人血清白蛋白與氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的差異性識(shí)別研究

申剛義，高 妍，張愛芹，劉 佳，白 羽

(1．中央民族大學(xué) 中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081;2．中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081;3．中國科學(xué)院 化學(xué)研究所，北京 100190)

氨基酸作為構(gòu)筑生命物質(zhì)的基元分子之一，是最常見的一類手性物質(zhì)，其對(duì)映異構(gòu)體的手性識(shí)別是當(dāng)前化學(xué)、生物以及藥學(xué)等眾多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一［1－3］。氨基酸的手性識(shí)別方法主要有色譜法［4－6］、質(zhì)譜法［7－8］、X 射線衍射法等［9－10］。這些方法雖然優(yōu)勢(shì)明顯，但也存在不足。最為常用的手性色譜法通常需對(duì)氨基酸分子衍生化，而衍生基團(tuán)對(duì)手性識(shí)別造成的影響難以預(yù)測(cè)。更為主要的是這些方法只能檢測(cè)到手性識(shí)別的結(jié)果，而無法直觀獲取手性識(shí)別的動(dòng)力學(xué)信息。

相對(duì)于上述方法，表面等離子體共振(Surface plasmon resonance，SPR)技術(shù)作為近年發(fā)展起來的一種表面型傳感方法，具有免標(biāo)記、實(shí)時(shí)、快速等優(yōu)點(diǎn)，為動(dòng)態(tài)研究分子間相互作用提供了良好平臺(tái)［11］。國內(nèi)外眾多學(xué)者利用 SPR 技術(shù)開展了相關(guān)研究［12－16］，如 Fornstedt等［12－13］利用 SPR 技術(shù)開展了手性藥物與蛋白相互作用的研究。Chen等［13］構(gòu)筑了硫酸葡聚糖傳感膜，研究了其對(duì)D-和L-半胱氨酸手性作用的差異。金欽漢等［15］研究了D-和L-苯甘氨酸與兩種白蛋白的結(jié)合差異性。本課題組基于SPR技術(shù)，研究了牛血清白蛋白對(duì)色氨酸對(duì)映異構(gòu)體手性識(shí)別的動(dòng)力學(xué)行為［16］。

氨基酸在生物體內(nèi)的吸收路徑主要依靠血液。人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)作為人體血液含量最豐富的血漿蛋白，承擔(dān)著結(jié)合和運(yùn)輸氨基酸的作用。氨基酸對(duì)映異構(gòu)體與HSA結(jié)合能力的大小，直接影響到其在人體內(nèi)的生理作用。因此，研究HSA大分子與手性氨基酸小分子之間的相互作用具有重要意義。

本文以HSA作為手性識(shí)別主體分子，從19種手性氨基酸中選擇3種有紫外吸收(色氨酸(Try)、苯丙氨酸(Phe)、組氨酸(His))和2種無紫外吸收的(蛋氨酸(Met)、精氨酸(Arg))的氨基酸作為客體分子，利用SPR技術(shù)研究了它們相互作用過程中的動(dòng)力學(xué)行為，并對(duì)其識(shí)別機(jī)理進(jìn)行了簡(jiǎn)要探討。試圖將SPR技術(shù)發(fā)展為研究氨基酸手性識(shí)別作用的通用方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ProtenOn XPR36生物分子相互作用系統(tǒng)、GLH傳感芯片;氨基偶聯(lián)試劑盒:包括N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo－NHS)，N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，1 mol/L鹽酸乙醇胺(pH 8.5)和醋酸緩沖液;芯片再生試劑盒(BioRad公司):包括0.5%SDS，50 mmol/L NaOH，100 mmol/L HCl。HSA(純度＞96%，Sigma公司)。氨基酸對(duì)映異構(gòu)體(色譜純，上?；菖d生化試劑有限公司)。其余試劑均為分析純，購自北京化學(xué)試劑公司。運(yùn)行緩沖液(PBST)由濃度為10 mmol/L的Na3PO4和150 mmol/L的NaCl配制，加入0.005%吐溫20，用HCl調(diào)至pH 7.4，使用前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾。pH值由Sartorius PB－10 pH計(jì)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水系統(tǒng)(Millipore公司)提供的去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HSA在芯片上的固定 HSA固定步驟按照文獻(xiàn) ［16］進(jìn)行:①0.05 mol/L的Sulso－NHS和0.2 mol/L的EDC按體積比1∶1混合后，以25 μL/min的流速流過傳感芯片通道，時(shí)間200 s;②0.68 mg/mL的HSA醋酸緩沖溶液(pH 4.5)以25 μL/min的流速流過傳感芯片通道，時(shí)間200 s;③通入鹽酸乙醇胺進(jìn)行去活封閉;④通入緩沖液，除去非特異性吸附。第2個(gè)通道作為對(duì)照只進(jìn)行活化和封閉而不標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)溫度為25℃。固定后的HSA最終標(biāo)記量為19 kRU(千響應(yīng)單位)。

1.2.2 氨基酸樣品配制 實(shí)驗(yàn)所用氨基酸對(duì)映異構(gòu)體溶液由運(yùn)行緩沖液PBST配制。分析物最高濃度經(jīng)2倍倍比稀釋，得5個(gè)濃度梯度。另設(shè)置一個(gè)只有PBST的溶液作為空白對(duì)照。以Phe為例，L-，D-Phe兩種對(duì)映異構(gòu)體的最高濃度為40 mmol/L，可得6種濃度梯度:40，20，10，5，2.5，0 mmol/L。

1.2.3 相互作用 待傳感膜制備后，同種氨基酸構(gòu)型的6種濃度系列同時(shí)以30 μL/min流速流過HSA固定通道并與HSA作用，實(shí)時(shí)采集響應(yīng)信號(hào)，結(jié)合時(shí)間為150 s，解離100 s。上述實(shí)驗(yàn)在25℃進(jìn)行。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 利用ProtenOn Manager 2.1.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)算各種動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 HSA對(duì)5種氨基酸對(duì)映異構(gòu)體手性識(shí)別的動(dòng)力學(xué)研究

圖1為L(zhǎng)-Try，D-Try分別與HSA相互作用的動(dòng)態(tài)過程。從圖中可直觀看到，Try濃度越高，其響應(yīng)值或結(jié)合量越大;且曲線斜率越大，表明初始反應(yīng)速度越快。進(jìn)一步比較可發(fā)現(xiàn)，兩種異構(gòu)體在與HSA作用過程中存在明顯的動(dòng)力學(xué)差異。在結(jié)合起始階段，L-Try與HSA達(dá)到結(jié)合平衡所需時(shí)間約6 s(圖1A)，D-Try與HSA達(dá)到平衡的時(shí)間約10 s(圖1B)，L-Try與HSA的結(jié)合速度快于D-Try。結(jié)合平衡階段，L-Try與HSA的結(jié)合量明顯小于D-Try。以10 mmol/L為例，L-Try和 D-Try的響應(yīng)值分別為155 RU和178 RU。解離階段，L-Try與BSA解離曲線的斜率大于D-Try，表明其速度略快于D-Try。上述動(dòng)力學(xué)差異隨著樣品濃度的增加而更加明顯。

鑒于該實(shí)驗(yàn)中除了Try對(duì)映異構(gòu)體的空間構(gòu)型差異之外，其它條件完全一致，因此可以說明HSA與兩種對(duì)映異構(gòu)體相互作用的過程中產(chǎn)生了手性識(shí)別。

圖1 Try對(duì)映異構(gòu)體與HSA的動(dòng)態(tài)相互作用Fig.1 Kinetic analysis of interactions between HSA and Try enantiomer Try concentration(a→f):10，5，2.5，1.25，0.625，0 mmol/L;25 ℃

對(duì)比發(fā)現(xiàn)，結(jié)合快慢并不能反映結(jié)合量的大小。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期研究的BSA與Try手性識(shí)別的動(dòng)態(tài)過程基本相似［16］，唯一差別在于，HSA與Try作用達(dá)到平衡時(shí)的結(jié)合量小于BSA。這表明HSA和BSA對(duì)Try具有類似的手性識(shí)別機(jī)制:即HSA與L-Try為特異性作用，而與D-Try為非特異性作用。在低濃度下，Try與HSA之間主要以非特異性吸附為主，L-Try與HSA作用的動(dòng)力學(xué)行為與D-Try相比差別不大。而隨著濃度的增加，手性識(shí)別的特異性吸附逐漸明顯，導(dǎo)致L-Try，D-Try與HSA作用的動(dòng)力學(xué)差異增大。

圖2為L(zhǎng)-Phe，D-Phe分別與HSA相互作用的動(dòng)態(tài)過程。從圖中可以看出，與D-Phe相比，L-Phe與HSA的結(jié)合快，解離慢。類似于Try，在結(jié)合平衡階段，L-Phe與HSA的結(jié)合量也明顯小于D-Phe。這可能是由于Phe和Try同屬中性氨基酸，并且均含有疏水的芳香環(huán)，因此它們與HSA的相互作用顯示一定的相似性。

圖2 Phe對(duì)映異構(gòu)體與HSA的動(dòng)態(tài)相互作用Fig.2 Kinetic analysis of interactions between HSA and Phe enantiomer Phe concentration(a→f):40，20，10，5，2.5，0 mmol/L;25 ℃

圖3為L(zhǎng)-Met，D-Met分別與HSA相互作用的動(dòng)態(tài)過程。Met的結(jié)構(gòu)與前兩種氨基酸相比有明顯差別。與前兩種氨基酸不同，L-Met與HSA的結(jié)合與解離的速度均大于D-Met。而兩者達(dá)到平衡時(shí)的結(jié)合量基本相等。

圖3 Met對(duì)映異構(gòu)體與HSA的動(dòng)態(tài)相互作用Fig.3 Kinetic analysis of interactions between HSA and Met enantiomer Met concentration(a→f):100，50，25，12.5，6.25，0 mmol/L;25 ℃

研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，L-Arg，D-Arg分別與HSA相互作用的動(dòng)態(tài)過程不同于前幾種氨基酸，不僅L-Arg與HSA的結(jié)合速度及解離速度均明顯小于D-Arg，而且在結(jié)合平衡階段與HSA的結(jié)合量也明顯小于DArg。而對(duì)于His，其對(duì)映異構(gòu)體與HSA相互作用的動(dòng)態(tài)過程與Met基本類似。差別在于結(jié)合平衡階段，L-His與HSA的結(jié)合量大于D-His。

2.2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算

根據(jù)Langmuir等溫吸附模型，假設(shè)芯片表面雙分子反應(yīng)遵循假一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)公式［16］:

式中，A為分析物;B為結(jié)合在芯片上的蛋白;AB為芯片表面的結(jié)合物;ka是吸附過程的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，即結(jié)合速率常數(shù);kd是脫附過程的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，即解離速率常數(shù)。

其中R為結(jié)合物在時(shí)間t的響應(yīng)信號(hào);dR/dt為結(jié)合物響應(yīng)信號(hào)的變化速率;C為分析物濃度;Rmax為結(jié)合物的最大響應(yīng)信號(hào)(共振單位)。

根據(jù)公式，以不同濃度的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可計(jì)算出HSA對(duì)氨基酸相互作用的各種動(dòng)力學(xué)參數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表1所示。

表1 HSA和不同氨基酸對(duì)映異構(gòu)體結(jié)合的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)與親和力常數(shù)Table 1 Different parameters of interactions between amino acid and HSA at 25℃

由表1可知，對(duì)于結(jié)合速率常數(shù)(ka)，除Arg外，其余氨基酸的L-型均大于D-型。而對(duì)于解離速率常數(shù)kd，Try，Met，His是L-型大于D-型，Phe和Arg則是D-型大于L-型。雖然5種氨基酸的這兩個(gè)速率常數(shù)無統(tǒng)一規(guī)律，但在解離平衡常數(shù)KD或結(jié)合平衡常數(shù)KA上卻有著明確的一致性。且HSA和L-型氨基酸的KA與D-型的KA之比均大于1，即HSA與所有氨基酸的L-型的親和力均大于D-型。這表明HSA對(duì)氨基酸對(duì)映異構(gòu)體存在著手性識(shí)別作用，基于手性識(shí)別的差異性結(jié)合最終導(dǎo)致L-型氨基酸更易與HSA作用。還應(yīng)指出的是，雖然部分D-型氨基酸與HSA的結(jié)合量大于L-型，但并不影響親和力，這可能和氨基酸分子本身質(zhì)量，以及是否為特異性結(jié)合等有關(guān)［4］。

3 結(jié)論

本文利用SPR技術(shù)，實(shí)時(shí)研究了HSA與5種常見氨基酸對(duì)映異構(gòu)體相互作用的動(dòng)態(tài)過程。與其它方法相比，SPR方法不僅可以實(shí)時(shí)模擬生命體內(nèi)分子相互作用的整個(gè)動(dòng)力學(xué)過程，而且還可獲得真實(shí)可靠的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和熱力學(xué)信息。HSA對(duì)氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的差異性識(shí)別結(jié)果可為闡釋生命體主要選擇L-型氨基酸提供一定的依據(jù)。

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