江蘇省葫蘆科作物6種病毒的多重RT-PCR方法及應(yīng)用

任春梅， 程兆榜， 楊 柳， 繆 倩， 周益軍

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，江蘇 南京 210014)

葫蘆科作物是一種僅次于禾本科、豆科和茄科作物的世界性重要經(jīng)濟作物，主要分布于熱帶和亞熱帶［1-2］。與大田作物相比，該類作物類型多，品種雜，單品種面積小。葫蘆科作物病害中病毒病害的發(fā)生最為嚴重，國際病毒分類委員會(ICTV)發(fā)布的侵染葫蘆科作物的病毒達38個確定種和9個暫定種［3］。不僅病毒種類繁雜，株系眾多，而且不同病毒同時侵害引起的復合侵染現(xiàn)象普遍，病害發(fā)生年度間變化大，給防控和檢測都帶來很大難度［4］。

江蘇省自種植結(jié)構(gòu)調(diào)整發(fā)展高效農(nóng)業(yè)以來，蔬菜種植業(yè)發(fā)展迅速，目前復種面積已達1.3×105hm2以上(含西瓜甜瓜)，生產(chǎn)中病毒病是其主要病害問題之一。江蘇省葫蘆科作物病毒病原種類主要有 西 瓜 花 葉 病 毒［5］(Watermelon mosaic virus，WMV)、小西葫蘆黃花葉病毒［6］(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)、黃瓜花葉病毒［7］(Cucumber mosaic virus，CMV)和黃瓜綠斑駁病毒［8］(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)，煙草花葉病毒［9］(Tobacco mosaic virus，TMV)和番木瓜環(huán)斑病毒［10］(Papaya ringspot virus，PRSV)偶有發(fā)生，在田間常發(fā)生復合感染現(xiàn)象。針對這一具體情況，開發(fā)簡便、快捷、穩(wěn)定、實用以及能夠同時檢測多個病毒的技術(shù)用于生產(chǎn)上病毒病害發(fā)生動態(tài)的監(jiān)測，對于葫蘆科作物病毒病防控至關(guān)重要。

多重RT-PCR檢測技術(shù)最早由Chamberian等［11］于1988年提出，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生命科學各個領(lǐng)域，在植物病毒病的檢測中也已成為一種重要的檢測手段［12-16］。與其他檢測方法(生物學、血清學、電鏡觀察、單重 RT-PCR、核酸雜交等［17］)相比，多重RT-PCR檢測技術(shù)具有諸多優(yōu)點，它能在同一個PCR體系中同時擴增多個目的基因，省時，省力，效率高，特別是節(jié)省昂貴的實驗試劑和珍貴的實驗材料。由于葫蘆科病毒病的病原多，感染情況復雜，針對單一病毒的檢測方法已遠遠不能滿足檢測工作的需求，所以國內(nèi)外已有一些此類病毒的多重RTPCR檢測報道。王威麟等［18］針對西瓜上普遍發(fā)生的ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV 5種病毒建立了一步RT-PCR檢測方法;趙麗等［19］建立了一種同時檢測葫蘆科作物3種主要病毒ZYMV、WMV和CMV的多重RT-PCR方法;Kwon等［20］用2個多重PCR系統(tǒng)檢測侵染韓國葫蘆科作物的7種病毒。根據(jù)前人的研究結(jié)果，本試驗針對江蘇省葫蘆科作物病毒病發(fā)生的種類和特點，建立一種適用于江蘇省葫蘆科作物病毒病檢測的多重RT-PCR方法，并對江蘇省各地采集的樣品進行檢測應(yīng)用，以期為江蘇省葫蘆科作物病毒病害的發(fā)生動態(tài)進行長期有效的監(jiān)測，從而有針對性地采取防控措施。

1 材料與方法

1.1 毒源和試劑

WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV 和 PRSV 6種病毒的分離物于2012-2014年從江蘇省南京市、鹽城市鹽都區(qū)、徐州市、洪澤縣、淮安市等地發(fā)病的甜瓜、西葫蘆、西瓜、南瓜等上采集，通過6種病毒的血清學診斷試劑盒(Agdia公司)找到6種病毒單獨侵染的樣品，并在西葫蘆上接種繁殖，樣品保存于-70℃冰箱中?？?RNA提取試劑 Trizol購自Invitrogen公司，Taq DNA 聚合酶、dNTP、BamHⅠ、SalⅠ購自大連寶生物公司，反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、RNA酶抑制劑購自Promega公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、大腸桿菌(E.coli DH5ɑ)感受態(tài)細胞、pMD18-T載體購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 總RNA提取

在單重RT-PCR中，分別稱取各病毒單獨侵染葉片0.1 g;在多重RT-PCR中，分別稱取等量單獨侵染6種病毒的葉片，WMV、ZYMV、CMV和CGMMV 4種葉片充分混合(標記為H4)，TMV和PRSV 2種葉片充分混合(標記為H2)，H4、H2各取0.1 g。單重和多重RT-PCR中，都以健康西葫蘆葉片為陰性對照(標記為CK)，也取0.1 g。葉片在冰浴條件下迅速徹底研磨，然后用Trizol試劑盒按產(chǎn)品說明書提取總RNA。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上登錄的各病毒相對保守基因的序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計各病毒特異性引物。引物設(shè)計完成后，通過NCBI對其特異性進行鑒定，結(jié)果表明均具有良好的特異性(表1)。引物由上海英俊生物技術(shù)公司合成。

表1 多重RT-PCR擴增6種病毒的特異性引物Table 1 Specific primers for multiple RT-PCR detection of 6 viruses

1.4 單重RT-PCR

以 WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV 和 PRSV單一病毒的RNA為模版，oligodT18引物［21］反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA第一鏈，反應(yīng)程序參照 M-MLV說明書，15.0 μl 反應(yīng)體系為:3.0 μl RNA，1.0 μl oligodT18(10 μmol/L)，6.0 μl DEPC-ddH2O，65 ℃變性5 min，迅速置冰上5 min;再加入2.5 μl 5×RT buffer，0.5 μl dNTP( 各 2.5 mmol/L)，0.5 μl RNase Inhibitor(40 U/μl) 和 0.5 μl M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μl)，短暫離心后DEPC-ddH2O補足至 15.0 μl，42 ℃ 水浴 1 h，70 ℃ 滅活 5 min，置冰上待用。

25.00 μl PCR 標準反應(yīng)體系:15.75 μl ddH2O，2.50 μl 10 × PCR buffer(Mg2+free)，1.50 μl MgCl2(25 mmol/L)，2.00 μl dNTP Mixture(各 2.5 mmol/L)，1.00 μl上游和下游引物混合物(各 10 μmol/L)，0.25 μl r-Taq DNA 聚合酶(5 U/μl) 和2.00 μl cDNA模板。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性50 s，53℃退火50 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次;72℃延伸10 min。取5 μl PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)進行觀察分析。

1.5 多重RT-PCR及體系優(yōu)化

多重RT-PCR分4重和2重2個反應(yīng)。4重和2重RT反應(yīng)體系:加入混合提取的4種和2種病毒的總 RNA(H4 和 H2)各 3.0 μl，同時將 1.0 μl oligodT18的反轉(zhuǎn)錄引物加入同一反應(yīng)管中，其他條件與單重RT相同。多重PCR體系在上述25.0 μl單重PCR標準反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，4重PCR的4對引物混合物為4.00 μl［WMV和 CMV上下游引物各0.60 μl，ZYMV 和 CGMMV 上下游引物各 0.40 μl(各10 μmol/L)］，2重 PCR 的2對引物混合物為2.00 μl［TMV 和 PRSV 上下游引物各0.5 μl(各10 μmol/L)］，PCR反應(yīng)程序參數(shù)同上。取5 μl PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。

在有效mRT-PCR條件下，考察影響mPCR的主要因素，對某一因素進行考察時，其他因素不變。在試驗過程中對Taq DNA聚合酶濃度分別設(shè)0.02 U/μl、0.04 U/μl、0.06 U/μl、0.08 U/μl、0.10 U/μl和0.12 U/μl 6個處理，Mg2+濃度分別設(shè) 1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、3.0 mmol/L、4.0 mmol/L、5.0 mmol/L和6.0 mmol/L 6個處理，dNTPs濃度分別設(shè)0.10 mmol/L、0.25 mmol/L、0.40 mmol/L、0.55 mmol/L、0.70 mmol/L和 0.85 mmol/L 6 個處理，退火溫度分別設(shè)48℃、51℃、53℃、56℃、58℃和60℃，延伸時間分別設(shè)50 s、60 s、70 s、80 s、90 s和 100 s，循環(huán)次數(shù)設(shè)20、25、30、35、40 和45，進行多重 RTPCR體系優(yōu)化。

1.6 多重RT-PCR產(chǎn)物的克隆和測序

多重RT-PCR擴增DNA靶片段采用Axygen柱式膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)回收，回收DNA溶于30 μl的溶解液中?；厥债a(chǎn)物與pMD18-T載體連接(參照pMD18-T試劑盒說明書)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細胞，堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及酶切鑒定篩選重組質(zhì)粒。每個分離物挑選2個陽性克隆進行測序，測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.7 多重RT-PCR的靈敏度測定

取混合樣品H4和H2提取的病毒總RNA各5 μl，用BioPhotometer plus核酸蛋白檢測儀測定OD260和OD280，計算各自總RNA濃度。分別以100、10-1、10-2、10-3、10-4和 10-5的倍數(shù)進行稀釋，用建立的4重和2重RT-PCR方法進行檢測，觀察結(jié)果，分析2種多重RT-PCR方法檢測的靈敏度。

1.8 多重RT-PCR的檢測應(yīng)用

應(yīng)用建立的2種多重RT-PCR方法對2014年采自江蘇省13個市縣的210份葫蘆科作物發(fā)病樣品進行檢測，并隨機挑選15個樣品用單重RT-PCR方法進行驗證，分析江蘇省葫蘆科作物病毒病的種類及分布狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重RT-PCR的特異性

用單重、4重和2重RT-PCR法分別從6種病毒單獨侵染、4種病毒混合侵染(H4)、2種病毒混合侵染(H2)的組織中擴增出單一、4條或2條特異性目標條帶，大小約為390 bp、480 bp、670 bp、1 200 bp、330 bp和400 bp，擴增條帶的大小與待檢6種病毒基因預(yù)期條帶大小基本一致;陰性對照沒有擴增出任何條帶，且均未出現(xiàn)非特異性條帶(圖1)。結(jié)果表明:4重和2重RT-PCR具有較高的特異性，在 4重 RT-PCR中檢測到 CMV、WMV、CGMMV和 ZYMV，在2重 RT-PCR中檢測到TMV和PRSV，且兩步反應(yīng)中的各條帶大小間有差異，可以明顯地進行區(qū)分。

2.2 多重RT-PCR主要影響因素的優(yōu)化

2.2.1 多重RT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化 為了摸索出既高效又經(jīng)濟的多重RT-PCR擴增體系，在保證2個反應(yīng)體系中都有足夠量的r-Taq DNA聚合酶和dNTPs的基礎(chǔ)上，設(shè)置 dNTPs、r-Taq DNA聚合酶、Mg2+的濃度梯度。結(jié)果(圖2)表明:當dNTPs濃度在0.25～0.85 mmol/L時，4重和2重PCR都能產(chǎn)生較好的條帶;當r-Taq DNA聚合酶濃度為0.10～0.12 U/μl時，4重PCR能擴增出4條帶，2重PCR能擴增出2條帶，濃度越高條帶越亮;當Mg2+濃度達到3.0 mmol/L時，4重和2重PCR都能分別較好地擴增出4條和2條特異性條帶，隨濃度增加條帶變亮，但4重PCR中濃度增加到一定值后反而減弱了mRT-PCR的擴增效果。因此優(yōu)化后的4重和2重反應(yīng)體系各參數(shù)最終都確定為:dNTPs濃度0.25 mmol/L，r-Taq DNA 聚合酶濃度為 0.10 U/μl，Mg2+濃度3.0 mmol/L。

圖1 多重RT-PCR的特異性Fig.1 Specificity of multiple RT-PCR

2.2.2 多重RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 對4重和2重PCR的退火溫度、循環(huán)次數(shù)和延伸時間都進行了優(yōu)化。結(jié)果(圖3)顯示，4重PCR的退火溫度從53℃到58℃都能獲得理想的條帶，但61℃時擴增效果變?nèi)?循環(huán)數(shù)在 30～40次時擴增的條帶都較清晰，延伸時間80 s時PCR條帶的亮度最為合適。2重PCR的退火溫度從53℃到61℃時條帶都較為清晰;循環(huán)數(shù)25～35次時均能獲得特異而清晰的目的條帶;延伸時間從50 s到80 s均能同時出現(xiàn)2條帶，但在60s時條帶最清晰。因此最終確定多重RT-PCR反應(yīng)的條件為:4重PCR的退火溫度為53℃，循環(huán)次數(shù)35次，延伸時間80 s;2重PCR的退火溫度為56℃，循環(huán)次數(shù)30次，延伸時間60 s。

圖2 多重RT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化Fig.2 Optimization for the reaction conditions of mRT-PCR

圖3 多重RT-PCR反應(yīng)條件參數(shù)的優(yōu)化Fig.3 Optimization for the reaction conditions of mRT-PCR

2.3 多重RT-PCR產(chǎn)物的序列分析

4重和2重RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)割膠回收，分別與pMD 18-T vector進行體外連接，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒測序。測序結(jié)果表明，ZYMV、WMV、CMV、CGMMV、TMV和PRSV的擴增產(chǎn)物序列分別由1 180、485、389、660、410 和325 個核苷酸組成，與設(shè)計的PCR產(chǎn)物大小相同，分別為ZYMV-cp基因、WMV-cp基因、CMV-復制酶基因、CGMMV-cp基因、TMV-cp基因和PRSV-cp基因的部分序列。序列同源性分析結(jié)果表明，所得序列與GenBank中參考序列的同源性分別達到98.25% 、99.01%、99.93%、98.22%、97.33%和99.32%，證明了2種多重RTPCR檢測結(jié)果的可靠性。

2.4 多重RT-PCR的靈敏度

經(jīng)核酸蛋白檢測儀測定H4和H2的RNA濃度分別為 35.60 μg/μl和 19.33 μg/μl。靈敏度檢測結(jié)果(圖4)顯示，4重RT-PCR中RNA稀釋倍數(shù)為10-2后有些病毒的條帶微弱或消失，這可能與組織中病毒含量的過低有關(guān)，所以能夠同時檢測到4條清晰條帶的最大稀釋倍數(shù)為10-2，也即該體系中4重RT-PCR的RNA檢測濃度為0.356 μg/μl;2重RT-PCR中RNA稀釋倍數(shù)為10-3時能夠同時檢測到2條清晰的條帶，所以該體系中2重RT-PCR的RNA檢測濃度為19.33 ng/μl。

圖4 2個多重RT-PCR的靈敏度Fig.4 The sensitivities of two mRT-PCR techniques

2.5 多重RT-PCR的檢測應(yīng)用

應(yīng)用建立的2種多重RT-PCR方法對采自江蘇省13個市縣210份葫蘆科作物病樣進行檢測。首先隨機選出15個病樣分別進行單重RT-PCR檢測，再進行2種多重RT-PCR檢測(圖5)。將檢測圖譜進行比較，結(jié)果顯示各樣品多重RT-PCR檢測結(jié)果與單重RT-PCR結(jié)果相一致，說明建立的2種多重RT-PCR方法可應(yīng)用于田間樣品的檢測。田間樣品檢測結(jié)果(表2)表明，210份檢測樣品中單獨侵染率僅為24.76%，復合侵染率達75.24%，其中有3個病樣為6種病毒的復合侵染。進一步分析發(fā)現(xiàn)江蘇省13個市縣葫蘆科作物病毒的種類以ZYMV和CGMMV為主，主要分布在西瓜、南瓜、葫蘆、甜瓜等作物上，WMV和CMV次之，主要分布在黃瓜、甜瓜、南瓜等作物上，TMV和PRSV只在極少數(shù)作物上檢測到，主要在絲瓜、南瓜等上。6種病毒沒有明顯的地域分布傾向，究其原因可能與這幾種病毒的傳播途徑有關(guān)。

表2 田間210份葫蘆科作物病樣多重RT-PCR檢測結(jié)果Table 2 Detection results of 210 naturally infected samples collected from fields by multiplex RT-PCR

圖5 多重RT-PCR的檢測應(yīng)用Fig.5 The detection of six viruses in Cucurbit crops by mRT-PCR

3 討論

江蘇省是農(nóng)業(yè)大省，近年來設(shè)施農(nóng)業(yè)迅猛發(fā)展，據(jù)統(tǒng)計近幾年江蘇省葫蘆科作物的種植面積每年穩(wěn)定在400 000 hm2左右，其中西瓜和甜瓜種植面積約130 000 hm2，已經(jīng)成為江蘇省農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，使病毒及其傳毒蚜蟲在棚內(nèi)順利越冬后，在早春即散布于棚外并大量復制和繁殖，從而導致病害的提前發(fā)生和生長季節(jié)早期病毒累積量的偏高，形成惡性循環(huán)。以上因素加大了病毒病的發(fā)生頻率，提高了流行風險，從而加重了病害。根據(jù)前期我們對江蘇省設(shè)施大棚中葫蘆科作物病毒病的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)4種主要病毒(ZYMV、WMV、CMV、CGMMV)對葫蘆科作物種植業(yè)造成的危害日趨嚴重，2種次要病毒(TMV和PRSV)的危害也不容忽視。本研究根據(jù)江蘇省葫蘆科作物生產(chǎn)上病毒病的發(fā)生情況，建立了能同時檢測這6種病毒的多重RT-PCR方法，在葫蘆科作物的栽培生產(chǎn)中，能夠既快速、準確，又簡便、經(jīng)濟地檢測出幼苗帶毒情況。對控制病害在田間的發(fā)生，減少經(jīng)濟損失，抗病篩選和病害流行預(yù)測具有十分重要的意義。

考慮到6種病毒的特點和數(shù)量，將其檢測分成2個RT-PCR反應(yīng)進行，一個PCR反應(yīng)中同時檢測4種主要病毒(WMV、ZYMV、CMV、CGMMV)，另一個RT-PCR反應(yīng)中同時檢測2種次要病毒(TMV和PRSV)。該方法的關(guān)鍵因素為特異性引物的選擇，首先使用DNAMAN5.0軟件，對GenBank中收錄的WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV 和 PRSV 病毒各株系、各區(qū)域分離物全基因組序列進行比對，確定病毒序列中相對保守區(qū)域，在選定的保守區(qū)域內(nèi)使用Oligo5.0軟件設(shè)計引物，再通過BLAST分析確保引物的特異性，還利用DNAStar 5.0對這6對引物進行了同源性、二級結(jié)構(gòu)分析，以避免2個多重RTPCR反應(yīng)引物之間形成復雜的二級結(jié)構(gòu)及引物二聚體而影響擴增效果，最終選擇了G+C含量為45% ～60%、退火溫度相近、擴增片段大小易區(qū)分的6對引物。在反轉(zhuǎn)錄中選擇了OligodT18作為其引物，此引物較為適合植物樣品RNA的反轉(zhuǎn)錄，能夠較為完整地保留cDNA基礎(chǔ)含量，特異性較高，而且只需一次反轉(zhuǎn)錄，大大節(jié)省了時間和實驗材料。在2個RT-PCR反應(yīng)中又整合優(yōu)化了各自體系所需的引物、Mg2+、DNA聚合酶、dNTPs濃度，以及退火溫度、延伸溫度和循環(huán)數(shù)，對各自PCR體系的靈敏度進行了測定，最終建立了6種病毒多重RT-PCR的方法。用此方法對江蘇的210份葫蘆科作物病樣進行檢測，結(jié)果顯示多重RT-PCR和單重RT-PCR檢測結(jié)果相當，充分說明了多重RT-PCR方法的實用性。跟蹤監(jiān)測2014年江蘇省設(shè)施大棚中葫蘆科作物的病毒種類，發(fā)現(xiàn)主要以種子傳播的CGMMV和ZYMV病毒為主，提示我們此病害的控制應(yīng)從源頭出發(fā)，對種子和幼苗進行早期檢測和處理，也體現(xiàn)了快捷、高效、低成本檢測方法研制的必要性。

本研究根據(jù)江蘇省生產(chǎn)上葫蘆科作物易受多種病毒復合侵染的特點，選擇性地對這些病毒進行了2種多重RT-PCR篩選鑒定，較之單一RT-PCR方法具有能節(jié)省時間、降低成本、提高效率等優(yōu)點。以往報道的5重及以上RT-PCR方法［12-16］在實際應(yīng)用過程中存在干擾因素多、靈敏度低和檢出率低等缺陷，本方法能夠減少污染和反應(yīng)中的影響因素，提高檢測靈敏度，大大降低漏檢幾率。在葫蘆科作物的生產(chǎn)上，本方法可實現(xiàn)對病毒病的早期診斷，實現(xiàn)實驗室內(nèi)對病毒病害種類的快速、高效、低成本、大批量檢測，對病害的流行預(yù)測預(yù)報具有十分重要的意義。

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