血管緊張素Ⅱ及貝那普利對(duì)肝星狀細(xì)胞ACE2和Ang-(1－7)/Mas受體的影響

王麗華，申鳳俊，許小妹(山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科，太原 030001;通訊作者，E-mail:sfj919016603@126．com)

局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)與肝纖維化密切相關(guān)，經(jīng)典的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)-AngⅡ-血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)軸可促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是該軸的核心效應(yīng)分子［1］。近來(lái)發(fā)現(xiàn)體內(nèi)RAS系統(tǒng)存在經(jīng)典途徑以外的第二條代謝通路，即由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)、血管緊張素 1-7(angiotensin 1-7，Ang1-7)、Mas受體組成的ACE2-Ang-(1-7)-Mas受體軸，此條通路通過(guò) ACE2生成 Ang-(1-7)，Ang-(1-7)作用于Mas受體發(fā)揮抗肝纖維化的生物學(xué)效應(yīng)［2］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)AngⅡ及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑貝那普利對(duì)體外培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞中ACE2、Mas受體的表達(dá)以及細(xì)胞上清液中Ang-(1-7)影響的研究，有望對(duì)臨床肝纖維化的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞株及主要試劑

大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)引自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。Ang-(1-7)酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司;ACE2即用型SABC免疫組化試劑盒、ACE2兔抗大鼠多克隆抗體、隨機(jī)引物、dNTP、ROX(FastStart Universal SYBR Green Master)、引物、Buffer、RNA 酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶均購(gòu)自上海生工生物科技有限公司;AngⅡ?yàn)榧獱柹虾Ｓ邢薰井a(chǎn)品;貝那普利由北京諾華制藥有限公司提供。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)方法及實(shí)驗(yàn)分組

在37℃，5%CO2條件下將大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)培養(yǎng)于含10%胎牛牛血清，100 U/ml青霉素/鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，每周傳代2-3次，選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6接種于6孔板蓋玻片上，融合75%左右棄舊培養(yǎng)液，換成不含血清和抗生素的培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組為:正常對(duì)照組(不添加試劑)、AngⅡ處理組(加1 μmol/L AngⅡ)、AngⅡ +貝那普利組(提前1 h加入 1 μmol/L 貝那普利，再加 1 μmol/L AngⅡ)、貝那普利組(加1 μmol/L貝那普利)，分組處理后在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后收集細(xì)胞、細(xì)胞爬片，并提取細(xì)胞上清液。

1．3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)ACE2的表達(dá)

按照ACE2即用型SABC免疫組化試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。固定細(xì)胞爬片、滅活內(nèi)源性酶、熱修復(fù)抗原、滴加封閉液。滴加一抗(濃度為 1∶100的ACE2)，4℃冰箱中過(guò)夜，PBS液沖洗。滴加生物素化二抗工作液(山羊抗兔IgG)，37℃冰箱中孵育20 min，PBS液沖洗。滴加SABC試劑，溫度為37℃冰箱中放置20 min，PBS液沖洗。DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，光鏡下觀察染色結(jié)果。

1．4 上清液中Ang-(1-7)含量的測(cè)定

雙抗夾心ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ang-(1-7)含量。按照Ang-(1-7)ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)出吸光值，應(yīng)用軟件根據(jù)樣品吸光值計(jì)算出相應(yīng)Ang-(1-7)含量。

1．5 RT-PCR檢測(cè)肝星狀細(xì)胞ACE2和Mas受體mRNA的表達(dá)

用Trizol法抽提HSC細(xì)胞總RNA，測(cè)定A260和A280，保證比值在1．8-2．0之間，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。內(nèi)參beta-actin上游:5＇-GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3＇;下游:5＇-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT-3＇，產(chǎn)物長(zhǎng)度為147 bp。ACE2 上游:5＇-GCTAAACATGATGG CCCA CT-3＇;下游:5＇-CCC ACAGTCGAATTCCTGTT-3＇，產(chǎn)物長(zhǎng)度為 218 bp。Mas受體上游:5＇-CTCTCGGCTTTGTGGAGAAC-3＇;下游 5＇-GGCCTGTGT TGTAGCCA AAT-3＇，產(chǎn)物長(zhǎng)度為228 bp。RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)系統(tǒng)依據(jù)上海生工生物科技有限公司說(shuō)明步驟進(jìn)行。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 ACE2的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

各組細(xì)胞均可見(jiàn)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒沉積，呈ACE2陽(yáng)性表達(dá)，但程度有所不同。采用標(biāo)準(zhǔn)型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)圖像彩色分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像半定量分析，測(cè)定肝組織中棕黃色陽(yáng)性表達(dá)顆粒的平均灰度值，該值越低表達(dá)越強(qiáng)。分析結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，AngⅡ處理組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有較強(qiáng)的陽(yáng)性染色。貝那普利+AngⅡ處理組ACE2的表達(dá)較單獨(dú)AngⅡ處理組進(jìn)一步增加(P＜0．05，見(jiàn)表1)。

表1 ACE2的免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖像分析結(jié)果(±s)Table 1 Results of immunohistochemical staining of ACE2(±s)

表1 ACE2的免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖像分析結(jié)果(±s)Table 1 Results of immunohistochemical staining of ACE2(±s)

與對(duì)照組比較，△P ＜0．05;與 AngⅡ組比較，*P ＜0．05

組別 n ACE2對(duì)照組3 176．611 ±5．744 AngⅡ組 3 146．722 ±8．649△AngⅡ +貝那普利組 3 135．972 ±9．838*貝那普利組3 172．583 ±6．104

2．2 貝那普利對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞合成分泌Ang-(1-7)的影響

細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ang-(1-7)的含量，單獨(dú)AngⅡ處理組高于對(duì)照組(P＜0．05)，貝那普利+AngⅡ處理組較單獨(dú)AngⅡ處理組Ang-(1-7)增加(P ＜0．05，見(jiàn)表 2)。

表2 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ang-(1－7)的含量(±s)Table 2 Levels of Ang-(1－7)in cell culture supernatant(±s)

表2 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ang-(1－7)的含量(±s)Table 2 Levels of Ang-(1－7)in cell culture supernatant(±s)

與對(duì)照組比較，△P ＜0．05;與 AngⅡ組比較，*P ＜0．05

組別 n Ang-(1-7)(ng/mL)3 6．56 ±1．34 AngⅡ組 3 14．23 ±2．25△AngⅡ +貝那普利組 3 23．43 ±3．25*貝那普利組對(duì)照組3 10．31 ±2．94

2．3 貝那普利對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞ACE2、Mas受體mRNA的影響

各組細(xì)胞均有ACE2、Mas受體mRNA的表達(dá)，但程度有所不同。采用RT-PCR的方法進(jìn)行熒光定量分析。結(jié)果顯示:AngⅡ處理組與正常對(duì)照組相比較，其表達(dá)ACE2、Mas受體mRNA的表達(dá)升高(P ＜0．05)，貝那普利 +AngⅡ處理組 ACE2、Mas受體mRNA的表達(dá)較單獨(dú)AngⅡ處理組進(jìn)一步增加(P ＜0．05，見(jiàn)表 3)。

表3 肝星狀細(xì)胞中ACE2、MasmRNA的含量(±s)Table 3 Levels of ACE2 and Mas mRNA in hepatic stellate cells(±s)

表3 肝星狀細(xì)胞中ACE2、MasmRNA的含量(±s)Table 3 Levels of ACE2 and Mas mRNA in hepatic stellate cells(±s)

與對(duì)照組比較，△P ＜0．05;與 AngⅡ組比較，*P ＜0．05

組別 n ACE2/Beta-actin Mas受體/Beta-actin對(duì)照組3 1．461 4 ±0．449 4 1．533 8 ±0．531 5 AngⅡ組 3 3．701 6 ±1．267 4△ 4．752 2 ±0．703 3△AngⅡ +貝那普利 3 6．557 5 ±2．379 3* 8．397 9 ±1．139 4*貝那普利組3 1．504 2 ±0．470 0 2．504 6 ±0．334 8

3 討論

正常情況下肝星狀細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，在病毒、酒精、免疫等致病因素作用下肝臟受損，肝星狀細(xì)胞被激活，活化后的肝星狀細(xì)胞能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，使肝臟內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(特別是膠原物質(zhì))過(guò)度沉積，使細(xì)胞外基質(zhì)的合成大于降解［3］。因此，肝星狀細(xì)胞的激活是肝纖維化發(fā)生過(guò)程中的重要事件。

近幾十年來(lái)，隨著對(duì)RAS系統(tǒng)的研究，人們意識(shí)到肝臟局部存在RAS系統(tǒng)，并且其與肝纖維化形成密切相關(guān)。經(jīng)典的ACE-AngⅡ-AT1R軸可促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展，AngⅡ是該軸的核心效應(yīng)分子，它能刺激肝星狀細(xì)胞增殖與活化，并能釋放炎癥因子以及促纖維化因子［4］，同時(shí)能誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)及抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過(guò)度沉積，促使肝纖維化發(fā)生發(fā)展。

近來(lái)發(fā)現(xiàn)體內(nèi)RAS系統(tǒng)存在經(jīng)典途徑以外的第二條代謝通路，此條通路通過(guò)ACE2生成Ang-(1-7)，后者與其特異性受體Mas結(jié)合，形成ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸。由于Ang-(1-7)在體內(nèi)外有著與AngⅡ相拮抗的生物學(xué)效應(yīng)，具有舒張血管、降低血壓、利尿、抑制肥大、抑制成纖維細(xì)胞增殖等作用。所以它被理解為是一種內(nèi)源性的AngⅡ阻斷劑［5，6］，因此新的代謝通路與傳統(tǒng)的 RAS通路在功能上相拮抗。

既往我們?cè)谒穆然颊T導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型研究中證實(shí)，隨著大鼠肝纖維化的加重，模型組ACE2表達(dá)增加，血漿Ang(1-7)升高，而在應(yīng)用ACEI(貝那普利)治療組肝臟ACE2表達(dá)增加，血漿Ang(1-7)水平明顯升高，從而證實(shí)貝那普利可激活A(yù)CE2-Ang(1-7)-Mas受體軸，促進(jìn)Ang(1-7)生成增多［7］，而發(fā)揮其抗纖維化的作用。同時(shí)體外培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)證實(shí)AngⅡ可引起肝星狀細(xì)胞的增殖及膠原和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1mRNA表達(dá)，而ARB(纈沙坦)可抑制AngⅡ引起的細(xì)胞增殖，同時(shí)可明顯降低AngⅡ引起的肝星狀細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的增加，進(jìn)一步說(shuō)明AngⅡ參與了肝纖維化的過(guò)程［8］。但體外探究ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸與肝星狀細(xì)胞的關(guān)系的研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞，檢測(cè)其ACE2表達(dá)及其上清液中Ang-(1-7)的合成，并從基因水平探索肝星狀細(xì)胞是否有ACE2和Mas受體mRNA的表達(dá)及貝那普利對(duì)它們的影響，進(jìn)一步探究ACE2-Ang(1-7)-Mas軸與肝纖維化的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在靜止的肝星狀細(xì)胞中存在ACE2的表達(dá)，同時(shí)肝星狀細(xì)胞合成并分泌Ang-(1-7)，并且均有ACE2和Mas受體mRNA的表達(dá)，但量均較少。加入AngⅡ處理后能夠促使肝星狀細(xì)胞激活，活化后的肝星狀細(xì)胞中ACE2、Ang-(1-7)的合成及ACE2和Mas受體mRNA的表達(dá)均較對(duì)照組增加，而在加入ACEI類藥物貝那普利后表達(dá)進(jìn)一步增加，與此前Huang等［9］的研究一致。ACE2表達(dá)增多伴隨著Ang-(1-7)合成也增加，提示ACE2過(guò)量表達(dá)促進(jìn)了Ang-(1-7)的形成，而Ang-(1-7)通過(guò)與受體Mas結(jié)合后，發(fā)揮對(duì)肝纖維化的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)表明，AngⅡ促使肝星狀細(xì)胞激活，活化的肝星狀細(xì)胞對(duì)Ang-(1-7)的合成增加，而ACEI類藥促使激活的肝星狀細(xì)胞Ang-(1-7)含量進(jìn)一步增加，原因?yàn)锳CE2的過(guò)量表達(dá)促進(jìn)了Ang-(1-7)形成，與此同時(shí)Ang-(1-7)可被ACE降解為無(wú)活性的Ang-(1-5)，而貝那普利可抑制ACE，進(jìn)而阻止Ang-(1-7)的降解，從而增加其濃度［10］。既往四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型研究證實(shí)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑貝那普利可使大鼠肝纖維化程度明顯減輕［11］，本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)細(xì)胞，得出貝那普利可使激活的肝星狀細(xì)胞ACE2、ACE2mRNA、MasmRNA及細(xì)胞上清液中的Ang-(1-7)表達(dá)增加，進(jìn)一步證實(shí)上調(diào)的ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸對(duì)肝纖維化有保護(hù)作用。因此，研究上調(diào)ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸各組分的藥物可能成為肝纖維化以及肝硬化治療的重要思路。

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