紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架多糖成分的分離純化

林清強(qiáng)，石穎嵐，李 瓊，蔡 釩，王正朝

（福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108）

紅色諾卡氏菌 (Nocardiarubra)是一種放線菌，是目前所發(fā)現(xiàn)具有最強(qiáng)細(xì)胞毒活性和免疫促進(jìn)作用的一種微生物.因為一方面紅色諾卡氏菌具有最強(qiáng)細(xì)胞毒活性，說明這種微生物對腫瘤細(xì)胞有最強(qiáng)的毒性，可以直接殺滅腫瘤細(xì)胞；另一方面具有免疫促進(jìn)作用，說明這種微生物可以調(diào)節(jié)并增強(qiáng)機(jī)體的免疫力.研究表明[1]:紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架（以下簡稱N—CWS）,在增強(qiáng)體內(nèi)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活性的同時，還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生LAK細(xì)胞等,產(chǎn)生抗癌作用,有效地抑制腫瘤生長.所以N-CWS已經(jīng)成為治療腫瘤的有效制劑.它具有提高機(jī)體內(nèi)T輔助性細(xì)胞和殺傷細(xì)胞的功能,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的免疫活性，抑制腫瘤和增強(qiáng)免疫能力的功效.其主要有效成分為[2]霉菌酸，阿拉伯半乳糖，粘肽.由于N-CWS的組成復(fù)雜，使用過程仍然存在一定的副作用,其起主要作用的物質(zhì)不明確，影響了后續(xù)對其作用機(jī)制和藥用開發(fā).而有關(guān)N-CWS的多糖成分分離純化的報道較少，本文研究了N-CWS的多糖成分的提取及分離純化，為進(jìn)一步分析該產(chǎn)品中多糖的成分和結(jié)構(gòu)提供參考,為新藥的開發(fā)與制備提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

1.1.1 主要材料和試劑:

紅色諾卡氏菌 (由本實驗自行培養(yǎng)傳代提供)；SephadexG-100（為Pharmacia公司產(chǎn)品）；葡萄糖(廣東汕頭西隴化工廠產(chǎn)品，AR);苯酚(廣東汕頭西隴化工廠產(chǎn)品，AR);硫酸(廣東汕頭西隴化工廠產(chǎn)品，AR);阿拉伯糖(廣東汕頭西隴化工廠產(chǎn)品，AR);其他生化試劑均為分析純.

1.1.2 主要儀器

可見分光光度計（V-1100型，上海美譜達(dá)儀器有限公司）；電子天平（AL104，梅特勒-托利多儀器有限公司）；電熱恒溫振蕩水槽；微量離心機(jī)（TG16-W型）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-2型，上海陽光實驗儀器有限公司）；BT1-100恒流泵（上海琪特分析器有限公司）；BSZ-100A自動部分收集器（上海琪特分析器有限公司）；凝膠層析柱（1.7㎝×20.5㎝為Pharmacia公司產(chǎn)品）；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī).

1.2 實驗方法

1.2.1 紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架的制備

紅色諾卡氏菌經(jīng)菌體培養(yǎng),菌體破碎，蛋白酶處理，脫色及有機(jī)溶媒處理后即可獲得白色的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑[3].

1.2.2 多糖PS的提取

800 ugN-CWS樣品加入0.1mol/LHCl溶液酸解[4]，放于60℃的電熱箱內(nèi)孵育12h.16000r/min離心15min 后收集上清液并濃縮，加3倍體積的無水乙醇，混勻后靜置過夜使多糖充分沉淀，離心收集PS沉淀.

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[5]

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)阿拉伯糖50mg于500mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度.分別吸取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL阿拉伯糖溶液，各以水補(bǔ)至2.0mL，然后加入6%的苯酚溶液1.0mL，再加入濃硫酸5.0mL，迅速震蕩搖勻，置于25℃水浴30min，取出于490nm測光密度值，以2.0mL蒸餾水為空白對照，以阿拉伯糖微克數(shù)為橫座標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.4 樣品溶液的制備和含糖量的測定

將樣品加水至1.0mL,用移液器吸取樣品液100μL并補(bǔ)水至2.0mL，然后加入6%的苯酚溶液1.0mL，再加入濃硫酸5.0mL，迅速震蕩搖勻，置于25℃水浴30min，取出用V-1100型分光光度計于490nm測光密度值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其多糖含量.多糖得率計算：多糖得率=(多糖質(zhì)量／樣品質(zhì)量)X100%.

1.2.5 Sephadex G-100凝膠柱層析

裝柱:稱取5克Sephadex G-100,加入50ml去離子水，浸泡溶脹過夜.[6]將懸浮細(xì)顆粒,隨上層液體傾去之后,加入等體積的1.0mol/LNaOH浸泡并間歇攪拌2h傾去,用蒸餾水洗滌至中性,用1.0mol／L HCl溶液浸泡1h，用蒸餾水洗至中性，再用1.0mol／L NaOH溶液浸泡2h.最后用蒸餾水洗至pH中性，備用.采用上述處理過的Sephadex G-100凝膠裝柱.裝柱過程需將凝膠緩慢加入,不能出現(xiàn)斷層,紋路和氣泡,必須均勻,否則要重新裝柱.柱裝好后用3-5倍體積的緩沖液平衡層析柱,保持流速1.0ml/min,直至流出液與上柱緩沖液完全相同.

上樣:用移液器取樣品280μL,用玻棒引流沿管壁緩緩加入到凝膠床面上.樣品全部加入后，加入0.05mol/L pH=7.0 Tris-HCl洗脫液,小心清洗凝膠床界面表面，使黏附著的樣品全部洗入凝膠床,直到液面高出凝膠床面2-3cm.

洗脫:用0.05 mol/L pH=7.0 Tris-HCl緩沖液洗脫，調(diào)節(jié)好恒流泵的流速1.0ml/min，開始收集.每1min管收集1管，收集120管.用苯酚-硫酸法進(jìn)行跟蹤測定多糖,以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品PS含量測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

以苯酚-硫酸[7]為顯色劑，用比色法測定多糖含量.多糖類成分在濃硫酸作用下，先水解成單糖，單糖迅速脫水生成糠醛衍生物，糠醛與苯酚直接結(jié)合生成橙紅色衍生物，該衍生物在490nm處出現(xiàn)最大吸收值，記錄數(shù)據(jù)如表1，其吸收值與糖質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，樣品測定以標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算多糖含量.

表1 阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

圖1 阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 樣品的測定

取多糖樣品800ug，精密稱定，置1mL離心管中，加水稀釋至刻度，搖勻.提取前和提取后各精密量取樣品溶液100μL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法，制備樣品供試液.以阿拉伯糖為標(biāo)準(zhǔn),用苯酚-硫酸法,在490nm波長處測定OD值,以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其多糖總含量.結(jié)果見表2,結(jié)果樣品中多糖得率以阿拉伯糖含量計算.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，計算樣品多糖含量.為了消除單糖對測定的影響，本法在測定之前先用無水乙醇進(jìn)行沉淀處理，實驗表明，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出總糖量為16.15%.用鹽酸解離后經(jīng)沉淀處理后，提取的多糖含量5.12%.結(jié)果如表2,表明還有大部分多糖還未被鹽酸解離，提取出來的多糖占總糖的31.7%.

表2 多糖含量測定

2.2 Sephadex G-100凝膠柱層析分離

將提取的粗多糖溶液Sephadex G-100凝膠柱層析，上樣體積為280μL，洗脫曲線如圖2所示.從圖2可以看出.粗多糖經(jīng)凝膠柱層析洗脫可以得到8個峰.結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)Sephadex G一100的洗脫曲線峰太多，而且峰較密集，說明樣品中粗多糖成分復(fù)雜.因此洗脫柱填充材料和洗脫條件有待進(jìn)一步研究.

圖2 Sephadex G一100凝膠過濾柱層析洗脫曲線

從洗脫曲線上看，從10管到18管中出現(xiàn)的三個洗脫峰都比較密集說明有可能是分子量相近的多糖,35到38管出現(xiàn)兩個相連的洗脫峰分離效果較差表明這也是相似的多糖成分.從圖2來看，提取出來多糖的成分較為復(fù)雜，除了主要的阿拉伯糖和半乳糖之外還有其他的多糖.影響洗脫效果的因素主要有：凝膠孔徑，洗脫速度，洗脫濃度，柱長等.由于乙醇沉淀下來的多糖樣品一般含有少量的肽聚糖，類脂，蛋白質(zhì)等雜質(zhì).總之用Sephdex G-100純化的效果不是十分明顯，為了能夠?qū)ζ渖飳W(xué)活性和作用機(jī)制進(jìn)行后續(xù)研究,對該樣品進(jìn)行純度鑒定，分子量測定和組分分析等實驗.

3 討論

3.1 苯酚硫酸法測定

關(guān)于苯酚-硫酸法測定多糖含量原理是多糖在濃硫酸的作用下，先水解為單糖，迅速脫水形成糠醛衍生物，然后與苯酚縮合為有色化合物，在490nm處有特征吸收值.

根據(jù)已有文獻(xiàn)的報道[8-10],該實驗方法有所差異，主要區(qū)別在于是否加熱，關(guān)鍵操作為硫酸的添加方式，應(yīng)將濃硫酸垂直加入試管中，而不應(yīng)沿管壁加入，否則將會造成一定的誤差.因為反應(yīng)所需的溫度可以通過快速加入濃硫酸產(chǎn)生熱量達(dá)到,從而使多糖顯色充分.采用苯酚-硫酸法測定多糖含量時，不同單糖顯色產(chǎn)物之間的最大吸收波長與吸收值有所不同.因此，選擇合適物質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線也是實驗的關(guān)鍵.在現(xiàn)有的文獻(xiàn)報道中，該多糖的測定均以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn).而結(jié)構(gòu)分析表明N-CWS多糖的主要組成單糖是阿拉伯糖和半乳糖[5].阿拉伯糖和葡萄糖與N-CWS多糖的苯酚-硫酸法顯色產(chǎn)物的吸收光譜特征相比較，表明N－CWS多糖的吸收光譜與阿拉伯糖基本一致，而與葡萄糖有所差異.因此，實驗采用阿拉伯糖配制標(biāo)準(zhǔn)溶液測定N-CWS多糖，測定結(jié)果能比葡萄糖更準(zhǔn)確地反映其含量.

3.2 N-CWS中PS的提取方法

根據(jù)已有的文獻(xiàn)關(guān)于N-CWS中PS提取的報道較少,除了用鹽酸浸提多糖，酸解樣品使多糖和類脂，肽聚糖，脂肪酸，蛋白質(zhì)等物質(zhì)的化學(xué)鍵斷裂，還可以使用甲酰胺和容菌酶將細(xì)胞壁中的多糖解離出來，但是后兩者反應(yīng)激烈會將多糖水解成單糖，影響多糖生物學(xué)活性的后續(xù)研究.經(jīng)過本實驗，表明用鹽酸浸提的方法簡單方便，對多糖的化學(xué)鍵沒有造成斷裂，保持其生物學(xué)性質(zhì)以便進(jìn)一步研究分析作用機(jī)制.

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