]和Smouse[6]的適應(yīng)距離法來(lái)研究生長(zhǎng)性狀與等位酶間的相關(guān)，目的是為標(biāo)記輔助選擇、育種材料的早期鑒定以及雜交育種親本選配提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 育苗試驗(yàn)

2010年從浙江省遂昌縣杉木（Cunninghamia lanceolata）種子園中采集11個(gè)自由授粉家系的分系種子，它們是龍15、閩33、陽(yáng)11、1391、1419、高37、1366、靖70、麗55、1278、1339，江西紅心杉混種作對(duì)照，共12份品種。于2011年3月，在富陽(yáng)萬(wàn)市展開(kāi)容器育苗，塑料杯高13 cm、直徑14 cm，培養(yǎng)基質(zhì)為稻田土與河沙按3：1的比例進(jìn)行混均，再加3 g/kg復(fù)合肥，每個(gè)培養(yǎng)杯播5粒種子，完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，三個(gè)區(qū)組10株行狀小區(qū)，5月份間苗至每杯1株。整個(gè)試驗(yàn)到12月結(jié)束，進(jìn)行苗高、地徑調(diào)查，采用Matlab7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2 等位酶分析

抽取 11個(gè)優(yōu)良家系進(jìn)行等位酶分析（紅心杉對(duì)照不包括在PAGE實(shí)驗(yàn)中）。PAGE等位酶實(shí)驗(yàn)是用每個(gè)品種10粒種子的胚乳。電泳緩沖體系，染色方法、酶的命名都是沿用國(guó)際著名學(xué)者（如：Yeh FC）淀粉膠電泳的體系，酶的遺傳控制與連鎖的研究結(jié)果亦與他們一致[7～12]。

經(jīng)過(guò)預(yù)備試驗(yàn)，從21個(gè)等位酶系統(tǒng)中，篩選出9個(gè)等位酶，用于遺傳分析，參與分析的這9個(gè)等位酶是6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-PGD E.C.1.1.1.44)、蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH,EC.1.1.1.37）、蘋(píng)果酸酶（ME, E.C.1.1.1.40）、α-淀粉酶（α-Amylase, E.C.3.2.1.1）、甲酸脫氫酶（FDH, E.C.1.2.1.2）、莽草酸脫氫酶（SKDH, E.C.1.1.1.26）、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（Got, E.C.2.6.1.1）、維生素K3降解酶（Mnr, E.C.1.6.99.2）、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（PGI E.C.5.3.1.9），共9個(gè)酶系統(tǒng)21位點(diǎn)，18個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)2個(gè)基因。所有這些酶系統(tǒng)顯示出孟德?tīng)柗绞竭z傳和共顯性表達(dá)，并且到現(xiàn)在為止，在杉木中尚未發(fā)現(xiàn)這些酶位點(diǎn)形成緊密連鎖群。

1.3 回歸分析

在回歸分析前，我們假定[13～17]：①11個(gè)自由授粉的家系采自多系種子園，種子園花粉隨機(jī)授粉，同一家系的種子間是半同胞關(guān)系（因此家系平均值即為一般配合力）；②等位酶標(biāo)記在等位基因間是共顯性；③在不同的位點(diǎn)間等位酶標(biāo)記間不存在上位效應(yīng)；④等位酶不同位點(diǎn)間簡(jiǎn)單而穩(wěn)定的遺傳，不存在連鎖；⑤遺傳符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律；⑥數(shù)量性狀是由多基因控制的；⑦與某個(gè)數(shù)量性狀相關(guān)的等位酶基因位于相同或不同的染色體上。

基于以上假設(shè)，采用如下模型（表 1）進(jìn)行相關(guān)性研究。一個(gè)位點(diǎn)兩個(gè)基因A和B，對(duì)應(yīng)基因頻率分別是p和q，群體近交比率s = 0.1[18]。

以親本苗高和地徑平均值為變量，等位酶位點(diǎn)上的基因型值為自變量，采用DPS軟件進(jìn)行回歸分析，以研究等位酶與數(shù)量性狀間的相關(guān)，分析結(jié)果如下。

表1 使用遺傳變量來(lái)預(yù)測(cè)基因型的適合度[9]Table 1 Fitness for predicting genotypes by genetic variables

以親本苗高和地徑平均值為變量，等位酶位點(diǎn)上的基因型值為自變量，采用DPS軟件進(jìn)行回歸分析，以研究等位酶與數(shù)量性狀間的相關(guān)，分析結(jié)果如下。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗高地徑的差異性分析

育苗基質(zhì)等環(huán)境條件一致，可采用單因素組內(nèi)觀察數(shù)不等的模型，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 12個(gè)杉木品種一年生時(shí)苗高、地徑方差分析結(jié)果Table 2 ANOVA on 1-year seedling height and ground diameter of 12 C. lanceolata families

由表2可見(jiàn)，苗高、地徑在家系間存在顯著差異，研究群體存在豐富的遺傳變異。苗高、地徑在家系水平上的遺傳力分別為0.607 5和0.792 9。

2.2 等位酶對(duì)苗高的回歸分析結(jié)果

苗高經(jīng)方差分析，獲得親本的一般配合力，以此為因變量 Z，以不同位點(diǎn)的基因型為自變量，多元回歸結(jié)果如下：

式中，X2為GOT-2上的基因型，X8為MNR-1上的基因型，X9為MNR-2上的基因型，X14為SKDH-1上的基因型，X15為SKDH-2上的基因型，Z是親本的苗高的一般配合力。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3可見(jiàn)，(1)式的F值= 2 332.738 6***，所求回歸函數(shù)極其顯著。

（1）式的決定系數(shù)R2= 0.999 9，復(fù)相關(guān)系數(shù)R = 0.999 99***的顯著性，達(dá)到1‰的統(tǒng)計(jì)水平。

綜合以上結(jié)果，可以得出如下結(jié)論，（1）式所求回歸函數(shù)十分有效。入選變量的分析結(jié)果列于表4。

表4 入選變量的回歸信息Table 4 Regression of selected variables

由表4可見(jiàn)，逐步回歸函數(shù)中的自變量（等位酶基因型）與苗高間有顯著的相關(guān)；不同酶位點(diǎn)對(duì)苗高生長(zhǎng)的表達(dá)不等效，其影響力的順序?yàn)椋篨9> X2> X8> X14> X15。

2.3 等位酶對(duì)地徑的回歸分析結(jié)果

以地徑Y(jié)為因變量，以不同位點(diǎn)的基因型為自變量，逐步回歸函數(shù)如下：Y = 3.910 97-0.396 229X7-0.040 962 X12-0.228 84X14＋0.039 946 X15-0.02 633 7X17（2）

式中，X7為MDH-4上的基因型，X12為6PGD-2上的基因型，X14為SKDH-1上的基因型，X15為SKDH-2上的基因型，X17為Me-2上的基因型，Z是親本的地徑的一般配合力。

由表5可見(jiàn)，（2）式的F值 = 53 046.068***，所求回歸函數(shù)極其顯著，（2）式的決定系數(shù)R2=0.999 9，復(fù)相關(guān)系數(shù)R = 0.999 99***的顯著性，達(dá)到1‰的統(tǒng)計(jì)水平。

綜合以上結(jié)果，可以得出如下結(jié)論，（2）式所求回歸函數(shù)十分有效。入選變量的分析結(jié)果列于表6。

表5 方差分析結(jié)果Table 5 Result of ANOVA

表6 入選變量的回歸信息Table 6 Regression of selected variables

由表6 可見(jiàn)，（1）逐步回歸函數(shù)中的自變量（等位酶基因型）與地徑間有顯著的相關(guān)；（2）不同酶位點(diǎn)對(duì)地徑生長(zhǎng)的表達(dá)不等效，其影響力的順序?yàn)椋篨7> X14> X15> X17> X12，這一研究結(jié)果與苗高一致。

3 結(jié)論與建議

通過(guò)逐步回歸分析揭示出，有5個(gè)等位酶位點(diǎn)（基因型）與杉木的苗高生長(zhǎng)顯著相關(guān)，其中X8（MNR-1）和X14（SKDH-1）為正效應(yīng)（純合體有利于苗高的生長(zhǎng)），其它X2（GOT-2）、X9（MNR-2）和X15（SKDH-2）均為負(fù)效應(yīng)，即在這些位點(diǎn)上，雜合體有利于苗高的生長(zhǎng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同位點(diǎn)對(duì)苗高性狀表達(dá)的作用不等效。

通過(guò)等位酶分析和逐步回歸分析，發(fā)現(xiàn)亦有5個(gè)等位酶位點(diǎn)（基因型）與地徑的生長(zhǎng)顯著相關(guān)，其中除了X15（SKDH-2）為正效應(yīng)外（純合體有利于地徑的生長(zhǎng)），其它X7（MDH-4）、X12（6PGD-2）、X14（SKDH-1）和X17（Me-2）均為負(fù)效應(yīng)，即在這些位點(diǎn)上，雜合體有利于地徑的生長(zhǎng)。與苗高一樣，不同位點(diǎn)對(duì)地徑性狀表達(dá)的作用不等效。

比較地徑和苗高的分析結(jié)果，還發(fā)現(xiàn)SKDH-1和SKDH-2同時(shí)對(duì)地徑苗高有作用，但作用方向相反：SKDH-2純合體BB有利于地徑生長(zhǎng)，SKDH-2雜合體AB有利于苗高的生長(zhǎng)；SKDH-1純合體BB有利于苗高生長(zhǎng)，SKDH-1雜合體AB有利于地徑的生長(zhǎng)。有相同的等位酶作用于苗高、地徑的生長(zhǎng)，很可能是苗高地徑間存在相關(guān)的一個(gè)原因。

已有的研究表明：同工酶具有組織多型性和組織特異性。Second 和tronslot以及Second發(fā)表了他們?cè)谒局醒芯康慕Y(jié)果：多數(shù)的等位酶會(huì)在多個(gè)器官中表達(dá)，只是酶的活力和酶譜式樣存在變化。針對(duì)這一現(xiàn)象，在杉木遺傳改良中如何運(yùn)用本研究的成果呢？首先要選擇相同研究材料，如發(fā)芽種子胚乳；其次要采用相同的實(shí)驗(yàn)條件，尤其是相同的電泳緩沖體系（注：電極緩沖體系決定了等位酶酶譜式樣），那么等位酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的、可重復(fù)的。本研究揭示：有6個(gè)等位酶的信息，就可以對(duì)杉木種子園中的待測(cè)親本進(jìn)行初步評(píng)選。但本研究有幾個(gè)問(wèn)題：在該模型中其一就是BB純合體總比AA優(yōu)越，這是模型造成的，所有的學(xué)者都這么用這個(gè)適合度模型；其二，由于本試驗(yàn)參試家系較少，苗木數(shù)較少，未能進(jìn)行多點(diǎn)造林試驗(yàn)，生長(zhǎng)量?jī)H一年生苗高、地徑，所以本研究?jī)H是一種探索，研究結(jié)果作為未來(lái)研究的一種參考；其三，今后要進(jìn)行擴(kuò)大試驗(yàn)，采用多地點(diǎn)多年度的資料來(lái)詳細(xì)研究等位酶與經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)。

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Correlation between Allozyme and Early Growth Traits in Cunninghamia lanceolata

WENG Chun-mei1，QI Ming2*，WANG Hai-rong1，HUA Chao-hui1，BAO Xiao-mei
（1. Suichang Forestry Extension Station of Zhejiang, Suichang 323300, China; 2. Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang, 311400, China）

11 plus families were selected in 2010 from Cunninghamia lanceolata seed orchard in Suichang, Zhejiang province, for container seedling cultivation with one control in March, 2011 in Fuyang of the same province. Determinations of height and ground diameter were implemented in December of the same year. 9 allozymes were selected by polyacrylamid gel electrophoresis method using 10 embryosperms of 11 tested families. Adaptive distance model by Smouse(1986)and Bush (1987) was used, regression models between growth traits and allozyme genotypes had been established. The results showed that seedling height and ground diameter had great differences among families, five allozyme loci had evident correlation with seedling height growth and 5 ones hade significant correlation with ground diameter. The experiment proved that different allozyme loci had different marginal effects on fitness. The result demonstrated that allozyme analysis could be used for the early selection of parents in seed orchard of C. lanceolata.

Cunninghamia lanceolata; allozyme; PAGE; early selection

S718.46

：A

1001-3776（2015）06-0045-05

2015-07-05；

2015-10-25

浙江省”十二五”竹木育種專(zhuān)題“杉木高生產(chǎn)力優(yōu)質(zhì)新品種選育及示范”（2012C12908-11）

翁春媚（1965-），女，浙江遂昌人，從事林木遺傳育種研究；*通訊作者。