蕎麥黃酮和蕎麥糖醇對胰脂肪酶的抑制作用

楊 鵬，李艷琴*

蕎麥黃酮和蕎麥糖醇對胰脂肪酶的抑制作用

楊 鵬，李艷琴*

（山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006）

目的：了解蕎麥麩皮中活性成分抑制胰脂肪酶的活性。方法：以苦蕎麩皮醇提物（主要成分為蘆?。?、醇提殘?jiān)馕铮ㄖ饕煞譃樘J丁、槲皮素和異槲皮素的混合物）和甜蕎麩皮水提物（主要成分為蕎麥糖醇）為實(shí)驗(yàn)材料，測定3 個(gè)樣品對胰脂肪酶的抑制作用，以市售胰脂肪酶抑制劑——奧利司他為參照；通過研究底物、抑制劑和酶的加入順序?qū)σ种坡实挠绊?，初步確定醇 提水解物的抑制機(jī)理。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)材料對胰脂肪酶的抑制作用依次為奧利司他＞醇提水解物＞醇提物＞水提物，半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為0.47、1.94、2.53、17.6 mg/mL；醇提水解物的抑制作用機(jī)理主要是通過苦蕎黃酮與底物相互作用，從而阻礙了底物與酶的作用，屬于競爭性抑制。結(jié)論：蕎麥黃酮（即醇提物和醇提水解物）對胰脂肪酶有抑制活性；醇提殘?jiān)?jīng)高壓水解后更有利于其對胰脂肪酶的抑制作用；蕎麥糖醇（即水提物）在低質(zhì)量濃度下抑制效果不明顯，在較高的質(zhì)量濃度下則表現(xiàn)出抑制活性。

蕎麥黃酮；蕎麥糖醇；蘆??；槲皮素；異槲皮素；胰脂肪酶；抑制劑

蕎麥?zhǔn)寝た疲≒olygobaceae）蕎麥屬的藥食同源作物，有兩個(gè)栽培種：苦蕎（Fagopyrum tataricum）和甜蕎（Fagopyrum esculentum），其中苦蕎麩皮中黃酮含量高達(dá)7%以上[1]?？嗍w黃酮能促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，具有降血脂、降血糖、抗腫瘤和減緩便秘等多種藥理活性[2-5]。蕎麥糖醇大量富集在甜蕎的胚胎和糊粉層，它們在腸道末端被細(xì)菌消化，釋放出D-手性肌醇，能有效地降低血糖、血甘油三酯水平[6-9]。

胰脂肪酶是由胰腺分泌并對人體內(nèi)甘油三酯消化吸收過程起關(guān)鍵作用的酶[10]。利用脂肪酶抑制劑可有效抑制腸道中脂肪酶的活性，從而減少進(jìn)入體內(nèi)的脂肪代謝，是治療肥胖的有效策略[11-12]。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道了大黃柳葉、荷葉等植物的黃酮抽提物具有降脂的功效[13-14]，但是關(guān)于蕎麥黃酮、蕎麥糖醇對胰脂肪酶的作用還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以苦蕎麩皮醇提物和甜蕎麩皮水提物為材料，研究了蕎麥黃酮（醇提物）和蕎麥糖醇（水提物）對胰脂肪酶的抑制能力，并與奧利司他進(jìn)行比較，篩選出對胰脂肪酶抑制作用較高的成分，以期為充分利用蕎麥麩皮、合理開發(fā)蕎麥降脂功能食品提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

蕎麥麩皮提取物由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供[15]?？嗍w麩皮醇提物的主要成分：總黃酮含量為74.0%，其中86.5%是蘆丁，槲皮素和異槲皮素微量；醇提后殘?jiān)?jīng)高壓水解得到醇提水解物，總黃酮含量為76.2%，其中，蘆丁、槲皮素和異槲皮素分別占60.6%、25.2%、13.5%；甜蕎麩皮水提物的主要成分為D-手性肌醇43.6%、肌醇2.9%。

胰脂肪酶、奧利司他、D-手性肌醇 美國Sigma公司；脂肪酶測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2儀器與設(shè)備

Shimadzu-UV2550型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；Inolab精密pH計(jì) 德國WTW公司；Polyscience恒溫水浴鍋美國Polyscience公司。

1.3方法

1.3.1胰脂肪酶溶液配制及其活力測定

稱取20 mg胰脂肪酶，溶于10 mL0.1 mol/L的KH2PO4-K2HPO4緩沖液（pH 7.4）中，酶用量為2 mg/mL或4×10-5mol/L。胰脂肪酶活力測定利用脂肪酶測定試劑盒[16]。胰脂肪酶活力單位定義為：在37℃、pH 7.4條件下，每克胰脂肪酶每分鐘分解1μmol三油酸甘油酯為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.2抑制劑與酶作用時(shí)間的確定

以醇提水解物為抑制劑，取4 mL、37 ℃預(yù)熱的底物溶液（由試劑盒提供的三油酸甘油酯），加入25μL4 mg/mL的醇提水解物和25μL2 mg/mL的胰脂肪酶溶液，立即混勻，測定不同反應(yīng)時(shí)間胰脂肪酶活性，計(jì)算抑制率。

1.3.2 節(jié)，反應(yīng)10 min，測定胰脂肪酶活性，計(jì)算抑制率。

1.3.3 蕎麥提取物對胰脂肪酶的影響

以不同質(zhì)量濃度的蕎麥麩皮提取物為抑制劑，方法同

1.3.4 醇提水解物抑制胰脂肪酶作用機(jī)理的確定

底物溶液、醇提水解物和胰脂肪酶按下列3 種順序加入：反應(yīng)體系1：底物溶液與醇提水解物混合后，加入胰脂肪酶溶液進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)體系2：底物溶液與胰脂肪酶混合后，加入醇提水解物進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)體系3：醇提水解物與胰脂肪酶混合后，再加入底物溶液進(jìn)行反應(yīng)。分別測定不同加入順序的脂肪酶活力，計(jì)算抑制率。

1.4抑制率計(jì)算

式中：A1、A2、A3、A4分別為無抑制劑組（酶和底物）、空白組（只有底物）、加抑制劑組（酶、底物和抑制劑）和對照組（抑制劑和底物）在420 nm波長處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1抑制劑與酶作用時(shí)間的確定

圖1 反應(yīng)時(shí)間對抑制作用的影響Fig.1 Effect of reaction time on the inhibitory rate of lipase

由圖1可知，在0～10 min范圍內(nèi)醇提水解物對胰脂肪酶的抑制率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而逐漸增大，到10 min時(shí)抑制率達(dá)到最大值。隨后，抑制率略微下降、趨于穩(wěn)定。這表明在反應(yīng)10 min時(shí)，醇提水解物對胰脂肪酶的抑制作用最大，繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間抑制效應(yīng)也不會增強(qiáng)?？梢妼?shí)驗(yàn)的最佳反應(yīng)時(shí)間為10 min。

圖2 醇提物、醇提水解物和奧利司他抑制胰脂肪酶活性的比較Fig.2 Inhibitory rates of pancreatic lipase by ethanol extract, hydrolysate and orlistat

圖3 水提物、D-手性肌醇抑制胰脂肪酶活性的比較Fig.3 Inhibitory rates of pancreatic lipase by water extract andD-chiro-inositol (DCI)

2.2蕎麥提取物對胰脂肪酶的影響由圖2、3可知，醇提物、醇提水解物、水提物對胰脂肪酶的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為2.53、1.94、

17.6 mg/mL。苦蕎醇提物經(jīng)高壓水解后，對胰脂肪酶的抑制作用略微增強(qiáng)，而作為目前市場上最成功的胰脂肪酶抑制劑——奧利司他在同樣實(shí)驗(yàn)條件下的IC50為0.47 mg/mL。對胰脂肪酶的抑制能力：奧利司他＞醇提水解物＞醇提物＞水提物。水提物和純品D-手性肌醇在低質(zhì)量濃度下抑制效果不明顯，在較高的質(zhì)量濃度下則表現(xiàn)出抑制活性。這一結(jié)果說明蕎麥提取物對胰脂肪酶的抑制作用主要是通過蕎麥黃酮來實(shí)現(xiàn)的，而蕎麥糖醇及其降解產(chǎn)物D-手性肌醇對胰脂肪酶的抑制作用較微弱。故推測D-手性肌醇可能是通過其他途徑來實(shí)現(xiàn)其降脂作用。

2.3 醇提水解物抑制胰脂肪酶作用機(jī)理的確定

圖4 反應(yīng)物加入順序?qū)σ种谱饔玫挠绊慒ig.4 Effect of the order of addition of reactants on the inhibitory rate of lipase

由圖4可知，反應(yīng)體系1對胰脂肪酶的抑制率最高，反應(yīng)體系3次之，反應(yīng)體系2最小。這表明蕎麥醇提水解物對胰脂肪酶的抑制作用主要是通過苦蕎黃酮與底物相互作用，從而阻礙了底物與酶的作用，屬于競爭性抑制作用。

3 討論與結(jié)論

蕎麥麩皮作為蕎麥面粉加工過程中的副產(chǎn)品，一般用于畜禽飼料。蕎麥麩皮占籽粒干質(zhì)量的11.5%～24%，且富含多種功能成分；苦蕎麩皮總黃酮含量約7.7%[17]，是種子含量的4～8 倍；甜蕎麩皮富含蕎麥糖醇，在人體內(nèi)可被降解為D-手性肌醇。蕎麥被譽(yù)為“五谷之王”，三降食品（降血壓、降血糖、降血脂），因此，多食蕎麥麩皮對人體有很大的益處。但由于麩皮直接食用口感差、不易消化、功能成分不能發(fā)揮其有效的作用，故提取蕎麥麩皮有效成分、開發(fā)功能食品和藥品具有重要的應(yīng)用前景。

目前，對黃酮成分降血脂作用的研究較多，但對其降脂機(jī)理的研究較少。大黃柳葉黃酮提取物能夠抑制高脂飼料引起的小鼠肥胖和脂肪肝，但無抑制胰脂肪酶活性的作用[13]；槐角總黃酮對高脂血癥大鼠脂代謝紊亂具有較好的調(diào)節(jié)作用[18]；玳玳果黃酮滴丸對大鼠高脂血癥有明顯的預(yù)防作用，并能夠阻止高脂血癥大鼠的肝臟脂肪變性[19]；苦蕎黃酮亦有明顯的降血脂作用[20]。本研究證明苦蕎黃酮（醇提物和醇提水解物）具有抑制胰脂肪酶的能力；且經(jīng)高壓水解后，部分蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素和異槲皮素，更有利于其提高抑制活性。盡管如此，醇提水解物的抑制活性最高也只達(dá)到82%，遠(yuǎn)低于奧利司他100%的最高抑制活性，但抑制率未達(dá)極限，也可能是天然提取物較安全的一個(gè)原因。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明，苦蕎黃酮并不直接與胰脂肪酶作用，主要是與底物結(jié)合阻礙底物與酶的結(jié)合來達(dá)到抑制作用。

D-手性肌醇是一種胰島素受體的促敏劑，能夠消除周圍組織對胰島素的抵抗，從根本上調(diào)節(jié)機(jī)體的生理機(jī)能和代謝平衡，從而對糖尿病及其并發(fā)癥有顯著療效[21]。目前，D-手性肌醇和蕎麥糖醇是否具有降脂功能鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果表明，蕎麩糖醇（水提物）和純品D-手性肌醇在低質(zhì)量濃度下抑制胰脂肪酶效果不明顯，在較高的質(zhì)量濃度下則表現(xiàn)出抑制活性。這說明甜蕎麩皮的水提物抑制肥胖可能是通過D-手性肌醇有效地促進(jìn)胰島素的功能，來實(shí)現(xiàn)降低血糖、血甘油三酯水平等。

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Inhibitory Effect of Flavonoids and Fagopyritols from Buckwheat on Pancreatic Lipase

YANG Peng, LI Yanqin*
(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Objective: To understand the inhibitory activity of bioactive components in buckwheat bran on pancreatic lipase, which can provide evidence to explain its mechanism for lowing serum lipids. Methods: Ethanol extract of buckwheat bran (mainly containing rutin) and high-pressure hydrolysate of the residue left after ethanol extraction (a mixture of quercetin, isoquercetin and rutin) were obtained from tartary buckwheat bran, while water extract (mainly consisting of fagopyritols) was prepared from common buckwheat bran for evaluation of their inhibitory activity on pancreatic lipase in comparison with the lipase inhibitor orlistat. The mechanism of the hydrolysate for inhibiting pancreatic lipase was investigated by examining the effect of the order of addition of substrate, inhibitor and enzyme on the inhibitory activity. Results: The sequence of inhibitory activity toward pancreatic lipase was orlistat ＞ hydrolysate ＞ ethanol extract ＞ water extract, with IC50values of 0.47, 1.94, 2.53 and 17.6 mg/mL, respectively. The inhibitory mechanism of the hydrolysate on pancreatic lipase belonged to the competitive type, which was mainly associated with the presence of flavonoids interacting with the substrate to block its interaction with the lipase. Conclusion: Buckwheat flavonoids present in the ethanol extract and the hydrolysate exert inhibitory effects on pancreatic lipase, especially those of the latter. Buckwheat fagopyritols in the water extract from common buckwheat bran show no inhibitory effect on pancreatic lipase at a low concentration, but can inhibit this enzyme at a high concentration.

buckwheat flavonoids; buckwheat fagopyritols; rutin; quercetin; isoquercetin; pancreatic lipase; inhibitor

TS201.2

A

1002-6630（2015）11-0060-04

10.7506/spkx1002-6630-201511012

2014-06-30

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20120311006-1）

楊鵬（1986—），男，碩士，研究方向?yàn)橹参锕δ艹煞珠_發(fā)。E-mail：peng114011@163.com

*通信作者：李艷琴（1960—），女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)橹参锕δ艹煞珠_發(fā)，微生物生態(tài)。E-mail：yanqin@sxu.edu.cn