云南芒果中酵母菌分離鑒定及在芒果酒發(fā)酵中的應(yīng)用

岑 濤，岳田利*，袁亞宏，丁 旭，王虎玄，宋 靚

云南芒果中酵母菌分離鑒定及在芒果酒發(fā)酵中的應(yīng)用

岑 濤，岳田利*，袁亞宏，丁 旭，王虎玄，宋 靚

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

本實(shí)驗(yàn)以從云南省采集的4個(gè)品種的芒果果皮作為分離源，經(jīng)分離、純化及三級(jí)篩選得到6株在芒果汁基質(zhì)中具有良好發(fā)酵力的酵母菌。利用WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)所篩得酵母菌進(jìn)行初步分類，結(jié)合26S rDN A測(cè)序鑒定，除1株為Hanseniaspora opuntiae，另外5株均為Wickerhamomyces anomalus。其中DTM9（W. anomalu）和DKT11（H. opuntiae）發(fā)酵芒果酒的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析結(jié)果表明，與芒果清汁相比，DTM9發(fā)酵的芒果酒中，酯類物質(zhì)含量增加了51.63%，種類增加了400%；醇類物質(zhì)含量增加28.37%，種類增加了27.27%；DKT11發(fā)酵的芒果酒中酯類物質(zhì)含量增加了44.27%，種類增加了433%；醇類物質(zhì)含量增加了34.17%。綜合比較理化指標(biāo)和感官分析結(jié)果，DTM9具有更高的糖利用率，且發(fā)酵的芒果酒感官品質(zhì)更優(yōu)良，對(duì)提高芒果酒的香氣質(zhì)量有重要意義。

芒果；酵母菌；分離鑒定；26S rDNA；揮發(fā)性成分

芒果被世界衛(wèi)生組織稱為十大最佳水果之一[1]。由于其含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，受到人們的廣泛喜愛，在世界80多個(gè)國(guó)家地區(qū)生產(chǎn)[2-3]。在我國(guó)，僅2011年芒果產(chǎn)量就達(dá)到100.34萬t，總產(chǎn)值達(dá)38.9億元[4]。然而，我國(guó)芒果的銷售主要集中在中、低檔市場(chǎng)，以鮮食為主[5]，并且在采摘、運(yùn)輸與貯藏過程中極易因機(jī)械損傷和微生物浸染等造成其腐爛變質(zhì)，影響其品質(zhì)，極大地限制了芒果的流通性[6]。另外，在芒果的主產(chǎn)區(qū)，隨著芒果種植面積的不斷擴(kuò)大，種植區(qū)域無法消耗大量的鮮芒果，導(dǎo)致大量的芒果腐爛變質(zhì)而被廢棄，不僅造成了資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染，同時(shí)給廣大果農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7-9]。由于芒果中可溶性固形物含量為16%～20%，含糖量高達(dá)17%～20%，適合進(jìn)行果酒發(fā)酵[10-12]，因此，改善日益嚴(yán)重的芒果資源浪費(fèi)現(xiàn)狀的途徑之一就是利用成熟的果酒釀造技術(shù)進(jìn)行芒果酒發(fā)酵，提高芒果的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和利用率，維護(hù)果農(nóng)利益，促進(jìn)芒果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。國(guó)內(nèi)關(guān)于芒果酒釀造的報(bào)道都是利用商業(yè)酵母作為發(fā)酵菌株，而利用來源于芒果的酵母菌進(jìn)行芒果酒釀造還未見報(bào)道。

本研究以芒果的果皮作為分離源進(jìn)行酵母菌的分離與純化，經(jīng)過三級(jí)篩選得到適合釀造芒果酒的酵母。通過WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)菌株的形態(tài)進(jìn)行觀察及初步分類，結(jié)合26S rDNA測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建對(duì)篩選菌株進(jìn)行種屬鑒定。然后，分別將其用于芒果酒發(fā)酵，通過對(duì)不同菌株發(fā)酵的芒果酒香氣分析與感官評(píng)定篩選出性能優(yōu)良的菌株并對(duì)其產(chǎn)香特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1材料與培養(yǎng)基

于2013年7—9月從云南省麗江市華坪縣采摘成熟度良好的凱特、熱農(nóng)、海頓、湯米4個(gè)品種的芒果，裝入無菌袋中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室20℃控溫保藏一周后熟。

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L（固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g/L）。2,3,5-氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）培養(yǎng)基[13]：由上層培養(yǎng)基與下層培養(yǎng)基組成。其中TTC上層培養(yǎng)基：TTC 0.5 g/L、葡萄糖5 g/L、瓊脂15 g/L、現(xiàn)配現(xiàn)用；TTC下層培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏1.5 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、硫酸鎂0.4 g/L、檸檬酸0.3 g/L、瓊脂30 g/L。芒果汁培養(yǎng)基：以芒果為原料制備的清汁，糖度為16 °Brix，100℃滅菌30 min。

1.2儀器與設(shè)備

DPX-9002B-1恒溫培養(yǎng)箱上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；pHS-3C酸度計(jì)上海虹益儀器廠；WYT阿貝折光儀泉州中友光學(xué)儀器有限公司；JA2003電子天平上海精密科學(xué)儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；PTC0200聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)Bio-Rad公司；Trace DSQ相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)熱電公司。

1.3方法

1.3.1酵母菌的分離與純化

在無菌條件下，分別取后熟完全的4個(gè)不同品種芒果果皮各10 g至盛有90 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)2～3 d。取1 mL培養(yǎng)液至9 mL無菌生理鹽水中搖勻，依次梯度稀釋，分別取合適梯度稀釋培養(yǎng)液100μL涂布于添加0.5%硫酸鏈霉素的YPD培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)2～4 d。挑取具有典型酵母菌落特征的單菌落進(jìn)行多次平板劃線，直至完全純化。將純化后的酵母菌種轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2～4 d后，置于4℃冰箱保存。

1.3.2酵母菌的篩選

1.3.2.1酵母菌的初篩

將分離純化的菌株活化后以6%的接種量接入YPD液體培養(yǎng)基中，于28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)2 d。由8位有品評(píng)經(jīng)驗(yàn)的品評(píng)員（男性4名，女性4名）組成的感官評(píng)定小組對(duì)各菌株發(fā)酵液的氣味效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，淘汰發(fā)酵液氣味不愉悅和明顯異于正常釀酒酵母發(fā)酵液氣味（有明顯的酸味、臭味、刺鼻性氣味）的發(fā)酵菌株。

1.3.2.2酵母菌的三級(jí)篩選

一級(jí)篩選為利用TTC顯色法對(duì)初篩所得酵母菌株的產(chǎn)酒精能力進(jìn)行測(cè)定[14]。挑取紅色菌落進(jìn)入二級(jí)篩選。

二級(jí)篩選為利用杜氏管法通過觀察并記錄杜氏小管內(nèi)菌株的產(chǎn)氣量對(duì)酵母菌株的起酵速度與發(fā)酵能力進(jìn)行篩分。將一級(jí)篩選得到的菌株進(jìn)行活化，以10%的接種量接入附有杜氏小管的芒果汁培養(yǎng)基中，在28℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)2 d。每隔12 h觀察并記錄杜氏小管內(nèi)的氣體高度。選取起酵速度快且發(fā)酵能力強(qiáng)的菌株進(jìn)入三級(jí)篩選[15]。

三級(jí)篩選為利用杜氏管對(duì)酵母菌株在特定酒精度、糖度、SO2質(zhì)量濃度芒果汁中的耐受性進(jìn)行篩分。將自然糖度為16 °Brix的芒果汁培養(yǎng)基分別進(jìn)行如下處理：1）加入無水乙醇使芒果汁中無水乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為5%、8%、10%；2）加入偏重亞硫酸氫鉀使芒果汁中SO2質(zhì)量濃度為100 mg/L；3）加入蔗糖使芒果汁中糖度為20 °Brix。將二級(jí)篩選得到的菌株進(jìn)行活化后以10%的接種量分別接入上述處理的芒果汁培養(yǎng)基中，以未做處理的16 °Brix芒果汁培養(yǎng)基為對(duì)照，于28℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)2 d。每隔2 h觀察并記錄杜氏小管內(nèi)的氣體高度。挑選對(duì)乙醇、糖、SO2耐受性好的菌株作為入選菌株。

1.3.3菌落形態(tài)初分[16]

將篩選得到的菌株接入YPD液體培養(yǎng)基中，28℃搖床活化24 h后，劃線轉(zhuǎn)接于WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。28℃恒溫培養(yǎng)數(shù)天，觀察記錄各個(gè)菌落的形態(tài)與顏色。根據(jù)平板內(nèi)菌落的形態(tài)和顏色對(duì)所得菌株進(jìn)行形態(tài)初分。

1.3.4篩選菌株的分子生物學(xué)鑒定

采用26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析對(duì)三級(jí)篩選得到的酵母菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定[17]。

1.3.4.1測(cè)序菌株的DNA提取

采用OMEGA公司的E.Z.N.A.酵母DNA提取試劑盒，按其說明書方法進(jìn)行測(cè)序菌株的DNA提取。

1.3.4.2菌株26S rDNA D1/D2區(qū)域的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增引物為：通用引物NL1（5’-GCATATCAAT AAGCGGAGGAAAAG-3’）與NL4（5’-GGTCCGTG TTTCAAGACGG-3’）。

PCR反應(yīng)體系（50μL）：DNA模板2μL，引物（NL-1/NL-2）各1μL，Premix Taq酶25μL，二甲基亞砜2.5μL，滅菌超純水18.5μL。

PCR循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min；52℃退火1 min；72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.3.4.3 DNA測(cè)序

用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳確定PCR產(chǎn)物，將PCR所得產(chǎn)物送至北京華大基因科技股份有限公司測(cè)序。26S rDNA D1/D2區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序引物為NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）。

1.3.5 26S rDNA序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測(cè)序所得26S rDNA片段的基因序列與GenBank在線數(shù)據(jù)庫(kù)中區(qū)域序列進(jìn)行BLASET比對(duì)，并利用Mega 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

1.3.6芒果酒的發(fā)酵和果酒感官及香氣成分分析

芒果酒加工工藝：芒果打漿→0.14%果膠酶，40℃水浴3 h→ 4 000×g離心5 min→芒果清汁調(diào)糖→28℃主發(fā)酵7 d→后發(fā)酵和陳釀→低溫放置→芒果酒[19]。

感官評(píng)定采用百分制法，感官評(píng)定小組由有品評(píng)經(jīng)驗(yàn)的品評(píng)員共17人（男性9名，女性8名）組成，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[20]與GB/T 10220—2012《感觀分析方法學(xué)總論》[21]相關(guān)內(nèi)容，進(jìn)行獨(dú)立品評(píng)，分別從色澤（10分）、透明度（10分）、香氣（30分）、滋味（30分）、典型性（20分）5個(gè)方向評(píng)分。酒樣的評(píng)定分?jǐn)?shù)為各感官評(píng)定人員的各項(xiàng)評(píng)分均值之和，并以芒果清汁作為對(duì)照。同時(shí)，根據(jù)GB/T 15038—2006對(duì)芒果酒基本理化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）進(jìn)行芒果酒香氣成分的分析[22]。

色譜條件：色譜柱為DB-Wax彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.52 mm，1μm），程序升溫40℃，保持2.5 min，以6℃/min升溫至230℃，保持7 min；進(jìn)樣口溫度250℃，傳輸線溫度230℃，載氣為He，流速1.0 nL/min，采用不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電離方式EI，70 eV；離子源溫度200℃，質(zhì)量掃描范圍為35～400 amu；發(fā)射電流100μA，檢測(cè)電壓1.4 kV。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

GC-MS測(cè)定出的總離子流圖譜利用隨機(jī)Xcalibur工作站NIST2008標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，同時(shí)與NIST Library和Wiley Library相匹配，僅當(dāng)匹配度和純度大于800的結(jié)果才進(jìn)行報(bào)道。以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，按峰面積歸一化法計(jì)算各組分相對(duì)含量[23]。本研究中每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1酵母菌的分離與純化結(jié)果

從芒果果皮中分離得到具有典型酵母菌落特征的菌株共60株。對(duì)菌株進(jìn)行編號(hào)，其中凱特芒果中分離得到13株，分別編號(hào)為DKT1～DKT13；熱農(nóng)芒果中分離得到18株，分別編號(hào)為DRN1～DRN18；海頓芒果中分離得到15株，分別編號(hào)為DHD1～DHD15；湯米芒果中分離得到14株，分別編號(hào)為DTM1～DTM14。

2.2酵母菌的篩選結(jié)果與分析

2.2.1初篩結(jié)果

通過初篩，排除發(fā)酵液氣味明顯異于正常釀酒酵母發(fā)酵液氣味的22株酵母菌，保留38株菌株。通過TTC顯色反應(yīng)篩選出18株菌落顏色為紅色或深紅色的菌株。部分菌株的顯色分類結(jié)果見圖1。

圖1 酵母菌株在TTC培養(yǎng)基中的顯色結(jié)果Fig.1 Yeast strains cultured in TTC chromogenic medium

2.2.2酵母菌的二級(jí)篩選結(jié)果

將18株初篩得到的菌株在附有杜氏小管的芒果汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察產(chǎn)氣情況，結(jié)果見表1。發(fā)酵12 h后，有3株菌株沒有明顯的產(chǎn)氣情況，分別為DTM3、DRN9及DRN12，而DTM9的產(chǎn)氣量為杜氏小管體積的1/2，DTM1、DTM2的產(chǎn)氣量已達(dá)到杜氏小管體積的3/4，其余菌株也均已開始產(chǎn)氣。24 h后，有11株菌株的產(chǎn)氣量充滿或近似充滿杜氏小管；48 h后，共有13株菌株的產(chǎn)氣量完全充滿杜氏小管。篩除12 h還未開始明顯發(fā)酵以及48 h后產(chǎn)氣還未充滿杜氏小管的酵母菌株共5株，得到13株菌株進(jìn)行后續(xù)篩選。

表1 酵母菌株在芒果汁培養(yǎng)基中的產(chǎn)氣情況Table 1 Gas production situation of yeast strains in mango juice medium

2.2.3酵母菌的三級(jí)篩選結(jié)果

表2 不同條件下酵母菌株的起酵時(shí)間Table 2 Fermentation starting time of yeast strains in different conditions

菌株在不同條件芒果汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)的起酵時(shí)間如表2所示，培養(yǎng)48 h后的產(chǎn)氣情況如表3所示。由表2可知，與對(duì)照組相比，100 mg/L的SO2質(zhì)量濃度條件下，除DKT11、DTM1、DTM7、DHD14這4株菌株的起酵時(shí)間不變外，其余菌株的起酵時(shí)間均推遲2 h或4 h；在20 °Brix的糖度條件下，有4株菌株起酵時(shí)間推遲了2 h，DRN10菌株推遲了4 h，DTM7菌株推遲了8 h，其余菌株沒變化。酒精度變化使大部分菌株起酵時(shí)間受到影響，尤其在酒精度10%條件下，所有菌株的起酵時(shí)間均受到了影響，DTM7、DKT6、DKT8、DKT11菌株的起酵時(shí)間推遲12 h以上，而DTM1、DRN10、DKT7不能耐受8%以上酒精含量。

表3 不同條件下酵母菌株的產(chǎn)氣情況Table 3 Gas production situation of yeast strains in different conditions

由表3可知，與對(duì)照組相比，20 °Brix糖度和100 mg/L SO2質(zhì)量濃度條件下，各菌株產(chǎn)氣量未受影響或受到的影響不大。而5%酒精度條件下，DHD6、DHD14、DRN10、DKT7、DKT8只有微弱的產(chǎn)氣現(xiàn)象。酒精度8%與10%條件下，大部分菌株的產(chǎn)氣受到明顯的抑制。

綜合起酵時(shí)間與產(chǎn)氣量結(jié)果考慮，各菌株在不同條件下的耐受性差別較大。隨著酒精度的增加，各菌株的起酵時(shí)間與產(chǎn)氣量均受到了很大的影響。對(duì)20 °Brix糖度耐受性較差的菌株為DTM7，對(duì)100 mg/L SO2耐受性較差的菌株為DHD14，對(duì)5%酒精度耐受性較差的菌株為DTM7、DKT8、DHD6、DHD14、DRN10、DKT7，對(duì)8%酒精度耐受性較差的菌株為DTM7、DRN10、DKT8、DTM1、DKT7。絕大部分菌株不能耐受10%酒精度。綜合考慮，通過三級(jí)篩優(yōu)選的菌株為DHD8、DRN6、DTM2、DTM9、DKT6與DKT11共6株菌株。

2.3酵母菌株菌落形態(tài)

表4 WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基鑒別結(jié)果Table 4 Identification of yeasts in WL culture medium

對(duì)篩選所得6株酵母菌株進(jìn)行WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，所得結(jié)果如表4所示。通過菌落形態(tài)和顏色觀察，初步判定DRN6、DKT6、DHD8這3株菌親緣關(guān)系較近，菌株DTM2和DTM9的親緣關(guān)系較近。而DKT11菌株的菌落形態(tài)及顏色與其余5株菌株完全不同，判斷其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 26S rDNA序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的建立

利用BLAST工具，將所篩選菌株測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知標(biāo)準(zhǔn)菌株的26S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見表5。運(yùn)用Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。結(jié)果表明，菌株DKT11與H. opuntiae的親緣關(guān)系最近（100%）。其余菌株與W. anomalus的親緣關(guān)系最近（99%）。確定菌株DKT11是H. opuntiae，其余菌株均為W. anomalus。

表5 分離菌株與GenBank參考菌株的比對(duì)結(jié)果Table 5 Similarity of isolates with the reference strains from GenBank

圖2 芒果果皮酵母分離株26S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenic tree based on the 26S rDNA sequences of yeasts from mango peel

2.5芒果酒釀造

由各菌株26S rDNA序列測(cè)序結(jié)果可知，DHD8、DRN6、DTM2、DKT6、DTM9親緣關(guān)系一致，都屬于W. anomalus，而DKT11為H. opuntiae。因此，從5株W. anomalus中隨機(jī)挑選DTM9菌株與漢遜酵母DKT11菌株作為出發(fā)菌株釀造芒果酒。分別測(cè)得兩株菌株發(fā)酵芒果酒的各項(xiàng)理化指標(biāo)及感官得分，結(jié)果如表6所示。并進(jìn)一步通過GC-MS對(duì)芒果原汁及DTM9、DKT11菌株所釀造的芒果酒中揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行檢測(cè)?？傠x子流譜圖分別如圖3～5所示。按照1.4節(jié)數(shù)據(jù)分析方法得出3種樣液中各揮發(fā)性香氣成分的相對(duì)含量，其中主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量的比較結(jié)果如表7所示。

表6 芒果酒的理化指標(biāo)及感官評(píng)分結(jié)果Table 6 Chemical and sensory analysis of mango wine

由表6可知，兩種芒果酒樣中可溶性固形物及總糖含量與芒果原汁相比均有明顯的減少，說明DKT11和DTM9酵母都適合利用芒果汁進(jìn)行發(fā)酵，DTM9發(fā)酵的芒果酒樣酒精度為4.5%左右，但是DTM9菌株具有更高的糖利用率，并且感官評(píng)分更高，說明DTM9菌株釀造的芒果酒具有更好的風(fēng)味與口感。

圖3 芒果原汁SPME-GC-MS總離子流圖Fig.3 SPME-GC-MS total ion current of aroma components in mango juice

圖4 DKT11芒果酒SPME-GC-MS總離子流圖Fig.4 SPME-GC-MS total ion current chromatogram of aroma components in mango wine fermented by DKT11

圖5 DTM9芒果酒SPME-GC-MS總離子流圖Fig.5 SPME-GC-MS total ion current chromatogram of aroma components in mango wine fermented by DTM9

表7 各樣液中主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量的比較Table 7 Major volatile compounds of mango wine

果酒中對(duì)香味貢獻(xiàn)最大的成分是醇類物質(zhì)、酯類物質(zhì)以及酸類物質(zhì)[24]，根據(jù)GC-MS檢測(cè)結(jié)果，從芒果酒發(fā)酵前后主要揮發(fā)性香氣成分種類及含量的變化（表7）可知，相較于發(fā)酵前，兩種不同種酵母發(fā)酵后的芒果酒中，酯類物質(zhì)、醇類物質(zhì)的種類及含量都有很大提高。其中DTM9酵母釀造的芒果酒中酯類物質(zhì)從3種增加到15種，種類增加了400%，含量增加了51.63%；醇類物質(zhì)含量增加了28.37%，種類增加了27.27%。DKT11酵母釀造的芒果酒酯類物質(zhì)含量增加了44.27%，種類增加了433%；醇類物質(zhì)含量增加了34.17%。此外，DTM9菌株發(fā)酵芒果酒香味成分中的桃金娘烯醇、金合歡醇、香葉醇賦予了芒果酒獨(dú)特的風(fēng)味和口感[25]。結(jié)合兩種酵母發(fā)酵芒果汁的理化指標(biāo)及感官評(píng)價(jià)可知，DTM9菌株有望開發(fā)成適合釀造低醇芒果甜酒的新型專用酵母。

3 結(jié) 論

從芒果果皮中共分離得到6株適合芒果汁發(fā)酵的酵母菌，通過26S rDNA序列的同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，確定其中1株為H. opuntiae，其余5株均為W. anomalus。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于芒果酒釀造的報(bào)道主要集中于工藝的研究[6-7]，而以芒果為分離源得到適合釀造芒果酒的本土酵母的研究還未見報(bào)道。本研究以芒果作為來源分離酵母菌株，并將其應(yīng)用于芒果酒發(fā)酵，得到口感及風(fēng)味良好的低醇果酒。

利用分離得到的DTM9（W. anomalu）和DKT11（H. opuntiae）進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵液的理化指標(biāo)、感官品質(zhì)及GC-MS的檢測(cè)結(jié)果表明，DTM9發(fā)酵的芒果酒中酯類物質(zhì)含量增加了51.63%，種類增加了400%；醇類物質(zhì)含量增加了28.37%，種類增加了27.27%。DKT11發(fā)酵的芒果酒中酯類物質(zhì)含量增加了44.27%，種類增加了433%；醇類物質(zhì)含量增加了34.17%。相較之下，DTM9比DKT11具有更高的糖利用率，且發(fā)酵所得芒果酒感官品質(zhì)更優(yōu)良。

本實(shí)驗(yàn)篩選所得酵母菌的糖利用率雖略低于普通釀酒酵母，但發(fā)酵所得芒果酒的香氣成分豐富，感官品質(zhì)優(yōu)良，有望開發(fā)成為低醇甜型芒果酒發(fā)酵的新型專用酵母。此外，也為與釀酒酵母混菌發(fā)酵獲得醇、香兼?zhèn)涞拿⒐铺峁┝死碚撘罁?jù)，為芒果酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了新的思路。

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Isolation and Identification of Yeasts in Mango from Yunnan and Their Application in Mango Wine Fermentation

CEN Tao, YUE Tianli*, YUAN Yahong, DING Xu, WANG Huxuan, SONG Jing
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

This experiment collected the peels of 4 mango varieties from Yunnan province of China as sources of yeasts. After separation, purificationand tertiary screening, 6 yeasts suitable for mango juice fermentation were obtained. The phylogenetic tree based on 26S rDNA sequence analysis was constructed for determining the genetic location. The isolate DKT11 was identified asHanseniaspora opuntiae, whereas 5 other isolates were identified asWickerhamomyces anomalus. DKT11 and DTM9 were subjected to further analysis. Physicochemical indexes and sensory evaluation showed that the two strains had good fermentation performance in mango juice to produce high-quality mango wines. The volatile aroma composition of the mango wines was analyzed by GC-MS. The results showed that the kinds and amounts of volatile aroma compounds in the wines were significantly improved when compared with those in mango juice. Specifically, the numbers of ester and alcohols in the wine fermented by DTM9 were increased by 400%and 27.27%, respectively, and the amounts of the two groups of compounds were elevated by 51.63%and 28.37%, respectively. The amount of ester and alcohols in the wine fermented by DKT11 was increased by 44.27%and 34.17%, respectively, and the number of esters was raised by 433%. Overall, these findings showed DTM9 had a higher sugar utilization rate and yielded a mango wine with better sensory quality, emphasizing its significance for improving the aroma quality of mango wine.

mango; yeast; isolation and identification; 26S rDNA; volatile compounds

TS261. 1

1002-6630（2015）11-0119-06

10.7506/spkx1002-6630-201511023

2014-08-14

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD31B01）

岑濤（1989—），女，碩士研究生，主要從事發(fā)酵工程研究。E-mail：centv1215@163.com

*通信作者：岳田利（1965—），男，教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)及食品安全控制研究。E-mail：yuetl@nwsuaf.edu.cn